O estudo foi apoiado por subsídios da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81960226,81760223); Fundação de Ciências Naturais da Província de Yunnan (202001AS070045,202301AY070001-011)

O protocolo experimental foi aprovado pelo Comitê de Ética e Uso de Animais da Kunming Medical University (kmmu20220945). Ratos Sprague-Dawley (SD) de ambos os sexos, 300-350 g, foram utilizados para o presente estudo.
1. Indução do modelo de HAS
<ol><li>Anestesiar os ratos com isoflurano a 2% e oxigênio a 100%. Manter a anestesia fornecendo anestesia inalatória contínua com isoflurano (1%-3%). Fixe a cabeça do rato utilizando um aparelho estereotáxico (ver Tabela de Materiais).</li>
	<li>Crie o modelo SAH seguindo as etapas abaixo.<ol><li>Insira uma agulha de microinjeção na cisterna suprasselar. Em seguida, injete sangue autólogo da artéria caudal do rato (sem anticoagulante) na cisterna suprasselar usando uma bomba de seringa (ver Tabela de Materiais).</li>
		<li>Implantar uma agulha de microinjeção no ventrículo cerebral lateral direito usando as coordenadas mencionadas: bregma, −0,8 mm; lateral, 1,4 mm; profundidade, 4 mm9. Para os grupos de HAS, injetar 0,2 mL de sangue da artéria caudal do rato. Para grupos sham, administrar o mesmo volume de solução salina isotônica (Figura 1A).</li>
	</ol></li>
</ol>2. Preparação e estabilização de fatias cerebrais
<ol><li>Anestesiar profundamente os ratos usando inalação de isoflurano a 2%. Após a decapitação, extraia todo o cérebro e mergulhe-os no líquido cefalorraquidiano artificial gelado (ACSF). NOTA: Use soluções ACSF recém-preparadas com a seguinte composição: 134 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 29 mM NaHCO3, 1,1 mM NaH 2 PO 4, 1,5 mM MgSO4, 2,5 mM CaCl 2e 10,11 mM D-Glucose (ver Tabela de Materiais). Manter um pH entre 7,3 e 7,4.</li>
	<li>Use um vibratomo (ver Tabela de Materiais) para preparar cortes cerebrais agudos com uma espessura de 200 μm dos ratos SD em ACSF gelada que é aerada com 5% CO 2 e 95% O 2 (Figura 2).</li>
	<li>Coloque os cortes cerebrais agudos de 200 μm de espessura em uma câmara de armazenamento sobre uma tela de nylon submersa em ACSF. Equilibrar a solução de ACSF com 95% de O 2 e 5% de CO2, mantendo uma faixa de temperatura de 35-37 °C. Permitir que os cortes cerebrais se estabilizem por 2 h, dando-lhes tempo para se ajustar (Figura 3).</li>
</ol>3. Marcação de pericitos em cortes cerebrais agudos com TO-PRO-3
NOTA: Os pericitos dos cortes cerebrais agudos foram marcados fluorescentemente usando o traçador TO-PRO-310.
<ol><li>Adicione o corante fluorescente TO-PRO-3 à ACSF, obtendo uma concentração final de 1 μM. Incubar as fatias cerebrais agudas à temperatura ambiente em um ambiente escuro com a ACSF contendo TO-PRO-3 por 20 min. NOTA: Lembre-se de usar luvas de látex ao manusear TO-PRO-3 para proteção.</li>
