Ana Jeemin Choi foi apoiada por uma bolsa do Programa de Doutorado Internacional Pasteur - Universidade de Paris (PPU).

Preparação de amostras de alta qualidade para análise genômica multioma 10X

<ol>
	<li>Clark, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=scNMT-seq+enables+joint+profiling+of+chromatin+accessibility+DNA+methylation+and+transcription+in+single+cells.">scNMT-seq enables joint profiling of chromatin accessibility DNA methylation and transcription in single cells.</a> Nature Communications. 9 (1), 781 (2018).</li><li>Lee, J., Hyeon, D. Y., Hwang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+multiomics:+technologies+and+data+analysis+methods.">Single-cell multiomics: technologies and data analysis methods.</a> Experimental &amp; Molecular Medicine. 52 (9), 1428-1442 (2020).</li><li>Cerrizuela, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+scNMT+protocol+for+multiomics+profiling+of+single+cells+from+mouse+brain+and+pancreatic+organoids.">High-throughput scNMT protocol for multiomics profiling of single cells from mouse brain and pancreatic organoids.</a> STAR Protocols. 3 (3), 101555 (2022).</li><li>Dimitriu, M. A., Lazar-Contes, I., Roszkowski, M., Mansuy, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+multiomics+techniques:+From+conception+to+applications.">Single-cell multiomics techniques: From conception to applications.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 854317 (2022).</li><li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+epitope+and+transcriptome+measurement+in+single+cells.">Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells.</a> Nature Methods. 14 (9), 865-868 (2017).</li><li>Cao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Joint profiling of chromatin accessibility and gene expression in thousands of single cells. 361 (6409), 1380-1385 (2018).</li><li>Narayanan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclei+Isolation+from+Fresh+Frozen+Brain+Tumors+for+Single-Nucleus+RNA-seq+and+ATAC-seq.Journal+of+Visualized+Experiments.">Nuclei Isolation from Fresh Frozen Brain Tumors for Single-Nucleus RNA-seq and ATAC-seq.Journal of Visualized Experiments.</a> JoVE. 162, 61542 (2020).</li><li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nucleus+transcriptomics+reveals+functional+compartmentalization+in+syncytial+skeletal+muscle+cells.">Single-nucleus transcriptomics reveals functional compartmentalization in syncytial skeletal muscle cells.</a> Nature Communications. 11 (1), 6375 (2020).</li><li>Santos, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction+and+sequencing+of+single+nuclei+from+murine+skeletal+muscles.">Extraction and sequencing of single nuclei from murine skeletal muscles.</a> STAR Protocols. 2 (3), 100694 (2021).</li><li>Safabakhsh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+nuclei+from+frozen+human+heart+tissue+for+single-nucleus+RNA+sequencing.">Isolating nuclei from frozen human heart tissue for single-nucleus RNA sequencing.</a> Current Protocols. 2 (7), (2022).</li><li>Lau, S. -. F., Cao, H., Fu, A. K. Y., Ip, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nucleus+transcriptome+analysis+reveals+dysregulation+of+angiogenic+endothelial+cells+and+neuroprotective+glia+in+Alzheimer's+disease.">Single-nucleus transcriptome analysis reveals dysregulation of angiogenic endothelial cells and neuroprotective glia in Alzheimer's disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (41), 25800-25809 (2020).</li><li>Armand, E. J., Li, J., Xie, F., Luo, C., Mukamel, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+sequencing+of+brain+cell+transcriptomes+and+epigenomes.">Single-cell sequencing of brain cell transcriptomes and epigenomes.</a> Neuron. 109 (1), 11-26 (2021).</li><li>Morabito, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-nucleus+chromatin+accessibility+and+transcriptomic+characterization+of+Alzheimer's+disease.">Single-nucleus chromatin accessibility and transcriptomic characterization of Alzheimer's disease.</a> Nature Genetics. 53 (8), 1143-1155 (2021).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+resolved+transcriptomics+reveals+genes+associated+with+the+vulnerability+of+middle+temporal+gyrus+in+Alzheimer's+disease.">Spatially resolved transcriptomics reveals genes associated with the vulnerability of middle temporal gyrus in Alzheimer's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 10 (1), (2022).</li><li>Paul, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+heterogeneity+and+lineage+commitment+in+myeloid+progenitors.">Transcriptional heterogeneity and lineage commitment in myeloid progenitors.</a> Cell. 163 (7), 1663-1677 (2015).</li><li>Kaufmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BCG+educates+hematopoietic+stem+cells+to+generate+protective+innate+immunity+against+tuberculosis.">BCG educates hematopoietic stem cells to generate protective innate immunity against tuberculosis.</a> Cell. 172 (1-2), 176-190 (2018).</li><li>Christ, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=diet+triggers+NLRP3-dependent+innate+immune+reprogramming.">diet triggers NLRP3-dependent innate immune reprogramming.</a> Cell. 172 (1-2), 162-175 (2018).</li><li>Moorlag, S. J. C. F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-Glucan+Induces+protective+trained+immunity+against+mycobacterium+tuberculosis+infection:+A+key+role+for+IL-1.">&#946;-Glucan Induces protective trained immunity against mycobacterium tuberculosis infection: A key role for IL-1.</a> Cell Reports. 31 (7), 107634 (2020).</li><li>de Laval, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C/EBP&#946;-dependent+epigenetic+memory+induces+trained+immunity+in+hematopoietic+stem+cells.">C/EBP&#946;-dependent epigenetic memory induces trained immunity in hematopoietic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 26 (5), 657-674 (2020).</li><li>Renthal, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+mosaic+Rett+syndrome+brain+tissue+by+single-nucleus+RNA+sequencing.">Characterization of human mosaic Rett syndrome brain tissue by single-nucleus RNA sequencing.</a> Nature Neuroscience. 21 (12), 1670-1679 (2018).</li><li>Yang, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+brain+vascular+atlas+reveals+diverse+mediators+of+Alzheimer's+risk.">A human brain vascular atlas reveals diverse mediators of Alzheimer's risk.</a> Nature. 603 (7903), 885-892 (2022).</li><li>Lee, D. R., Zhang, Y., Rhodes, C. T., Petros, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+single-cell+and+single-nuclei+suspensions+from+embryonic+and+adult+mouse+brains.">Generation of single-cell and single-nuclei suspensions from embryonic and adult mouse brains.</a> STAR Protocols. 4 (1), 101944 (2022).</li><li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-specific+and+single-cell+chromatin+accessibility+charts+human+hematopoiesis+and+leukemia+evolution.">Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution.</a> Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).</li><li>Ranzoni, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+single-cell+RNA-seq+and+ATAC-seq+analysis+of+human+developmental+hematopoiesis.">Integrative single-cell RNA-seq and ATAC-seq analysis of human developmental hematopoiesis.</a> Cell Stem Cell. 28 (3), 472-487 (2021).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=10X+Genomics+Chromium+Next+GEM+Single+Cell+Multiome+ATAC+++Gene+Expression+User+Guide.">10X Genomics Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression User Guide.</a> Document Number CG000338 Rev F. At. , (2022).</li><li>J, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdissection+of+mouse+brain+into+functionally+and+anatomically+different+regions.">Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. 168, 61941 (2021).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 10X Genomics 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX sequencing (CG000365 - Rev C). At. , (2022).</li><li>Haag, S., Murthy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+monocyte+and+macrophage+culture.">Murine monocyte and macrophage culture.</a> Bio-Protocol. 11 (6), (2021).</li><li>Haque, A., Engel, J., Teichmann, S. A., L&#246;nnberg, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+practical+guide+to+single-cell+RNA-sequencing+for+biomedical+research+and+clinical+applications.">A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications.</a> Genome Medicine. 9 (1), (2017).</li><li>Jiang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quality+control+of+single-cell+RNA-seq.">Quality control of single-cell RNA-seq.</a> Methods in Molecular Biology. , 1-9 (1935).</li><li>Regan, C., Preall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+considerations+for+single-cell+genomics.">Practical considerations for single-cell genomics.</a> Current Protocols. 2 (8), (2022).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 10X Genomics 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell ATAC Sequencing (CG000169 - Rev E). At. , (2022).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=10X+Genomics+10X+Genomics+Demonstrated+Protocol+-+Nuclei+Isolation+from+Complex+Tissues+for+Single+Cell+Multiome.">10X Genomics 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation from Complex Tissues for Single Cell Multiome.</a> ATAC + Gene Expression Sequencing. (CG000375 - Rev C). At. , (2022).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 10X Genomics 10X Genomics - Chromium Nuclei Isolation Kit (CG000505 - Rev A). AT. , (2022).</li><li>Shomroni, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+single-cell+RNA-sequencing+approach+and+its+applicability+connecting+genotype+to+phenotype+in+ageing+disease.">A novel single-cell RNA-sequencing approach and its applicability connecting genotype to phenotype in ageing disease.</a> Scientific Reports. 12 (1), 4091 (2022).</li><li>Oca&#241;as, S. R., Pham, K. D., Blankenship, H. E., Machalinski, A. H., Chucair-Elliott, A. J., Freeman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+the+ex+vivo+confounds+of+cell-isolation+techniques+on+transcriptomic+and+translatomic+profiles+of+purified+microglia.">Minimizing the ex vivo confounds of cell-isolation techniques on transcriptomic and translatomic profiles of purified microglia.</a> 9 (2), 0348-0321 (2022).</li><li>G&#233;rard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+single-cell+activity-based+screening+and+sequencing+of+antibodies+using+droplet+microfluidics.">High-throughput single-cell activity-based screening and sequencing of antibodies using droplet microfluidics.</a> Nature Biotechnology. 38 (6), 715-721 (2020).</li><li>Vandereyken, K., Sifrim, A., Thienpont, B., Voet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+and+applications+for+single-cell+and+spatial+multi-omics.">Methods and applications for single-cell and spatial multi-omics.</a> Nature Reviews. Genetics. 24, 494-515 (2023).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

