Pesquisar para prevenir a cegueira, assistência Experimental de Takayuki Nagasaki; Esta pesquisa está em conformidade com a Declaração de ARVO para o Uso de Animais em Oftalmologia e Pesquisa Visual. KJW é suportado pelo NIH e 5T32EY013933 5T32DK007647-20. VBM é suportado pelo NIH concessão K08EY020530.

1. Montar dispositivos para a injeção sub-retiniana <ol><li> Comprar ou fazer uma agulha 100 um de diâmetro a partir de um tubo de vidro capilar. Isto pode ser feito manualmente utilizando um extractor Sutter P-97 da pipeta ou outro equipamento semelhante. A extremidade do tubo capilar irá ser aquecido e puxado até atingir o diâmetro desejado (100 mm). Uma agulha de menor diâmetro podem ser utilizados para vectores de terapia génica, no entanto, isto é o diâmetro recomendado para a injecção das células, sem danificar as células ou o olho. Em comparação com as agulhas de aço, a agulha capilar de vidro tem uma ponta muito fina, mas sem corte, para permitir a visualização do fluido de injecção e de acesso ao espaço sub-retiniano, sem causar a ruptura da retina. Limpe estas agulhas puxado, se necessário usando etanol 70%, e guarde em um recipiente estéril. Uma placa de cultura de 15 centímetros estéril tecido com fita adesiva para segurar as agulhas no lugar é uma forma em que para manter as agulhas de injecção e coberto em um ambiente estéril. Neste ponto, complete o set-up dentro da sala cirúrgica onde o procedimento será realizado. É mais fácil manter todos os equipamentos na sala cirúrgica em todos os momentos para que ele permaneça estéril, especialmente se este procedimento é feito dentro de uma instalação de barreira. </li><li> Aspirar silicone para dentro da agulha de injecção e ejetar o silicone para deixar um revestimento ao longo das paredes internas da agulha. O revestimento de silicone maximiza a passagem de células e vírus através do furo da agulha, que, de outro modo aderir às paredes interiores de vidro capilar. </li><li> Obter um comprimento de aproximadamente 8 cm de tubagem de plástico estéril, cortando uma colheita de sangue 25 ¾ calibre definido com luer-lock no ponto imediatamente após a agulha (remover a agulha do tubo). </li><li> Encher um 1 ml Sub-Q 26 5/8-gauge seringa de ponta de deslizamento com uma solução salina estéril e retire a agulha da seringa. </li><li> Fixar a agulha de injecção para a extremidade cortada do tubo de plástico e encaixe a seringa para o luer-lock na outrafim. </li><li> Aspirar solução salina estéril para preencher o espaço morto na agulha e tubo capilar, uma solução salina de ejecção através da agulha para assegurar que ele está correctamente ligado sem qualquer fuga. Em seguida, aspirar uma pequena quantidade de cerca de 1 ul de ar, para dentro da ponta da agulha de injecção. Isto vai separar o soro fisiológico do fluido de injecção e proporcionar uma indicação visual que indica o fim do fluido de injecção, durante o procedimento cirúrgico. O aparelho de injeção deve ser mantido em uma superfície limpa limpo com etanol 70% durante o procedimento cirúrgico. Além disso, todo o equipamento utilizado durante o procedimento cirúrgico deve ser limpo, tanto antes como depois com etanol a 70%, com excepção de que as agulhas de injecção deve ser mantido já esterilizado e pronto para ser utilizado. Estas agulhas devem ser eliminados após a cirurgia e não reutilizado. </li><li> Finalmente, aspirar solução injectável que contém o vector de terapia desejado embalados gene viral ou células estaminais. Isto pode ser feito pelatendo-se a solução de injecção uma ponta de pipeta estéril, em seguida pipetando a solução sobre a superfície de um prato de cultura de células estéril. A solução pode agora ser facilmente aspirada para dentro da agulha de injecção com a seringa. A quantidade necessária irá variar, dependendo da idade do rato. Para os nossos propósitos, usamos pós-natais dia 5 ratos, que podem ser injectados com 0,5-0,8 uL de fluido de injecção. Quantidades menores, 0,5 ul ou menos, podem ser utilizadas para os ratos mais jovens e maiores quantidades, tais como 1 uL, pode ser utilizado para ratinhos adultos. O título virai ou o número de células tem de ser determinado com base nos vírus / células serem injectados e seus tecidos-alvo desejado, como muitas partículas virais ou células num pequeno volume pode levar à toxicidade