	<li>Transfira o filtro de malha de nylon, carregando as fatias cerebrais, da câmara de carga para uma câmara de enxágue de placa de 6 poços (consulte Tabela de Materiais). Permitir que os cortes cerebrais permaneçam na câmara de enxágue por 10 min (Figura 4D). NOTA: Esta etapa de enxágue encerra o processo de coloração, diminui a marcação de fundo e evita manchas inespecíficas.</li>
	<li>Enxaguar as preparações por um total de 15 min usando solução de ACSF equilibrada com uma mistura de 5% CO 2 e 95% O2. Essa etapa de enxágue interrompe a absorção do corante e minimiza a marcação de fundo (Figura 4C).</li>
</ol>4. Coloração de pericitos não vitais da microcirculação cerebral em cortes cerebrais agudos
<ol><li>Incubar fatias cerebrais pré-carregadas com TO-PRO-3 a 37 °C com isolectina B4 conjugada a Alexa Fluor 488 (FITC-ISOB4; 5 μg/mL, ver Tabela de Materiais) por 30 min em um ambiente escuro. Após a incubação, enxaguar os cortes cerebrais por 15 min em ACSF (Figura 4E).</li>
	<li>Incubar as fatias cerebrais em ACSF gaseadas com 5% CO 2 e 95% O2 como de costume. Adicionar iodeto de propídio (PI) a uma concentração de 37 μM a ambas as soluções a 37 °C. Isso rotulará os pericitos cerebrais não vitais. Incubar as preparações nesta solução de ACSF por 60 min no escuro (Figura 4F).</li>
	<li>Em seguida, lave as preparações por 15 minutos com soluções ACSF para interromper a absorção de corante e minimizar a rotulagem de fundo.</li>
</ol>5. Imagem de pericitos cerebrais vitais e não vitais em cortes cerebrais agudos
<ol><li>Transfira suavemente fatias cerebrais para pratos confocais com fundo de vidro (ver Tabela de Materiais) usando pipetas plásticas Pasteur. Recheie os pratos com solução de ACSF previamente equilibrada com 5% de CO 2 e 95% de O2. Use uma malha de ferro para fixar fatias de cérebro de rato no lugar.</li>
	<li>Transfira as placas confocais de fundo de vidro para o estágio de um microscópio confocal. Posicionar o corte cerebral agudo no fundo da placa e perfundi-lo9 com solução de ACSF equilibrada com uma mistura de O2 a 95% e CO2 a 5% durante a microscopia confocal (Figura 5A e Figura 5Ab').</li>
	<li>Visualize as células da parede da microvasculatura cortical cerebral usando uma objetiva de 40x. Capture pilhas de imagens usando software compatível (consulte Tabela de Materiais). Utilizar filtros apropriados para IB4 (excitação/emissão 460 nm/520 nm), PI (excitação/emissão 545 nm/595 nm) e TO-PRO-3 (excitação/emissão 606 nm/666 nm) (Figura 5D). NOTA: Capture imagens com os seguintes detalhes: lente objetiva DIC N1 de 40×, 3 × 12 bits: 512 × 512 pixels (0,22 × 0,22 mm), calibração: 0,42 μm/px.</li>
	<li>Identificar microvasculatura e pericitos cerebrais com base em sua rede e morfologia. Localize uma região específica contendo uma rede de microvasculatura cerebral em cada fatia cerebral e capture imagens.</li>
	<li>Observe cuidadosamente a localização das imagens para garantir a consistência nas capturas subsequentes (Figura 5B,C). Para processamento e análise posteriores, use software de análise de imagem (ImageJ) e software de edição de fotos (consulte Tabela de Materiais).</li>
</ol>