A preparação de suspensão de células ou núcleos de alta qualidade é de importância crucial para o sucesso de análises multiômicas de RNA-Seq de célula única ou de núcleo único 29,30,31. Aqui, descrevemos protocolos de preparo de amostras e isolamento de núcleos para ensaios de multioma de dois tipos de tecido: cérebro e medula óssea.
O protocolo cerebral descrito neste trabalho permite a recuperação de núcleos de alta qualidade a partir de tecido cerebral fresco-congelado. Inclui as seguintes etapas: ruptura do tecido congelado, isolamento dos núcleos, purificação dos núcleos e controle de qualidade do material preparado. O tecido cerebral é composto por diversos tipos celulares, e o procedimento de dissociação tecidual e isolamento de núcleos deve preservar as proporções das populações celulares presentes no tecido inicial. Aqui, a composição do tampão de lise e o tempo de incubação foram otimizados para permitir a lise completa e suave de todas as populações celulares que compõem o tecido.
O protocolo de HSPCs de medula óssea é um pouco diferente, pois requer uma etapa adicional no início do experimento para isolar a população celular de interesse de uma suspensão celular heterogênea. Após a coleta do tecido fresco, as hemácias são lisadas e a amostra é enriquecida para o subconjunto celular de interesse. As células-alvo são lisadas, os núcleos são isolados e a qualidade do material preparado é controlada.
A 10X Genomics fornece vários protocolos validados para isolamento de núcleos em diversos tecidos 32,33. A empresa também comercializa um kit de isolamento de núcleos com uma tubulação simples para isolar núcleos de tecidos validados34. No entanto, esses protocolos necessitam de otimização adicional para adequar as particularidades de determinadas amostras. Um exemplo são as amostras que exigem trabalhar com baixa entrada de células. Para essas amostras, as etapas mais desafiadoras são as centrifugações que precisam ser suficientemente rigorosas para limpar a amostra e suaves o suficiente para evitar a perda de células/núcleos. Com o protocolo aqui descrito, adaptamos o 10X Genomics Demonstrated Protocol - Nuclei Isolation for Single Cell Multiome ATAC + GEX Sequencing (CG000365 - Rev C)27 para encontrar um equilíbrio fino entre esses dois requisitos. Como demonstrado no exemplo da preparação de núcleos a partir de HSPCs triados, melhoramos a recuperação de núcleos sem impacto na qualidade da amostra.
Um desafio adicional é a etapa de lise das células purificadas para isolamento dos núcleos. Condições de lise mais severas e tempos de incubação mais longos podem danificar os núcleos e, assim, afetar a qualidade dos dados de sequenciamento. A Figura 5 mostra imagens representativas de núcleos de amostras de medula óssea em diferentes tempos de incubação com tampão de lise e ilustra como o estado dos núcleos pode ser diferente dependendo da lise celular. No exemplo dos HSPCs, identificamos a lise de 3 min como a condição que resulta na maior proporção de núcleos intactos com aparência saudável e a menor proporção de núcleos danificados. Os tempos de incubação da lise devem ser otimizados para cada novo tipo de amostra.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65715/65715fig05.jpg"> Figura 5: Controle de qualidade dos núcleos por microscopia. São mostradas imagens representativas de campo brilhante de núcleos isolados da medula óssea de camundongos com (A) núcleos intactos e (B) danificados. Barra de escala 5 μm. As imagens foram obtidas com microscópio invertido, utilizando-se objetiva ELWD NA, 0,60 e zoom digital de 1,5x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/65715fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Ambos os protocolos detalhados neste trabalho baseiam-se na purificação de células-alvo ou núcleos por instrumentos FACS de alto rendimento. Esta etapa é de importância crucial para protocolos de preparação de células únicas/núcleos onde subconjuntos raros de células devem ser isolados de suspensões heterogêneas. Nestes, como no exemplo mostrado aqui para a classificação de HSPCs, um painel de citometria de fluxo de alta dimensão pode ser necessário para permitir o "gating" na população celular de interesse. A classificação é extremamente rápida e precisa, levando a mais de 95% de pureza dos subconjuntos de células classificadas. Essa abordagem expõe a suspensão celular a uma pressão de até 70 psi e, portanto, pode ser limitante para a triagem de células frágeis (por exemplo, células dendríticas, neutrófilos), uma vez que pode causar a ruptura de sua membrana celular. Nesses casos, soluções alternativas devem ser selecionadas para purificação celular, incluindo classificação magnética, aplicação de instrumentos de nova geração (por exemplo, CellenOne, Cellenion; MACSQuant Tyto, Miltenyi)35,36, ou sistemas baseados em gotículas (por exemplo, ODIN, Sensific)37. No entanto, a lenta velocidade de classificação dessas tecnologias, com a triagem celular que dura horas em vez de minutos, é um forte fator limitante para a aplicação dessas abordagens na preparação de células viáveis para o Multiome e outras aplicações unicelulares baseadas na análise de grandes números de células.
Para a purificação de núcleos isolados do tecido, o FACS é o método de escolha devido ao seu rendimento e à pureza do material isolado. Os núcleos não são sensíveis à pressão, e os isolados de tecido filtrado podem ser facilmente purificados através do classificador celular. Se o laboratório não estiver equipado com um instrumento FACS, existem outras alternativas, um pouco menos eficientes, mas suficientemente boas. Exemplos incluem ultracentrifugação ou o uso de pequenos equipamentos como o MARS (Applied Cell) que separa partículas com base em sua diferença de tamanho, usando ondas acústicas; Lavadora laminar CURIOX que utiliza propriedades hidrofóbicas de suspensões de células/núcleos; ou LEVITAS bio que se baseia em propriedades físicas das células (levitação) para separá-las dos detritos.
Aqui, descrevemos protocolos para obtenção de um alto número de núcleos e a melhor pureza para o protocolo Multiome a jusante. A classificação FACS e as etapas repetidas de centrifugação resultam em uma perda substancial do material inicial. Por esta razão, no protocolo de preparação de núcleos do cérebro que descrevemos aqui requer material de partida suficientemente abundante para resultar na coleta de pelo menos 500.000 núcleos após a triagem FACS. Protocolos alternativos devem ser aplicados se esse critério não puder ser correspondido. Ao trabalhar com populações celulares raras ou pequenos cortes de tecido, a quantidade disponível de material inicial pode ser um fator limitante. Para resolver essa questão, é possível melhorar a recuperação de núcleos (a) reduzindo o volume de lise, (b) reduzindo o volume de lavagem, (c) usando uma única lavagem com tempo de centrifugação prolongado para tentar melhorar a recuperação, conforme indicado nos protocolos de Genômica 10X para isolamento de núcleos de baixa entrada celular. Para análise multiômica de material de baixo conteúdo, vale a pena considerar aplicações baseadas em placas, como scNMT, SNARE-seq e Paired-seq38 , que exigem muito menos amostras de entrada.
Em resumo, descrevemos dois protocolos robustos para a preparação de núcleos do cérebro e da medula óssea HSPCs para análise do Multiome a jusante. Esses protocolos são aplicáveis em qualquer projeto científico que exija suspensões de núcleo único de alta qualidade desses dois tipos de tecido, independentemente da questão científica colocada. Nosso grupo vem aplicando o protocolo de isolamento de núcleos cerebrais em estudos do desenvolvimento cerebral após a inativação de vários genes-alvo e em estudos de resposta imune no contexto de doenças neurológicas. Estamos utilizando o protocolo de isolamento de núcleos da medula óssea para decifrar a participação de várias subpopulações hematopoéticas no estabelecimento do sistema imune.