para as células da retina. No vídeo, para efeitos de visualização, utilizou 1,5 ul, uma maior quantidade de corante que é necessário para injectar no olho. </li></ol> 2. Acessando o espaço sub-retiniana <ol><li> Dentro do ambiente estéril cirúrgico,estabilizar ou anestesiar o rato de acordo com o protocolo aprovado localmente manuseamento dos animais, a qual irá variar de acordo com a idade do rato. Anestesia comum para ratinhos adultos inclui o uso de gás isoflurano ou de uma injecção intra-peritoneal de 0,1 mL/10 g de peso corporal de cetamina (100 mg / ml) e xilazina (20 mg / ml) em solução salina estéril. Para ratinhos perinatais, as técnicas de anestesia comuns incluem o uso de gás ou isoflurano Crioanestesia (hipotermia). Todas as técnicas de anestesia deve ser aprovado pelo seu comitê local IACUC antes do uso. Normalmente usamos dia pós-natal (P) 5 murganhos, embora as técnicas similares podem ser aplicadas a ratinhos jovens como P0 ou camundongos adultos. O procedimento cirúrgico não pode começar até que o mouse deixou mover os membros e não responde mais aos pés pitadas. Para ratos perinatais, eles vão tornar-se visivelmente mais leve na cor já que o fluxo de sangue irá desacelerar, outra chave para saber que eles são totalmente sob anestesia. </li><li> Em camundongos perinatais, use Vannas tesouras retas para make uma incisão milímetros aproximado 1,5 ao longo da fissura a tampa fechada. Tenha o cuidado de cortar no recuo, onde o olho vai abrir naturalmente no futuro. Isso garante que as tampas se curar e abrir adequadamente durante o desenvolvimento do ratinho. A lâmina cirúrgica pode ser utilizada para esta finalidade, apesar de preferirmos Vannas tesoura, uma vez que reduzem o risco de perfurar o olho durante este procedimento. No vídeo, a tesoura foram usados ​​diretamente punção e corte ao longo da margem palpebral. Quando esta técnica de aprendizagem, uma pinça deve ser usada para levantar a pálpebra antes do corte, e reduzir o risco de danificar o olho. </li><li> Separar as pálpebras com uma pinça de vestir curvas para proptose do olho e beliscar as pálpebras ligeiramente debaixo do olho para mantê-lo proptose injectável. Se a incisão tampa feita em duas etapas é muito grande, o olho irá deslizar para trás sob as pálpebras e evitar a exposição adequada durante o processo de injecção. Para camundongos adultos, aplicando uma leve pressão ao redor dos olhos com o Dr.essing fórceps pode manter o olho proptose injectável. </li><li> Fazer uma pequena incisão escleral no ou posterior ao equador do globo arranhando a superfície com uma lâmina de microcirurgia de 15 graus. Esta incisão deve ser apenas suficientemente grande para passar a ponta da agulha de injecção, mas não maior do que isso. Se preferido, uma agulha de pequeno e afiado tal como uma agulha de acupuntura pode ser usada para fazer essa incisão para o espaço sub-retiniano, em vez da lâmina de microcirurgia. Em animais pigmentadas, um tecido de cor castanha-escura pigmentada (a coróide-retinal do epitélio pigmentar) irá tornar-se visível no ponto de incisão. Em mais leves ratos pigmentados ou albinos, uma caneta de marcação cirúrgica pode ser aplicada à ponta da lâmina da microcirurgia para deixar uma mancha de tinta que indica o local da incisão. Se claros refluxos (vítreo) de fluido a partir do local da incisão, a lâmina foi colocada demasiado profunda e entrou na cavidade vítrea e o vírus terapêutico ou células podem entrar no espaço durante a injecção intravítrea. Para visualizatiem fins, fizemos a incisão para este ponto do vídeo. É ainda possível realizar uma injecção sub-retiniana, neste caso, no entanto, o descolamento da retina causada pela presença do líquido de injecção não pode curar completamente neste rato. Por conseguinte, deve ser tomado cuidado para cortar apenas a superfície exterior do olho, e não através da retina, antes da injecção. </li><li> Cuidadosamente insira a agulha de injecção no local da incisão e fazê-la avançar paralelamente à parede exterior do olho para entrar no espaço sub-retiniano. Avançando muito perto da parede exterior ou demasiado profunda no interior do olho vai dirigir a injecção no local errado. O melhor método para compreender se a agulha está no local correto é praticar a técnica. Praticar em ratos levemente pigmentadas ou albino pode