Visualização da contratilidade do pericito cerebral pós-hemorragia subaracnóidea

<ol>
	<li>Dalkara, T., Gursoy-Ozdemir, Y., Yemisci, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+microvascular+pericytes+in+health+and+disease.">Brain microvascular pericytes in health and disease.</a> Acta Neuropathologica. 122 (1), 1-9 (2011).</li><li>Dore-Duffy, P., Cleary, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+and+properties+of+pericytes.">Morphology and properties of pericytes.</a> Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 686, 49-68 (2011).</li><li>Peppiatt, C. M., Howarth, C., Mobbs, P., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+control+of+CNS+capillary+diameter+by+pericytes.">Bidirectional control of CNS capillary diameter by pericytes.</a> Nature. 443 (7112), 700-704 (2006).</li><li>Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O'Farrell, F. M., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+a+pericyte.">What is a pericyte.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 36 (2), 451-455 (2016).</li><li>Yemisci, M., Gursoy-Ozdemir, Y., Vural, A., Can, A., Topalkara, K., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericyte+contraction+induced+by+oxidative-nitrative+stress+impairs+capillary+reflow+despite+successful+opening+of+an+occluded+cerebral+artery.">Pericyte contraction induced by oxidative-nitrative stress impairs capillary reflow despite successful opening of an occluded cerebral artery.</a> Nature Medicine. 15 (9), 1031-1037 (2009).</li><li>Korte, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noradrenaline+released+from+locus+coeruleus+axons+contracts+cerebral+capillary+pericytes+via+&#945;2+adrenergic+receptors.">Noradrenaline released from locus coeruleus axons contracts cerebral capillary pericytes via &#945;2 adrenergic receptors.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. , (2023).</li><li>Hirunpattarasilp, C., Barkaway, A., Davis, H., Pfeiffer, T., Sethi, H., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperoxia+evokes+pericyte-mediated+capillary+constriction.">Hyperoxia evokes pericyte-mediated capillary constriction.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 42 (11), 2032-2047 (2022).</li><li>Neuhaus, A. A., Couch, Y., Sutherland, B. A., Buchan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+method+to+study+pericyte+contractility+and+responses+to+ischaemia+in+vitro+using+electrical+impedance.">Novel method to study pericyte contractility and responses to ischaemia in vitro using electrical impedance.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism: Official Journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2013-2024 (2017).</li><li>Gong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+TRPM4+Activity+in+cerebral+artery+myocytes+contributes+to+cerebral+blood+flow+reduction+after+subarachnoid+hemorrhage+in+rats.">Increased TRPM4 Activity in cerebral artery myocytes contributes to cerebral blood flow reduction after subarachnoid hemorrhage in rats.</a> Neurotherapeutics: The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 16 (3), 901-911 (2019).</li><li>Mai-Morente, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pericyte+mapping+in+cerebral+slices+with+the+far-red+fluorophore+TO-PRO-3.">Pericyte mapping in cerebral slices with the far-red fluorophore TO-PRO-3.</a> Bio-protocol. 11 (22), e4222 (2021).</li><li>Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nuclear+fluorescent+dye+identifies+pericytes+at+the+neurovascular+unit.">A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit.</a> Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).</li><li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationale+for+the+real-time+and+dynamic+cell+death+assays+using+propidium+iodide.">Rationale for the real-time and dynamic cell death assays using propidium iodide.</a> Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 77 (4), 399-405 (2010).</li><li>Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TO-PRO-3+iodide:+A+novel+HeNe+laser-excitable+DNA+stain+as+an+alternative+for+propidium+iodide+in+multiparameter+flow+cytometry.">TO-PRO-3 iodide: A novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry.</a> Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).</li><li>Lacar, B., Herman, P., Platel, J. C., Kubera, C., Hyder, F., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+progenitor+cells+regulate+capillary+blood+flow+in+the+postnatal+subventricular+zone.">Neural progenitor cells regulate capillary blood flow in the postnatal subventricular zone.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (46), 16435-16448 (2012).</li><li>Mai-Morente, S. P., Marset, V. M., Blanco, F., Isasi, E. E., Abudara, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nuclear+fluorescent+dye+identifies+pericytes+at+the+neurovascular+unit.">A nuclear fluorescent dye identifies pericytes at the neurovascular unit.</a> Journal of Neurochemistry. 157 (4), 1377-1391 (2021).</li><li>Hezel, M., Ebrahimi, F., Koch, M., Dehghani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propidium+iodide+staining:+a+new+application+in+fluorescence+microscopy+for+analysis+of+cytoarchitecture+in+adult+and+developing+rodent+brain.">Propidium iodide staining: a new application in fluorescence microscopy for analysis of cytoarchitecture in adult and developing rodent brain.</a> Micron (Oxford, England). 43 (10), 1031-1038 (2012).</li><li>Mathiisen, T. M., Lehre, K. P., Danbolt, N. C., Ottersen, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+perivascular+astroglial+sheath+provides+a+complete+covering+of+the+brain+microvessels:+An+electron+microscopic+3D+reconstruction.">The perivascular astroglial sheath provides a complete covering of the brain microvessels: An electron microscopic 3D reconstruction.</a> Glia. 58 (9), 1094-1103 (2010).</li></ol>

Os autores declaram não ter interesses financeiros concorrentes.