Por muitos anos, as técnicas unicelulares têm sido o padrão-ouro para a análise de processos biológicos. Inicialmente, restringiram-se à fenotipagem unicelular por meio de microscopia, citometria de fluxo e ensaios similares. Um avanço na análise de célula única veio com o desenvolvimento de abordagens para perfil molecular de célula única, em particular o sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-Seq) que permitiu caracterizar todo o transcriptoma de células individuais. Altamente poderoso, scRNA-Seq gera informações sobre o status transcricional de uma célula em uma condição e ponto de tempo específicos. No entanto, não fornece visibilidade sobre a regulação gênica que impulsiona a transcrição, ou sobre as modificações moleculares que ocorrem ao longo do tempo. Para superar essa limitação, muitos esforços têm sido investidos no desenvolvimento de ensaios multiômicos unicelulares que possibilitem a análise de múltiplos fatores e processos de uma mesma célula1,2,3,4. A primeira medida bem-sucedida de duas modalidades dentro de células individuais veio através da ligação de padrões de expressão de proteínas de superfície multiplex com o transcriptoma completo de células individuais na abordagem CITE-Seq5. Evoluções mais recentes combinam a expressão gênica com a acessibilidade da cromatina (Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing, ATAC-Seq), capturando simultaneamente modalidades transcriptômicas e epigenômicas nas mesmas células (por exemplo, sci-CAR)6. As primeiras soluções comerciais que permitiram associar a transcriptômica ao fenótipo celular ou a alterações epigenéticas de uma mesma célula vieram da 10X Genomics.
Os experimentos para perfil molecular de célula única contêm as seguintes etapas: (1) dissociação tecidual ou preparação de suspensões de célula única; (2) purificação e/ou isolamento de núcleos celulares; (3) particionamento e código de barras; (4) construção de bibliotecas e controle de qualidade; (5) sequenciamento de próxima geração; (6) análise dos dados. Enquanto os passos (3)-(6) podem variar significativamente dependendo da tecnologia empregada, os passos iniciais são geralmente comuns a todos eles. A qualidade da suspensão de células/núcleos preparada determinará o resultado global do experimento. Dependendo do tipo de tecido, a obtenção de suspensões unicelulares/núcleos de alta qualidade pode ser um desafio. As particularidades de alguns tecidos, como coração, músculo, cérebro, pulmão, intestino, entre outros, requerem métodos de ruptura tecidual e isolamento de núcleos adaptados a cada tipo de amostra, a fim de garantir a produção de núcleos de alta qualidade para análise molecular7,8,9,10. Os métodos de ruptura tecidual e os protocolos de dissociação podem ser mecânicos, enzimáticos (por exemplo, uma mistura de colagenases e DNase) ou uma combinação dos dois, e podem ser realizados manualmente ou por instrumentos (por exemplo, Qiagen DSC-400, gentleMACS).
As técnicas unicelulares tornaram-se uma ferramenta de escolha para a pesquisa biomédica. Em neurobiologia, a diversidade celular no cérebro e a complexidade de suas funções requerem análises de alta resolução e alto rendimento para visualização de populações celulares raras e para avaliação de sua heterogeneidade 11,12,13,14. Ligar a identidade celular e os mecanismos de regulação gênica de células individuais fornece insights sobre o desenvolvimento e a fisiologia do cérebro. Outro exemplo são os estudos de resposta imune no contexto de doenças infecciosas, autoimunes ou oncológicas, que dependem fortemente de análises unicelulares. A heterogeneidade dos subgrupos de células imunes e a complexidade de sua atividade e interações com outros tipos celulares requerem resolução de célula única para decifrar os mecanismos subjacentes à resposta imune. As células imunes se originam da medula óssea, onde os progenitores hematopoiéticos são compostos por células que gradualmente se diferenciam e adquirem e perdem marcadores de superfície celular ao longo de um processo gradual antes de sair da medula óssea para a periferia. A análise unicelular permite a caracterização minuciosa dos estágios de desenvolvimento celular. Pode ser realizada através da fenotipagem unicelular, convencionalmente realizada por citometria de fluxo multiparâmetro. No entanto, foi demonstrado que assinaturas transcriptômicas de célula única revelam uma identificação mais precisa dos subtipos de células progenitoras, uma vez que essas células estão distribuídas em agrupamentos que caem umas nas outras e, portanto, podem ser erroneamente identificadas quando se usa uma abordagem de marcador de superfície celular grossa15. Um número crescente de estudos revela as modificações epigenéticas que as células-tronco hematopoéticas e as células progenitoras (HSPCs) podem adquirir a partir da exposição a vários agentes, levando a um impacto significativo na responsividade do sistema imune em longo prazo 16,17,18,19. As novas tecnologias multi-ômicas permitem estudar esses processos com resolução de célula única.
Vários protocolos de isolamento celular e nuclear têm sido descritos para amostras de cérebro11,20,21,22 e medulaóssea23,24. Para minimizar o viés devido à variabilidade experimental, é necessário validar protocolos otimizados de preparação de núcleos únicos para sequenciamento epigenômico e transcriptômico de célula única, garantindo assim a reprodutibilidade de ensaios multiômicos de célula única.
Aqui, dois protocolos robustos para a preparação de núcleos a partir de (1) tecido cerebral fresco congelado e (2) HSPCs de medula óssea fresca para análise de multioma de célula única a jusante são descritos (Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65715/65715fig01.jpg"> Figura 1: Representação esquemática dos protocolos de isolamento de núcleos de tecidos cerebrais e medulares frescos congelados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/65715fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>18 G x 1 &#189; (1.2 mm x 38 mm) Agani needles</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>AN*1838S1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL round bottom FACS tube with cell strainer cap 35 &#181;m</td>
			<td>falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-AAD</td>
			<td>BD pharmagen</td>
			<td>559925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A10492-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD117 (c-Kit)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>105812</td>
			<td>Clone: 2B8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cyanine 7 anti-mouse CD16/32 (Fc&#947;R)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101328</td>
			<td>Clone: 93</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria III</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>non-applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSDiva Software v8.0.1</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>non-applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin&#160; stock solution 10%</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell staining buffer</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>420201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFI Suprplan Fluor ELWD 40XC ON 0.6</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>non-applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CMOS camera Prime 95B 25 mm</td>
			<td>Photometrix</td>
			<td>non-applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMQAF1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess cell counting chamber slide</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass 24 mm x 24 mm 0.13-0.17 mm</td>
			<td>Brand</td>
			<td>BR470819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digitonine 5%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>BN2006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Scalpels&#160;</td>
			<td>Swann-Morton&#160;</td>
			<td>0508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1x) + GlutaMAX-I</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200-067</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>646563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescence inverted microscope Nikon Ti2 -E</td>
			<td>Nikon&#160;</td>
			<td>non-applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30123603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83801.290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD34</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11-0341-85</td>
			<td>Clone: RAM34</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps for dissection</td>
			<td>FST</td>
			<td>11152-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11533387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dounce Homogeniser 2 mL</td>
			<td>Bellco glass</td>
			<td>1984-10002</td>
			<td>Pestle &#8220;A&#8221; Large Clearance: .0030-.0050&#8243; and Pestle &#8220;B&#8221; Small Clearance: .0005-.0025&#8243;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD fixable aqua dead cell stain kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>L34957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride solution 1 M</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium Fluoromount-G&#160;</td>
			<td>invitrogen</td>
			<td>00-4958-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P40 substitute</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>74385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease free water</td>
			<td>ThermoFischer</td>
			<td>AM9932</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei buffer 20x&#160;</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>2000153/2000207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclei isolation kit EZ prep</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>NUC-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OneComp eBeads compensation beads</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>01-1111-41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-mouse lineage cocktail 
			(including anti-mouse CD3, Ly-6G/Ly-6C, CD11b, CD45R/B220, TER-119)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>133310</td>
			<td>Clones (in the same order as the antibodies listed): 17A2, RB6-8C5, M1/70, RA3-6B2, Ter-119</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR Tube Strips 0.2 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951010022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>122507</td>
			<td>Clone: E13-161.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100 mm x 20 mm OPTILUX</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ply-L-lysine 0.01% sterile-filtered suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4707</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Printed microscope slides 8 well 6 mm numbered</td>
			<td>Epredia</td>
			<td>ER-301B-CE24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30108116</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Rnase inhibitor 5000 U</td>
			<td>Takara</td>
			<td>2313A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors for dissection</td>
			<td>FST</td>
			<td>14090-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride solution 5 M</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>59222C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filters, PES, 0.2 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15206869</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transparent nail polish&#160;</td>
			<td>any</td>
			<td>non-applicable</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma Hydrochloride solution pH 7.4</td>
			<td>Sigma aldrich</td>
			<td>T2194</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue 0.4%</td>
			<td>gibco</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Biorad&#160;</td>
			<td>1662404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilated Water Dnase/Rnase Free</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10977-035</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-quality brain and bone marrow nuclei preparation for single nuclei multiome assays