ajudar a fazer injeções precisos e exatos para o espaço sub-retiniano. Isto é porque o fluido de injecção da agulha e é visível dentro destes olhos. </li><li> Aplicar uma leve pressão sobre o êmbolo da seringa e havergin injecção do fluido desejado. Se a agulha é colocada corretamente dentro do espaço sub-retiniana, contrapressão moderada será sentida. Se a agulha se encontra dentro do corpo vítreo, haverá contrapressão significativamente menor e, potencialmente, um pouco de fluido de refluxo durante a injecção. Se houver contrapressão significativa, segure a agulha no lugar para, pelo menos, um período adicional de 15 segundos antes de remover a agulha lentamente. Isto irá permitir que a pressão intra-ocular elevada para igualar a refluxo em vez de vírus ou as células injectadas para trás para fora do local da incisão. Parte do ar e solução salina pode ser injectada no espaço sub-retiniano devido ao aumento da pressão necessária durante o processo de injecção. Cuidados devem ser tomados para não sobre-injetar ar ou salina, uma vez que pode expulsar o vírus injetado ou células do olho. É também possível provocar o descolamento da retina permanente da presença de muito líquido injectado no espaço sub-retiniano. Para efeitos de visualização, o excesso de corante e ar foi injectado into o espaço sub-retiniano do vídeo. Pode ser claramente visto como parte do corante será liberado de volta para fora do espaço sub-retiniano se muito é injectado, mas também como a bolha de ar permanece no interior do espaço sub-retinal e não desaparece para dentro do vítreo. Este foi usado para enfatizar que estas injecções estavam todos dentro do local correto do olho, para que se possa visualizar como a agulha deve entrar no local da incisão. Todas as injecções no espaço sub-retiniano provocar um descolamento da retina temporária devido à presença do fluido de injecção. Se o procedimento de injecção está terminada correctamente, este descolamento da retina temporária curará dentro de 24 horas e ratos podem ser utilizados para todas as experiências adicionais. O olho pode permanecer macio durante aproximadamente uma semana em função do procedimento cirúrgico, para uma segunda injecção deve ser evitado durante este período de tempo. </li><li> Para ratos neonatos, use a pinça de vestir curvas para empurrar cuidadosamente o olho para trás das pálpebras e na órbita. Pode ser útilde esperar por um minuto, a fim de permitir que o vírus se estabelecer no interior do espaço sub-retinal e não fazer com que seja empurrado para fora do local da incisão quando suavemente empurrando o olho de volta para a sua órbita. Após a cirurgia, uma gota de 0,5% de bupivacaína (marcaína) diluída a 0,25% em solução salina estéril a partir de uma agulha de calibre 25 pode ser colocado no local da injecção. Ratos não mostram sinais evidentes de desconforto após a cirurgia sub-retiniana e do uso de bupivacaína como um analgésico de longa ação tópica tem sido suficiente para os três anos anteriores. Ratos deve ser sempre monitorado após o procedimento cirúrgico para procurar por sinais de angústia, como infecção, inchaço, ou uma diminuição nas atividades habituais diárias do mouse. Se isso ocorrer, o veterinário deve ser notificado e medicamentos para a dor mais como a buprenorfina (0,05 mg / kg) pode ser administrado como uma injecção intraperitoneal. </li><li> Acordar o mouse da anestesia acordo com o protocolo aprovado localmente animais manuseio. O rato deve ser mantido em um p aquecimentoad para manter a temperatura corporal normal, uma vez que acorda da anestesia. O procedimento cirúrgico deve levar menos de cinco minutos para completar, não contando o tempo para o mouse se submeter a anestesia. Assim, uma almofada de aquecimento não é necessário durante o procedimento real, mas podem ser necessários quando se está a aprender a técnica como o processo pode demorar um longo período de tempo. O mouse não deve ser colocado de volta em uma gaiola limpa, até que começou a se mover por conta própria. Para recém-nascidos, pitadas toe suaves vai ajudar para que eles se recuperar totalmente da anestesia, e eles devem recuperar a sua cor-de-rosa e movimento antes de serem colocados de volta com a mãe. Ratos deve ser monitorado ao longo do tempo por quaisquer sinais de angústia como listado anteriormente. </li></ol>