São desenvolvidas técnicas de imagem confocal de alta resolução para visualização de pericitos cerebrais vitais, pericitos cerebrais não vitais e microvasculatura em fatias cerebrais. Em cortes agudos de cérebro de ratos, o processo envolve a marcação inicial dos pericitos com TO-PRO-311, seguida por células endoteliais microvasculares com IB412; posteriormente, a identificação dos pericitos falecidos é realizada por meio do IP. Este protocolo é simples, repr...

Os pericitos cerebrais, que se distinguem por suas protuberâncias delgadas e corpos celulares salientes, circundam a microcirculação 1,2. Enquanto o aumento do fluxo sanguíneo cerebral é predominantemente impulsionado pela dilatação capilar, as artérias menores exibem taxas de dilatação mais lentas3. A contratilidade dos perócitos exerce influência sobre o diâmetro capilar e a morfologia dos pericitos, afetando a dinâmica vascular4. A contração dos pericitos cerebrais leva à constrição capilar e, em cenários patológicos, a contração excessiva pode impedir o fluxo eritrocitário5. Vários fatores, incluindo a noradrenalina liberada do locus coeruleus, podem induzir a contração do pericícito cerebral dentro dos capilares6. Com papel regulador no fluxo sanguíneo cerebral, os pericitos exibem síntese de 20-TETE, servindo como sensor de oxigênio durante a hiperóxia7. A contração dos pericitos cerebrais desencadeada pelo estresse oxidativo-nitrativo afeta negativamente os capilares5. Apesar das investigações in vivo e ex vivo sobre a contração do pericito cerebral8, persiste um conhecimento limitado sobre a obtenção de imagens de pericitos cerebrais viáveis e não viáveis em fatias cerebrais.
Crucialmente, a imagem pós-fixação tecidual dos pericitos cerebrais compromete sua vitalidade e subsequente avaliação da contratilidade. Além disso, em cenários como distúrbios neurológicos (por exemplo, hemorragia subaracnóidea - HSA), a marcação transgênica de pericitos cerebrais falha em diferenciar entre pericitos viáveis e não viáveis, como confirmado por nosso estudo preliminar de morte cerebral induzida porHAS9. 
Para superar esses desafios, empregamos o TO-PRO-3 para marcar pericitos vivos, enquanto os falecidos foram corados com iodeto de propídio (PI). Usamos tecnologias de imagem confocal de alta resolução para visualizar pericitos cerebrais viáveis e não viáveis em cortes cerebrais, preservando a atividade de cortes durante exames de imagem. Este artigo tem como objetivo apresentar um método reprodutível para obtenção de imagens de pericitos cerebrais viáveis e não viáveis em cortes cerebrais, servindo como uma ferramenta valiosa para investigar o impacto dos pericitos cerebrais na microcirculação cerebral pós-HAS.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>ABC biochemistry</td>
			<td>ABC703006</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>Adobe Illustrator CS6 16.0.0</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td>MIAOJIE</td>
			<td>225 mm x 273 mm</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2&#183;2H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3881</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal imaging software</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>NIS-Elements 4.10.00</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Laser Scanning Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>N-SIM/C2si</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas tank (5% CO2, 95% O2)</td>
			<td>PENGYIDA</td>
			<td>40L</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Confocal Dishes</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>FCFC020-10pcs</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5767</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue</td>
			<td>EVOBOND</td>
			<td>KH-502</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ice machine</td>
			<td>XUEKE</td>
			<td>IMS-20</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image analysis software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>Image J</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inhalation anesthesia system</td>
			<td>SCIENCE</td>
			<td>QAF700</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin B 4-FITC</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>L2895&#8211;2MG</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7447&#8211;40&#8211;7</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0662</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7647&#8211;14&#8211;5</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4&#183;H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10049&#8211;21&#8211;5</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>NEST Biotechnology</td>
			<td>318314</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic Pump</td>
			<td>Scientific Industries Inc</td>
			<td>Model 203</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Propidium (Iodide)</td>
			<td>Med Chem Express</td>
			<td>HY-D0815/CS-7538</td>
			<td>Store aliquots at &#8211;20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic apparatus</td>
			<td>SCIENCE</td>
			<td>QA</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard PUMP</td>
			<td>PUMP 11 ELITE Nanomite</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostatic water bath</td>
			<td>OLABO</td>
			<td>HH-2</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrating microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>VT1200</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging vital and non-vital brain pericytes in brain slices following subarachnoid hemorrhage