A análise de célula única tornou-se a abordagem de escolha para desvendar a complexidade dos processos biológicos que requerem a avaliação da variabilidade das respostas celulares individuais ao tratamento ou infecção com resolução de célula única. 
Muitas técnicas para perfil molecular de célula única foram desenvolvidas nos últimos 10 anos, e várias tecnologias dedicadas foram comercializadas. O perfil de célula única baseado em gotículas da 10X Genomics é uma tecnologia amplamente difundida que oferece reagentes prontos para uso para perfis de célula única transcriptômicos e multi-ômicos. A tecnologia inclui fluxos de trabalho para sequenciamento de RNA de célula única e núcleo único (scRNA-Seq e snRNA-Seq, respectivamente), scATAC-Seq, perfil imunológico de célula única (sequenciamento BCR/TCR) e multioma. Este último combina informações transcricionais (scRNA-Seq) e epigenéticas (scATAC-Seq) provenientes da mesma célula. 
A qualidade (viabilidade, integridade, pureza) de suspensões unicelulares ou de núcleo único isoladas de tecidos e analisadas por qualquer uma dessas abordagens é crítica para a geração de dados de alta qualidade. Portanto, os protocolos de preparo das amostras devem ser adaptados às particularidades de cada tecido biológico e garantir a geração de suspensões celulares e nucleares de alta qualidade.
Este artigo descreve dois protocolos para preparar amostras de cérebro e medula óssea para o pipeline 10X Genomics do multioma a jusante. Os protocolos são realizados passo a passo e abrangem dissociação tecidual, triagem celular, isolamento de núcleos e controle de qualidade da suspensão de núcleos preparada que é usada como material de partida para particionamento celular e código de barras, preparação de biblioteca e sequenciamento. Esses protocolos padronizados produzem bibliotecas de núcleos de alta qualidade e dados robustos e confiáveis.