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	<li>Abe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+the+retina+using+pigment+epithelial+cell+transplantation.">Regeneration of the retina using pigment epithelial cell transplantation.</a> Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 106, 778-803 (2002).</li><li>Jacobson, S. G., Cideciyan, A. V., Ratnakaram, R., Heon, E., Schwartz, S. B., Roman, A. J., Peden, M. C., Aleman, T. S., Boye, S. L., Sumaroka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+therapy+for+Leber+congenital+amaurosis+caused+by+RPE65+mutations:+safety+and+efficacy+in+15+children+and+adults+followed+up+to+3+years.">Gene therapy for Leber congenital amaurosis caused by RPE65 mutations: safety and efficacy in 15 children and adults followed up to 3 years.</a> Arch. Ophthalmol. 130, 9-24 (2011).</li><li>Schwartz, S. D., Hubschman, J. P., Heilwell, G., Franco-Cardenas, V., Pan, C. K., Ostrick, R. M., Mickunas, E., Gay, R., Klimanskaya, I., Lanza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell+trials+for+macular+degeneration:+a+preliminary+report.">Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report.</a> Lancet. 379, 713-720 (2012).</li><li>Wang, N. K., Tosi, J., Kasanuki, J. M., Chou, C. L., Kong, J., Parmalee, N., Wert, K. J., Allikmets, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+reprogrammed+embryonic+stem+cells+improves+visual+function+in+a+mouse+model+for+retinitis+pigmentosa.">Transplantation of reprogrammed embryonic stem cells improves visual function in a mouse model for retinitis pigmentosa.</a> Transplantation. 89, 911-919 (2010).</li><li>Song, B. J., Tsang, S. H., Lin, C. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+models+of+retinal+degeneration+and+targets+for+gene+therapy.">Genetic models of retinal degeneration and targets for gene therapy.</a> Gene Ther. Mol. Biol. 11, 229-262 (2007).</li><li>Tosi, J., Sancho-Pelluz, J., Davis, R. J., Hsu, C. W., Wolpert, K. V., Sengillo, J. D., Lin, C. S., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentivirus-mediated+expression+of+cDNA+and+shRNA+slows+degeneration+in+retinitis+pigmentosa.">Lentivirus-mediated expression of cDNA and shRNA slows degeneration in retinitis pigmentosa.</a> Exp. Biol. Med. 236, 1211-1217 (2011).</li><li>Tucker, B. A., Park, I. H., Qi, S. D., Klassen, H. J., Jiang, C., Yao, J., Redenti, S., Daley, G. Q., Young, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+adult+mouse+iPS+cell-derived+photoreceptor+precursors+restores+retinal+structure+and+function+in+degenerative+mice.">Transplantation of adult mouse iPS cell-derived photoreceptor precursors restores retinal structure and function in degenerative mice.</a> PLoS One. 6, e189992 (2011).</li><li>Mahajan, V. B., Mondino, B. J., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> A high-throughput Mouse Eye Phenomics System. , (2010).</li><li>Chang, B., Hawes, N. L., Hurd, R. E., Davisson, M. T., Nusinowitz, S., Heckenlively, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+degeneration+mutants+in+the+mouse.">Retinal degeneration mutants in the mouse.</a> Vision Res. 42, 517-525 (2002).</li><li>Hawes, N. L., Smith, R. S., Chang, B., Davisson, M., Heckenlively, J. R., John, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+fundus+photography+and+angiography:+a+catalogue+of+normal+and+mutant+phenotypes.">Mouse fundus photography and angiography: a catalogue of normal and mutant phenotypes.</a> Mol. Vis. 5, 22 (1999).</li><li>Won, J., Shi, L. Y., Hicks, W., Wang, J., Hurd, R., Naggert, J. K., Chang, B., Nishina, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+resources+for+vision+research.">Mouse model resources for vision research.</a> J. Ophthalmol. 2011, 391384 (2011).</li></ol>