Os pericitos são células murais cruciais situadas dentro da microcirculação cerebral, fundamentais na modulação ativa do fluxo sanguíneo cerebral através de ajustes de contratilidade. Convencionalmente, sua contratilidade é aferida observando-se deslocamentos morfológicos e alterações no diâmetro capilar próximo em circunstâncias específicas. No entanto, a fixação pós-tecidual, avaliando a vitalidade e a consequente contratilidade dos pericitos cerebrais imageados, fica comprometida. Da mesma forma, a marcação genética de pericitos cerebrais é insuficiente na distinção entre pericitos viáveis e não viáveis, particularmente em condições neurológicas como hemorragia subaracnóidea (HSA), onde nossa investigação preliminar valida a morte de pericitos cerebrais. Um protocolo confiável foi desenvolvido para superar essas restrições, permitindo a marcação fluorescente simultânea de pericitos cerebrais funcionais e não funcionais em seções cerebrais. Este método de marcação permite a visualização em microscópio confocal de alta resolução, marcando concomitantemente a microvasculatura do corte cerebral. Este protocolo inovador oferece um meio de avaliar a contratilidade do pericito cerebral, seu impacto no diâmetro capilar e na estrutura do pericito. A investigação da contratilidade dos pericitos cerebrais no contexto da HAS permite uma compreensão perspicaz de seus efeitos na microcirculação cerebral.

Brain pericytes, distinguished by their slender protuberances and protruding cell bodies, encircle the microcirculation1,2. While cerebral blood flow augmentation is predominantly driven by capillary dilation, smaller arteries exhibit slower rates of dilation3. Pericyte contractility exerts influence over capillary diameter and pericyte morphology, impacting vascular dynamics4. Contraction of brain pericytes leads to capillary constriction, and in pathological scenarios, excessive contraction may impede erythrocyte flow5. Various factors, including norepinephrine released from the locus coeruleus, can induce brain pericyte contraction within capillaries6. With a regulatory role in cerebral blood flow, pericytes exhibit 20-HETE synthesis, serving as an oxygen sensor during hyperoxia7. Oxidative-nitrative stress-triggered contraction of brain pericytes detrimentally affects capillaries5. Despite both in vivo and ex vivo investigations into brain pericyte contraction8, limited knowledge persists regarding the imaging of viable and non-viable brain pericytes within brain slices.
Crucially, post-tissue fixation imaging of brain pericytes compromises their vitality and subsequent contractility assessment. Moreover, in scenarios such as neurological disorders (e.g., subarachnoid hemorrhage - SAH), transgenic labeling of brain pericytes fails to differentiate between viable and non-viable pericytes, as confirmed by our preliminary SAH-induced brain pericyte death study9. 
To surmount these challenges, we employed TO-PRO-3 to label live pericytes, while deceased ones were stained with propidium iodide (PI). We used high-resolution confocal imaging technologies to visualize viable and non-viable brain pericytes in brain slices while preserving slice activity during imaging. This article aims to present a reproducible method for imaging viable and non-viable brain pericytes in brain slices, serving as a valuable tool to probe the impact of brain pericytes on cerebral microcirculation post SAH.

Autor em destaque: Imagem de pericitos pós-subaracnóideos em roedores 

Imagem de Pericitos Cerebrais Vitais e Não Vitais em Fatias Cerebrais após Hemorragia Subaracnóidea

Our study showed a significant increase in pericytes deaths. So starting at a sick horse after SAH, it demonstrated a positive correlation between the number of low vital parasites and the time elapsed after SAH. Imaging vital and the non-vital brain parasites in brain slices following SAH and the parasite isolation techniques, have advanced the research in my field.Currently, it's quite difficult to fully distinguish between dead parasites and dead endothelial cells. Our study find contraction-dependent apoptosis in parasites after SAH. We have developed a very reliable protocol, which enables the fluorescent labeling, both functional and a non-functional brain parasite in brain sections, and the same time.