For many years, single-cell techniques have been the gold standard for the analysis of biological processes. They were initially restricted to single-cell phenotyping through microscopy, flow cytometry, and similar assays. A breakthrough in single-cell analysis came with the development of approaches for single-cell molecular profiling, in particular single-cell RNA sequencing (scRNA-Seq) that enabled characterizing the entire transcriptome of individual cells. Highly powerful, scRNA-Seq generates information about the transcriptional status of a cell in a specific condition and time point. However, it does not provide visibility on the gene regulation that drives transcription, or on the molecular modifications that occur over time. To overcome this limitation, many efforts have been invested in the development of single-cell multi-omics assays that enable the analysis of multiple factors and processes from the same cell1,2,3,4. The first successful measurement of two modalities within single cells came through linking multiplex surface protein expression patterns with the full transcriptome of individual cells in the CITE-Seq approach5. More recent evolutions combine gene expression with chromatin accessibility (Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing, ATAC-Seq), thereby simultaneously capturing transcriptomic and epigenomic modalities in the same cells (e.g., sci-CAR)6. The first commercial solutions that allowed associating transcriptomics with cell phenotype or with epigenetic changes of the same cell came from 10X Genomics.
Experiments for single-cell molecular profiling contain the following steps: (1) tissue dissociation or preparation of single-cell suspensions; (2) cell purification and/or nuclei isolation; (3) partitioning and barcoding; (4) library construction and quality control; (5) next-generation sequencing; (6) data analysis. While steps (3)-(6) may significantly vary depending on the technology employed, the initial steps are generally common to all of them. The quality of the prepared cell/nuclei suspension will determine the overall outcome of the experiment. Depending on the type of tissue, obtaining high-quality single-cell/nuclei suspensions may be challenging. The particularities of some tissues, such as the heart, the muscle, the brain, the lung, the intestine, and others, require methods for tissue disruption and nuclei isolation adapted to each type of sample in order to guarantee the production of high-quality nuclei for molecular analysis7,8,9,10. The tissue disruption methods and dissociation protocols can be mechanical, enzymatic (e.g., a mix of collagenases and DNase), or a combination of the two, and can be performed manually or by instruments (e.g., Qiagen DSC-400, gentleMACS).
Single-cell techniques have become a tool of choice for biomedical research. In neurobiology, the cell diversity in the brain and the complexity of their functions require high-resolution and high-throughput analysis for visualization of rare cell populations and for assessing their heterogeneity11,12,13,14. Linking cellular identity and gene regulatory mechanisms of individual cells provides insights into brain development and physiology. Another example is studies of immune response in the context of infectious, autoimmune, or cancer diseases, which strongly rely on single-cell analyses. The heterogeneity of immune cell subsets and the complexity of their activity and interactions with other cell types require single-cell resolution in deciphering the mechanisms underlying immune response. The immune cells originate from the bone marrow, where hematopoietic progenitors are composed of gradually differentiating cells that acquire and lose cell surface markers throughout a stepwise process prior to exiting the bone marrow to home in the periphery. Single-cell analysis allows for minute characterization of cellular developmental stages. It can be achieved through single-cell phenotyping, conventionally performed by multi-parameter flow cytometry. However, single-cell transcriptomic signatures have been shown to reveal a more precise identification of progenitor cell subtypes since these cells are distributed in clusters that fall into one another and can therefore be misidentified when using a coarse cell surface marker approach15. An increasing number of studies uncover the epigenetic modifications that hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) can acquire from exposure to various agents, leading to a significant impact on the long-term responsiveness of the immune system16,17,18,19. The novel multi-omics technologies enable studying these processes with single-cell resolution.
Many protocols for cell and nuclei isolation have been described for brain11,20,21,22 and bone marrow samples23,24. To minimize bias due to experimental variability, it is necessary to validate optimized single-nuclei preparation protocols for joint single-cell transcriptomic and epigenomic sequencing, thereby ensuring the reproducibility of single-cell multiomic assays.
Here, two robust protocols for nuclei preparation from (1) fresh-frozen brain tissue and (2) fresh bone marrow HSPCs for downstream single-cell Multiome analysis are described (Figure 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65715/65715fig01.jpg" /> 
Figure 1: Schematic representation of protocols for nuclei isolation from fresh-frozen brain and bone marrow tissues. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/65715fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>