Não há conflitos de interesse declarados.

Esta técnica de vídeo fornece instruções sobre a conclusão do procedimento de injecção sub-retiniana cirúrgica com sucesso, e de assegurar que o vector de terapia de gene ou células estaminais são colocados no local necessário para tratar eficientemente a doença oftálmica. Esta técnica permite o direccionamento de células da retina, tais como o RPE ou fotorreceptores, uma vez que coloca os vectores de terapia genética e de células-tronco derivadas de tecidos na vizinhança destas células. Métodos ante...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Companhia </td><td> Catálogo </td><td> Comentários </td></tr><tr><td> 0,8-1,10 x 100 mm Tubo Capilar (de vidro) </td><td> Kimble Glass, Inc. </td><td> 34502 99 </td><td></td></tr><tr><td> Flaming / Brown Micropipeta Puller </td><td> Instrumento Sutter </td><td> P-97 </td><td> Narishige microforge podem ser usados ​​em seu lugar. Catalog # MF-900 </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> Sigma Aldrich </td><td> SL2-25ML </td><td> Silicone </td></tr><tr><td> Fosfato de Dubecco salina tamponada com cloreto de cálcio e cloreto de magnésio </td><td> Gibco-Invitrogen </td><td> 14040-133 </td><td></td></tr><tr><td> Safety-Lok 25 3/4G x 12 &quot;; Conjunto de coleta de sangue </td><td> BD Vacutainer </td><td> 367298 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ml Sub-Q 26Seringa deslizamento Tip-5/8G </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 309597 </td><td></td></tr><tr><td> 0,5-10 ul Finnpipette II pipeta ajustável-Volume </td><td> Fisherbrand </td><td> 21-377-815 </td><td></td></tr><tr><td> 1-200 uL Naturais Dicas chanfradas </td><td> EUA Scientific, Inc. </td><td> 1111-1700 </td><td></td></tr><tr><td> Discovery.V8 microscópio estéreo </td><td> Zeiss </td><td> MC1500 </td><td></td></tr><tr><td> 60 mm x 15 mm Estilo Tratada poliestireno placa de cultura celular </td><td> Corning Incorporated </td><td> 430166 </td><td></td></tr><tr><td> Tesoura Vannas retas </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E3383 S </td><td></td></tr><tr><td> Fórceps curvas de vestir com serrilhas delicadas </td><td> Storz Ophthalmics </td><td> E1408 </td><td></td></tr><tr><td> 15 Faca Microcirurgia Grau </td><td> Wilsem Oftalmologia Corp </td><td> 091204 </td><td></td></tr><tr><td> Cetamina </td><td> Ketaset III </td><td> NADA # 45-290 </td><td></td></tr><tr><td> Xilazina </td><td> Lloyd Laboratories </td><td> NADA # 139-236 </td><td></td></tr><tr><td> Bupivacaína (Marcaine) </td><td> AstraZeneca </td><td> N / A </td><td></td></tr><tr><td> Buprenorfina </td><td> Sigma Aldrich </td><td> B9275 </td><td></td></tr></tbody></table>

subretinal injection of gene therapy vectors and stem cells in the perinatal mouse eye

A perda de visão afeta cerca de 3,4 milhões de pessoas nos Estados Unidos e deverá aumentar nos próximos anos. 1 Recentemente, a terapia genética e os transplantes de células-tronco tornaram-se importantes ferramentas terapêuticas para o tratamento da cegueira resultante de doenças degenerativas da retina. Várias formas de transplante autólogo de idade degeneração macular relacionada à (AMD), como a íris transplante de células epiteliais pigmentares, têm gerado resultados animadores, e testes clínicos em humanos começaram a outras formas de terapias com células-tronco e genética. 2 Estes incluem a substituição RPE65 gene A terapia em pacientes com amaurose congénita de Leber e um transplante de células RPE humanas utilizando estaminais embrionárias (ES) células na doença de Stargardt. 3-4 Agora que existem vectores de terapia genética e de células estaminais disponíveis para o tratamento de pacientes com doenças da retina, é importante verificar estas terapias potenciais em modelos animais antes de aplicarção deles em estudos humanos. O ratinho tornou-se um modelo importante científica para testar a eficácia terapêutica de vectores de terapia génica e transplante de células estaminais no olho. 5-8 Neste artigo de vídeo, é apresentada uma técnica de injectar vectores de terapia génica ou de células estaminais para o espaço sub-retiniano do o olho do rato, minimizando os danos para o tecido circundante.

Um desenho do olho do rato é mostrado com grandes estruturas marcadas para referência, com setas que indicam os locais para os procedimentos de injeção intravítrea e sub-retiniana, tanto cirúrgicos (pontas de seta, Figura 1). Vectores de terapia génica, tais como a lentiviral vector lacZ (Figura 2), pode ser injectada usando estes locais. Além disso, as células estaminais, como células estaminais embrionárias de rato (Figura 3), podem também ser tra...

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Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

Esta técnica cirúrgica ilustra a injecção de vectores de terapia genética e de células estaminais para o espaço sub-retiniano do olho do rato.

Injeção de sub-retiniana de Vetores da terapia genética e células-tronco no olho do rato

The loss of sight affects approximately 3.4 million people in the United States and is expected to increase in the upcoming years.1 Recently, gene therapy ...

subretinal-injection-gene-therapy-vectors-stem-cells-perinatal-mouse

Research

JoVE Journal

Medicine

32.9K visualizações.  Columbia University. Esta técnica cirúrgica ilustra a injecção de vectores de terapia genética e de células estaminais para o espaço sub-retiniano do olho do rato.

Vídeo: Subretinal Injection of Gene Therapy Vectors and Stem Cells in the Perinatal Mouse Eye

High-Efficiency Transduction of Liver Cancer Cells by Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 3 Vectors

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a number of gene therapy clinical trials. More recently, a number of additional AAV serotypes have also been isolated, which have been shown to exhibit selective tissue-tropism in various small and large animal models1. Of the 10 most commonly used AAV serotypes, AAV3 is by far the least efficient in transducing cells and tissues in vitro as well as in vivo.
However, in our recently published studies, we have documented that AAV3 vectors transduce human liver cancer - hepatoblastoma (HB) and hepatocellular carcinoma (HCC) - cell lines extremely efficiently because AAV3 utilizes human hepatocyte growth factor receptor as a cellular co-receptor for binding and entry in these cells2,3.
In this article, we describe the steps required to achieve high-efficiency transduction of human liver cancer cells by recombinant AAV3 vectors carrying a reporter gene. The use of recombinant AAV3 vectors carrying a therapeutic gene may eventually lead to the potential gene therapy of liver cancers in humans.

In this article, we describe the identification of the adeno-associated virus serotype 3 (AAV3) as the most efficient vector for targeting human liver cancer cells.

De Alta Eficiência Transdução de células de câncer de fígado por recombinante sorotipo de vírus adeno-associado 3 Vetores

Recombinant vectors based on a non-pathogenic human parvovirus, the adeno-associated virus 2 (AAV2) have been developed, and are currently in use in a ...

Medicina

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Estabelecimento e propagação de Tumores Humanos em Retinoblastoma Imune camundongos deficientes

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Production and Detection of Reactive Oxygen Species (ROS) in Cancers

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive molecules contain an oxygen and include H2O2 (hydrogen peroxide), NO (nitric oxide), O2- (oxide anion), peroxynitrite (ONOO-), hydrochlorous acid (HOCl), and hydroxyl radical (OH-).
Oxidative species are produced not only under pathological situations (cancers, ischemic/reperfusion, neurologic and cardiovascular pathologies, infectious diseases, inflammatory diseases 1, autoimmune diseases 2, etc&hellip;) but also during physiological (non-pathological) situations such as cellular metabolism 3, 4. Indeed, ROS play important roles in many cellular signaling pathways (proliferation, cell activation 5, 6, migration 7 etc..). ROS can be detrimental (it is then referred to as "oxidative and nitrosative stress") when produced in high amounts in the intracellular compartments and cells generally respond to ROS by upregulating antioxidants such as superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and glutathione (GSH) that protects them by converting dangerous free radicals to harmless molecules (i.e. water). Vitamins C and E have also been described as ROS scavengers (antioxidants).
Free radicals are beneficial in low amounts 3. Macrophage and neutrophils-mediated immune responses involve the production and release of NO, which inhibits viruses, pathogens and tumor proliferation 8. NO also reacts with other ROS and thus, also has a role as a detoxifier (ROS scavenger). Finally NO acts on vessels to regulate blood flow which is important for the adaptation of muscle to prolonged exercise 9, 10. Several publications have also demonstrated that ROS are involved in insulin sensitivity 11, 12.
Numerous methods to evaluate ROS production are available. In this article we propose several simple, fast, and affordable assays; these assays have been validated by many publications and are routinely used to detect ROS or its effects in mammalian cells. While some of these assays detect multiple ROS, others detect only a single ROS.

Production and Detection of Reactive Oxygen Species ROS in Cancers

Here we propose simple methods to test and evaluate the presence of reactive oxygen species in cells.

Produção e Detecção de Espécies Reativas de Oxigênio (ROS) em Câncer

Reactive oxygen species include a number of molecules that damage DNA and RNA and oxidize proteins and lipids (lipid peroxydation). These reactive ...