Autor em destaque: Avançando na pesquisa biomédica por meio da análise de células únicas 

Preparação de Núcleos Cerebrais e de Medula Óssea de Alta Qualidade para Ensaios Multioma de Núcleos Únicos

The Cytometry and Biomarkers Technology Unit supports biomedical projects through state-of-the-art technologies and pipelines for cell phenotyping and molecular profiling with single-cell resolution. In this context, we use different tools for single-cell multiomic analysis to obtain insights into gene expression and gene regulation in health and disease. Flow cytometry identify and source individual cells based on unique characteristic.Recent advance include high-throughput, image-based spectral sorters, and those technology offer flexibility in panel design, enable simultaneous use of similar dyes, and the managing of autofluorescence. A major experimental challenge when using cutting-edge, single-cell technologies is working with particularly fragile or rare cell populations. Each tissue or cell type needs to undergo fine-tuned protocol optimization to obtain enough highly viable cells that translate into high-quality sequencing data.Our modified single nuclei preparation protocol improves nuclei recovery and minimizes stress on the nuclei. It is specifically optimized for brain and bone marrow tissues and covers all the steps from sample dissociation to nuclei purification.

Os dois protocolos descritos acima detalham o isolamento de núcleos a partir de dois tipos diferentes de tecido. As diferenças e semelhanças entre os dois protocolos estão esquematicamente representadas na Figura 1.
Purificação de núcleos de cérebro de camundongos No protocolo aqui descrito, propomos um método suave para a preparação de núcleos a partir de amostras cerebrais. Inicia-se com uma dissociação mecânica do tecido cerebral em um tampão de lise, seguida por etapas de lavagem e filtragem do filtro que removem o tecido restante da suspensão. A remoção subsequente de detritos, células não lisadas e pequenas partículas é conseguida pelo FACS para garantir que apenas núcleos purificados sejam carregados para o protocolo Multiome a jusante. A Figura 2 mostra o perfil dos núcleos antes e após a triagem. Após a filtragem e antes da triagem dos núcleos, a amostra contém uma alta quantidade de debris, com mais de 99% dos "singletes" positivos para coloração nuclear (7-AAD), indicando lise celular ótima (Figura 2A). Os núcleos são classificados com base no portão positivo de 7-AAD. Uma fração de material triado é adquirida para verificar a pureza dos núcleos preparados. A Figura 2B mostra o perfil dos núcleos cerebrais após a triagem. A triagem dos núcleos permitiu um aumento na pureza dos núcleos dos 36% iniciais (Figura 2A) para quase 100% (Figura 2B).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65715/65715fig02.jpg"> Figura 2: Estratégia de agrupamento para classificação de núcleos e teste de pureza após a triagem. Os núcleos foram corados com 7-AAD e adquiridos pelo classificador celular. (A) Os núcleos são primeiramente fechados com base em seu tamanho e granularidade (FSC-A e SSC-A, respectivamente). Partículas individuais são então selecionadas com base em suas propriedades FSC-A/FSC-H e coloração 7-AAD. (B) Após a triagem celular, uma fração dos núcleos do tubo de coleta é testada quanto à pureza usando a mesma estratégia de fechamento que em A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/65715fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Purificação de progenitores de células-tronco hematopoéticas (HSPCs) de medula óssea de camundongos Após o isolamento da medula óssea, até 2 x 105 HSPCs são classificados por FACS, de acordo com a estratégia de gating mostrada na Figura 3A. A eficácia da triagem e a pureza da amostra são avaliadas (Figura 3B).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65715/65715fig03v2.jpg"> Figura 3: Estratégia de gating para triagem de HSPCs de medula óssea. (A) Uma estratégia representativa de agrupamento FACS para a triagem de células-tronco hematopoéticas LKS+ viáveis e progenitores mieloides CD34+ para isolamento de núcleos. (B) Parcelas FACS representativas utilizadas para a verificação da pureza da população celular classificada. São mostradas as proporções de diferentes subconjuntos celulares em relação à população parental. *As duas populações classificadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/65715fig03largev2.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
O protocolo "Low Cell Input Nuclei Isolation" permite o isolamento de núcleos de amostras com um máximo de 10 a5 células. Inclui um baixo número de etapas de centrifugação, minimizando assim a perda de células/núcleos. Ajustamos o volume de tampões de lise e lavagem proporcionalmente à entrada celular e aumentamos o tempo de centrifugação para máxima recuperação dos núcleos. Realizamos um experimento piloto para avaliar a quantidade de núcleos recuperados por contagem e sua qualidade por citometria de fluxo e microscopia. A Figura 4 mostra a amostra de HSPCs após lise celular. Esse protocolo gerou núcleos de alta qualidade, como observado na Figura 5A, sem detritos que pudessem impactar o protocolo de multioma a jusante.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65715/65715fig04.jpg"> Figura 4: Classificação do teste de pureza dos núcleos isolados de HSPC da medula óssea. Os núcleos foram corados com 7-AAD e adquiridos pelo classificador celular. Os núcleos foram primeiramente fechados com base em seu tamanho e granularidade (FSC-A e SSC-A, respectivamente) para avaliar a pureza da amostra. A proporção de núcleos é indicada em relação à população parental. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/65715fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Número do tubo</td>
			<td>Nome do tubo</td>
			<td>Entidade manchada</td>
			<td>Quantidade de entidade manchada</td>
			<td>Anticorpo/corante (μL)</td>
			<td>Buffer de coleta (μL)</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>Sem manchas</td>
			<td>Células</td>
			<td>5,00,000</td>
			<td>N/A</td>
			<td rowspan="7">200</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>LIVE/DEAD Mancha Aqua Dead Cell</td>
			<td>Células</td>
			<td>5,00,000</td>
			<td>0.5</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>APC/Cyanine 7 anti-camundongo CD16/32 (FcγR)</td>
			<td>OneComp eBeads</td>
			<td>15 μL</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>Coquetel de linhagem anti-rato azul do Pacífico</td>
			<td>OneComp eBeads</td>
			<td>15 μL</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>PE anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1)</td>
			<td>OneComp eBeads</td>
			<td>15 μL</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td>APC anti-mouse CD117 (c-Kit)</td>
			<td>OneComp eBeads</td>
			<td>15 μL</td>
			<td>1</td>
		</tr><tr><td>7</td>
			<td>FITC anti-mouse CD34</td>
			<td>OneComp eBeads</td>
			<td>15 μL</td>
			<td>1</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Controles de coloração única para ajustes de compensação no citômetro de fluxo. São indicados os controles de coloração única necessários, o número de células ou contas a serem coradas e as quantidades de anticorpos.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Master Mix</td>
			<td>Reagente</td>
			<td>Diluição final</td>
			<td>Anticorpo/corante (μL)</td>
			<td>Tipo de buffer</td>
			<td>Tampão (μL)</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Mistura 1</td>
			<td>APC/Cyanine 7 anti-camundongo CD16/32 (FcγR)</td>
			<td>1/500</td>
			<td>1.2</td>
			<td rowspan="2">DPBS</td>
			<td rowspan="2">300</td>
		</tr><tr><td>LIVE/DEAD Mancha Aqua Dead Cell</td>
			<td>1/250</td>
			<td>2.4</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">Mistura 2</td>
			<td>Coquetel de linhagem anti-rato azul do Pacífico</td>
			<td>1/20</td>
			<td>30</td>
			<td rowspan="4">Buffer FACS</td>
			<td rowspan="4">300</td>
		</tr><tr><td>PE anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1)</td>
			<td>1/200</td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td>APC anti-mouse CD117 (c-Kit)</td>
			<td>1/200</td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td>FITC anti-mouse CD34</td>
			<td>1/50</td>
			<td>12</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Volume total de coloração</td>
			<td>600</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 2: Composição da mistura de coloração para HSPCs de medula óssea. São mostrados os volumes de reagentes necessários para a coloração de uma amostra contendo 40 milhões de células. Para colorir um número maior de amostras, multiplique o volume indicado pelo número necessário de amostras e adicione metade de um volume de amostra extra para garantir um volume suficiente da mistura principal.
Figura suplementar 1: Protocolo de isolamento de células da medula óssea. (A) Abra o peritônio. Linhas pontilhadas brancas indicam a linha a ser cortada. (B) Depois de descascar a pele da pata traseira, forre a tesoura ao longo da coluna vertebral na articulação do quadril para cortar a perna sem cortar o fêmur. (C) A aparência da perna separada do corpo antes da remoção do músculo. (D) O aparecimento da perna após a remoção do músculo. (E) O procedimento para separar o fêmur na articulação do joelho, depois na articulação do quadril, tomando cuidado para não abrir o fêmur. As setas curvas brancas mostram o movimento necessário. (F) Procedimento para abrir a parte distal do fêmur (ou seja, a parte previamente presa à tíbia na articulação do joelho) segurando firmemente a cartilagem e a epífise distal com tesoura e virando-a para trás para expor a medula óssea. (G) Quatro saliências, indicadas por setas pretas, devem ser visíveis na extremidade exposta da fise. (H) A aparência de um fêmur com a extremidade aberta voltada para baixo no tubo preparado de 0,5 mL colocado dentro de um tubo de 1,5 mL contendo 150 μL de tampão FACS. (I) O aparecimento das células da medula óssea peletizadas e do fêmur agora branco após rápida centrifugação a 12.000 x g. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65715/Moraes-Cabe%20et%20al_Supplementary%20Figure1.pdf" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Advancing Biomedical Research Through Single Cell Analysis at JoVE.com