A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and acquired diseases. Apart from congenital or inherited abnormalities with the requirement for long-term expression of the delivered gene, several non-inherited perinatal conditions, where short-term gene expression or pharmacological intervention is sufficient to achieve therapeutic effects, are considered as potential future indications for this kind of approach. Candidate diseases for the application of short-term prenatal therapy could be the transient neonatal deficiency of surfactant protein B causing neonatal respiratory distress syndrome1,2 or hyperoxic injuries of the neonatal lung3. Candidate diseases for permanent therapeutic correction are Cystic Fibrosis (CF)4, genetic variants of surfactant deficiencies5 and &alpha;1-antitrypsin deficiency6.
Generally, an important advantage of prenatal gene therapy is the ability to start therapeutic intervention early in development, at or even prior to clinical manifestations in the patient, thus preventing irreparable damage to the individual. In addition, fetal organs have an increased cell proliferation rate as compared to adult organs, which could allow a more efficient gene or stem cell transfer into the fetus. Furthermore, in utero gene delivery is performed when the individual's immune system is not completely mature. Therefore, transplantation of heterologous cells or supplementation of a non-functional or absent protein with a correct version should not cause immune sensitization to the cell, vector or transgene product, which has recently been proven to be the case with both cellular and genetic therapies7.
In the present study, we investigated the potential to directly target the fetal trachea in a mouse model. This procedure is in use in larger animal models such as rabbits and sheep8, and even in a clinical setting9, but has to date not been performed before in a mouse model. When studying the potential of fetal gene therapy for genetic diseases such as CF, the mouse model is very useful as a first proof-of-concept because of the wide availability of different transgenic mouse strains, the well documented embryogenesis and fetal development, less stringent ethical regulations, short gestation and the large litter size.
Different access routes have been described to target the fetal rodent lung, including intra-amniotic injection10-12, (ultrasound-guided) intrapulmonary injection13,14 and intravenous administration into the yolk sac vessels15,16 or umbilical vein17. Our novel surgical procedure enables researchers to inject the agent of choice directly into the fetal mouse trachea which allows for a more efficient delivery to the airways than existing techniques18.

We developed a novel surgical approach for intratracheal administration of bioactive agents into the mouse fetus. The delivery route is more efficient in targeting the fetal mouse lungs than the commonly used intra-amniotic injection. This procedure has to date not been described in a mouse model.

Uma nova abordagem cirúrgica para administração intratraqueal de agentes bioativos em um modelo de camundongo Fetal

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the occurrence of subretinal hemorrhage can affect photoreceptor cell death in the detached retina. Hence, it is advantageous to create reproducible RDs without subretinal hemorrhage for evaluating photoreceptor cell death. We modified a previously reported method to create bullous and persistent RDs in a reproducible location with rare occurrence of subretinal hemorrhage. The critical step of this modified method is the creation of a self-sealing scleral incision, which can prevent leakage of sodium hyaluronate after injection into the subretinal space. To make the self-sealing scleral incision, a scleral tunnel is created, followed by scleral penetration into the choroid with a 30 G needle. Although choroidal hemorrhage may occur during this step, astriction with a surgical spear reduces the rate of choroidal hemorrhage. This method allows a more reproducible and reliable model of photoreceptor death in diseases that involve RD such as rhegmatogenous RD, retinopathy of prematurity, diabetic retinopathy, central serous chorioretinopathy, and age-related macular degeneration (AMD).

Creating experimental retinal detachments with a reproducible and sustained height of detachment, and without subretinal hemorrhage, is important for studying the pathophysiology of photoreceptor cell loss in retinal disease and evaluating potential therapeutic interventions. Here, we report such a method in detail.

Descolamento de Retina modelo em roedores por injeção sub-retiniana de hialuronato de sódio

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability in industrialized countries. Replacement of degenerated photoreceptors by cell transplantation represents a possible treatment option in future clinical applications. Indeed, recent preclinical studies demonstrated that immature photoreceptors, isolated from the neonatal mouse retina at postnatal day 4, have the potential to integrate into the adult mouse retina following subretinal transplantation. Donor cells generated a mature photoreceptor morphology including inner and outer segments, a round cell body located at the outer nuclear layer, and synaptic terminals in close proximity to endogenous bipolar cells. Indeed, recent reports demonstrated that donor photoreceptors functionally integrate into the neural circuitry of host mice. For a future clinical application of such cell replacement approach, purified suspensions of the cells of choice have to be generated and placed at the correct position for proper integration into the eye. For the enrichment of photoreceptor precursors, sorting should be based on specific cell surface antigens to avoid genetic reporter modification of donor cells. Here we show magnetic-associated cell sorting (MACS) - enrichment of transplantable rod photoreceptor precursors isolated from the neonatal retina of photoreceptor-specific reporter mice based on the cell surface marker CD73. Incubation with anti-CD73 antibodies followed by micro-bead conjugated secondary antibodies allowed the enrichment of rod photoreceptor precursors by MACS to approximately 90%. In comparison to flow cytometry, MACS has the advantage that it can be easier applied to GMP standards and that high amounts of cells can be sorted in relative short time periods. Injection of enriched cell suspensions into the subretinal space of adult wild-type mice resulted in a 3-fold higher integration rate compared to unsorted cell suspensions.

Cell transplantation represents a strategy for the treatment of retinal degeneration characterized by photoreceptor loss. Here we describe a method for enrichment of transplantable photoreceptors and their subretinal grafting into adult mice.