O sucesso da transcriptômica de célula única/núcleo único e multi-ômica depende em grande parte da qualidade das células/núcleos. Portanto, o isolamento de células/núcleos do tecido e sua purificação devem ser altamente padronizados. Este protocolo descreve a preparação de núcleos do cérebro e da medula óssea para o ensaio de multioma de núcleo único a jusante.

Single-cell analysis has become the approach of choice for unraveling the complexity of biological processes that require assessing the variability of ...

A Unidade de Tecnologia de Citometria e Biomarcadores apoia projetos biomédicos por meio de tecnologias de ponta e pipelines para fenotipagem celular e perfil molecular com resolução de célula única. Neste contexto, usamos diferentes ferramentas para análise multiômica de célula única para obter insights sobre a expressão gênica e regulação gênica em saúde e doença. A citometria de fluxo identifica e origina células individuais com base em características únicas.Os avanços recentes incluem classificadores espectrais baseados em imagem de alto rendimento, e essas tecnologias oferecem flexibilidade no design do painel, permitem o uso simultâneo de corantes semelhantes e o gerenciamento de autofluorescência. Um grande desafio experimental ao usar tecnologias de ponta de célula única é trabalhar com populações de células particularmente frágeis ou raras. Cada tipo de tecido ou célula precisa passar por uma otimização de protocolo ajustada para obter células altamente viáveis suficientes que se traduzam em dados de sequenciamento de alta qualidade.Nosso protocolo modificado de preparação de núcleos únicos melhora a recuperação dos núcleos e minimiza o estresse sobre os núcleos. Ele é especificamente otimizado para tecidos cerebrais e da medula óssea e cobre todas as etapas desde a dissociação da amostra até a purificação dos núcleos.

high-quality-brain-bone-marrow-nuclei-preparation-for-single-nuclei

Research

JoVE Journal

Biology

High-Quality Brain and Bone Marrow Nuclei Preparation for Single Nuclei Multiome Assays

1.5K visualizações.  Institut Pasteur, Université Paris Cité. A Unidade de Tecnologia de Citometria e Biomarcadores apoia projetos biomédicos por meio de tecnologias de ponta e pipelines para fenotipagem celular e perfil molecular com resolução de célula única. Neste contexto, usamos diferentes ferramentas para análise multiômica de célula única para obter insights sobre a expressão gênica e regulação gênica em saúde e doença. A citometria de fluxo identifica e origina células individuais com base em características únicas.Os a...

Vídeo: Autor em destaque: Avançando na pesquisa biomédica por meio da análise de células únicas 

Single-cell analysis has become the approach of choice for unraveling the complexity of biological processes that require assessing the variability of individual cellular responses to treatment or infection with single-cell resolution. 
Many techniques for single-cell molecular profiling have been developed over the past 10 years, and several dedicated technologies have been commercialized. The 10X Genomics droplet-based single-cell profiling is a widespread technology that offers ready-to-use reagents for transcriptomic and multi-omic single-cell profiling. The technology includes workflows for single-cell and single-nuclei RNA sequencing (scRNA-Seq and snRNA-Seq, respectively), scATAC-Seq, single-cell immune profiling (BCR/TCR sequencing), and multiome. The latter combines transcriptional (scRNA-Seq) and epigenetic information (scATAC-Seq) coming from the same cell. 
The quality (viability, integrity, purity) of single-cell or single-nuclei suspensions isolated from tissues and analyzed by any of these approaches is critical for generating high-quality data. Therefore, the sample preparation protocols should be adapted to the particularities of each biological tissue and ensure the generation of high-quality cell and nuclei suspensions.
This article describes two protocols for preparing brain and bone marrow samples for the downstream multiome 10X Genomics pipeline. The protocols are performed stepwise and cover tissue dissociation, cell sorting, nuclei isolation, and quality control of prepared nuclei suspension that is used as starting material for cell partitioning and barcoding, library preparation, and sequencing. These standardized protocols produce high-quality nuclei libraries and robust and reliable data.

The success of single-cell/single-nuclei transcriptomics and multi-omics largely depends on the quality of cells/nuclei. Therefore, isolating cells/nuclei from tissue and their purification must be highly standardized. This protocol describes the preparation of nuclei from the brain and bone marrow for downstream single-nuclei multiome assay.

Biologia

Purification of Nuclei from Mouse Brain for Single-Cell Multiome Analysis

To begin, fill a glass Dounce with two milliliters of ice-cold nuclei lysis buffer containing 0.01%digitonin, and add the dissected mouse brain tissue pieces into it. Using a glass Dounce tissue homogenizer, homogenize the tissue 25 times each with pestles A and B, and transfer the resulting homogenate into a 15-milliliter tube. Add two milliliters of ice-cold nuclei lysis buffer containing 0.01%digitonin to the homogenate and incubate on ice for five minutes.Then, centrifuge the nuclei at 500 G for five minutes at four degrees Celsius. Using a micropipette, remove the supernatant and add four milliliters of ice-cold nuclei lysis buffer containing 0.01%digitonin. Filter the nuclei suspension through a 40-micrometer cell strainer.Centrifuge the nuclei again, remove the supernatant and add four milliliters of staining buffer to wash the nuclei. After filtering the suspension through a 40-micrometer cell strainer, pellet the nuclei by centrifugation and resuspend the nuclei in one milliliter of PBS containing 0.04%BSA and RNase inhibitors. To count the cells, mix 10 microliters of 0.4%trypan blue with 10 microliters of the nuclei in a 0.5-milliliter tube.Count the nuclei using an automated cell counter. Transfer 100 microliters of the nuclei to a FACS tube for the unstained control. Add 10 microliters of 7-AAD to the remaining nuclei and incubate for five minutes at four degrees Celsius, and proceed with nuclei sorting using FACS.Then, transfer 10 microliters of the sorted nuclei into a new FACS tube containing 90 microliters of DPBS with 2%heat-inactivated FBS. After centrifuging the sorted nuclei, remove the supernatant using a micropipette and resuspend the nuclei in 100 microliters of diluted nuclei buffer. Before sorting, the sample contains substantial debris with over 99%of singlets positive for nuclear stain, indicating effective cell lysis.Brain nuclei after sorting demonstrated an increase in purity from the initial 36%to nearly 100%

Purificação de Núcleos de Cérebro de Camundongo para Análise de Multioma de Célula Única

Purification of Nuclei from Mouse Bone Marrow Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs)

To begin, take a vial containing the mouse bone marrow hematopoietic stem and progenitor cells. Using a micropipette, resuspend the pellet in one milliliter of ACK lysing buffer and incubate for one to two minutes at room temperature. Transfer the resuspended mixture into a 50 milliliter tube through the pre-wetted 70 micrometer cell strainer.Then add 10 milliliters of FACS buffer to dilute the ACK lysing buffer. Centrifuge the mixture at 400 G for five minutes at four degrees Celsius and resuspend the pellet in 10 milliliters of FACS buffer by first resuspending it in one milliliter of buffer and then topping up with nine milliliters of buffer. Now, mix 10 microliters of 0.4%trypan blue with 10 microliters of the cells in a 0.5 milliliter tube, and count the cells using an automated cell counter.To stain the cells, centrifuge the cells at 400 G for five minutes at four degrees Celsius. Resuspend the pellet in FACS buffer to achieve a final concentration of one times 10 to the seven cells per milliliter by first resuspending the pellet in one milliliter of buffer and then topping up with the remaining volume. Using a P1000 micropipette, transfer the suspension into a FACS tube through a 35 micrometer cell strainer cap.Next, prepare staining mix as shown here. After centrifugation, resuspend the cell suspension in 300 microliters of staining mix one in a sample tube and incubate on ice for 15 minutes protected from light. Then add 300 microliters of mix two into the sample tube and incubate for 20 minutes on ice protected from light.Add three milliliters of the FACS buffer to the single stained and mixed stained sample tubes. Now centrifuge the cell suspension. After discarding the supernatant, resuspend the pellet in 500 microliters of the FACS buffer.Prepare a 1.5 milliliter tube prefilled with 500 microliters of collection medium. Once the FACS instrument has been calibrated, add 500 microliters of FACS buffer to the cell suspension and then transfer one milliliter of the sample through a 35 micrometer cell strainer cap into a new FACS tube. After cell sorting, transfer 10 microliters of the sorted cells into a new FACS tube containing 90 microliters of FACS buffer.Pellet the cell suspension by centrifugation and resuspend in 50 microliters of PBS with 0.04%BSA. Transfer the suspension to a 0.2 milliliter tube and add 50 microliters of PBS with BSA to the original tube to collect any leftover cells. Transfer the cells to the 0.2 milliliter tube to reach a total volume of 100 microliters.Run a pilot experiment to identify the best lysis time for nuclei isolation. After pelleting the nuclei, resuspend the nuclei pellet in 12 microliters of diluted nuclei buffer. Add two microliters of nuclei to a tube containing 0.4%trypan blue and eight microliters of PBS with 0.04%BSA and count the nuclei using an automated cell counter.After completing the nuclei isolation, transfer six microliters of nuclei resuspension into a new FACS tube pre-filled with 150 microliters of FACS buffer. Add three microliters of 7-AAD and incubate for five minutes on ice.