Transplante subretinal de células precursoras do fotoreceptor purificado MACS na retina do rato adulto

Vision impairment and blindness due to the loss of the light-sensing cells of the retina, i.e. photoreceptors, represents the main reason for disability ...

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment epithelium (RPE) cells. RPE provide critical support for photoreceptors and death or dysfunction of RPE cells is characteristic of age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of permanent vision loss in people age 55 and older. While no cure for AMD has been identified, implantation of healthy RPE in diseased eyes may prove to be an effective treatment, and large numbers of RPE cells can be readily generated from pluripotent stem cells. Several interesting questions regarding the safety and efficacy of RPE cell delivery can still be examined in animal models, and well-accepted protocols used to inject RPE have been developed. The technique described here has been used by multiple groups in various studies and involves first creating a hole in the eye with a sharp needle. Then a syringe with a blunt needle loaded with cells is inserted through the hole and passed through the vitreous until it gently touches the RPE. Using this injection method, which is relatively simple and requires minimal equipment, we achieve consistent and efficient integration of stem cell-derived RPE cells in between the host RPE that prevents significant amount of photoreceptor degeneration in animal models. While not part of the actual protocol, we also describe how to determine the extent of the trauma induced by the injection, and how to verify that the cells were injected into the subretinal space using in vivo imaging modalities. Finally, the use of this protocol is not limited to RPE cells; it may be used to inject any compound or cell into the subretinal space.

Here we present a community accepted protocol in multimedia format for subretinally injecting a bolus of RPE cells in rats and mice. This approach can be used for determining rescue potentials, safety profiles, and survival capacities of grafted RPE cells upon implantation in animal models of retinal degeneration.

Realizando Subretinal Injeções em roedores para entregar epitélio pigmentar da retina células em suspensão

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.

Estudar o cancro do pâncreas Stem características celulares para desenvolver estratégias Novo tratamento

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson's Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on animal models. The identification of PD-associated genes has led to the development of genetic PD models. Most transgenic &#945;-SYN mouse models develop gradual &#945;-SYN pathology but fail to display clear dopaminergic cell loss and dopamine-dependent behavioral deficits. This hurdle was overcome by direct targeting of the substantia nigra with viral vectors overexpressing PD-associated genes. Local gene delivery using viral vectors provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. Specific brain regions can be targeted (e.g. the substantia nigra), expression can be induced in the adult setting and high expression levels can be achieved. Further, different vector systems based on various viruses can be used. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based alpha-synuclein animal model for Parkinson&#39;s disease.

Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson&#039;s Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector

This manuscript describes how viral vector-mediated local gene delivery provides an attractive way to express transgenes in the central nervous system. The protocol outlines all crucial steps to perform a viral vector injection in the substantia nigra of the rat to develop a viral vector-based animal model for Parkinson's disease.

Desenvolvimento de um modelo de rato baseada alfa-sinucleína para a doença de Parkinson por meio de injecção estereotáxica de um vector viral recombinante adeno-associado

In order to study the molecular pathways of Parkinson&#39;s disease (PD) and to develop novel therapeutic strategies, scientific investigators rely on ...

A Step by Step Protocol for Subretinal Surgery in Rabbits

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in adults in industrially developed countries. RPE transplantation appears to be a promising therapy, as it may replace dysfunctional RPE, restore its function, and thereby vision.
Here we describe a method for transplanting a cultured RPE monolayer on a scaffold into the subretinal space (SRS) of rabbits. After vitrectomy xenotransplants were delivered into the SRS using a custom made shooter consisting of a 20-gauge metallic nozzle with a polytetrafluoroethylene (PTFE) coated plunger. The current technique evolved in over 150 rabbit surgeries over 6 years. Post-operative follow-up can be obtained using non-invasive and repetitive in vivo imaging such as spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) followed by perfusion-fixed histology.
The method has well-defined steps for easy learning and high success rate. Rabbits are considered a large eye animal model useful in preclinical studies for clinical translation. In this context rabbits are a cost-efficient and perhaps convenient alternative to other large eye animal models.

Retinal pigment epithelium (RPE) replacement strategies and gene-based therapy are considered for several retinal degenerative conditions. For clinical translation, large eye animal models are required to study surgical techniques applicable in patients. Here we present a rabbit model for subretinal surgery geared towards RPE transplantation, which is versatile and cost-efficient.

A Passo a Passo Protocolo de Cirurgia sub-retiniana em Coelhos

Age related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa, and other RPE related diseases are the most common causes for irreversible loss of vision in ...