Em condições fisiológicas normais, os pericitos cerebrais geralmente não sofrem morte celular. A Figura 6 ilustra esse fenômeno, com amarelo indicando a presença de pericitos cerebrais vitais; os pericitos cerebrais não apresentam coloração com IP, indicando sua viabilidade. Para investigar melhor se os pericitos permanecem aderidos à microvasculatura após a morte celular, métodos foram empregados em um modelo de HAS em ratos, e imagens subsequentes foram conduzidas.
<p class...

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A investigação preliminar confirma que a hemorragia subaracnóidea (HSA) causa a morte do pericito cerebral. A avaliação da contratilidade dos pericitos pós-HAS requer diferenciação entre pericitos cerebrais viáveis e não viáveis. Assim, um procedimento foi desenvolvido para marcar pericitos cerebrais viáveis e não viáveis simultaneamente em cortes cerebrais, facilitando a observação usando um microscópio confocal de alta resolução.

Pericytes are crucial mural cells situated within cerebral microcirculation, pivotal in actively modulating cerebral blood flow via contractility ...

Nosso estudo mostrou um aumento significativo nos óbitos por pericitos. Assim, a partir de um cavalo doente após HAS, demonstrou-se uma correlação positiva entre o número de parasitas vitais baixos e o tempo decorrido após a HAS. Imagens de parasitas cerebrais vitais e não vitais em fatias cerebrais após HAS e as técnicas de isolamento de parasitas, têm avançado a pesquisa em meu campo.Atualmente, é muito difícil distinguir completamente entre parasitas mortos e células endoteliais mortas. Nosso estudo encontrou apoptose contração-dependente em parasitas após HAS. Desenvolvemos um protocolo muito confiável, que permite a marcação fluorescente, tanto funcional quanto não funcional do parasita cerebral em seções cerebrais, e ao mesmo tempo.

imaging-vital-non-vital-brain-pericytes-brain-slices-following

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Imaging Vital and Non-vital Brain Pericytes in Brain Slices following Subarachnoid Hemorrhage

702 visualizações.  The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University. Nosso estudo mostrou um aumento significativo nos óbitos por pericitos. Assim, a partir de um cavalo doente após HAS, demonstrou-se uma correlação positiva entre o número de parasitas vitais baixos e o tempo decorrido após a HAS. Imagens de parasitas cerebrais vitais e não vitais em fatias cerebrais após HAS e as técnicas de isolamento de parasitas, têm avançado a pesquisa em meu campo.Atualmente, é muito difícil distinguir completamente entre parasitas mortos e células e...

Vídeo: Autor em destaque: Imagem de pericitos pós-subaracnóideos em roedores 

Pericytes are crucial mural cells situated within cerebral microcirculation, pivotal in actively modulating cerebral blood flow via contractility adjustments. Conventionally, their contractility is gauged by observing morphological shifts and nearby capillary diameter changes under specific circumstances. Yet, post-tissue fixation, evaluating vitality and ensuing pericyte contractility of imaged brain pericytes becomes compromised. Similarly, genetically labeling brain pericytes falls short in distinguishing between viable and non-viable pericytes, particularly in neurologic conditions like subarachnoid hemorrhage (SAH), where our preliminary investigation validates brain pericyte demise. A reliable protocol has been devised to surmount these constraints, enabling simultaneous fluorescent tagging of both functional and non-functional brain pericytes in brain sections. This labeling method allows high-resolution confocal microscope visualization, concurrently marking the brain slice microvasculature. This innovative protocol offers a means to appraise brain pericyte contractility, its impact on capillary diameter, and pericyte structure. Investigating brain pericyte contractility within the SAH context yields insightful comprehension of its effects on cerebral microcirculation.

The preliminary inquiry confirms that subarachnoid hemorrhage (SAH) causes brain pericyte demise. Evaluating pericyte contractility post-SAH requires differentiation between viable and non-viable brain pericytes. Hence, a procedure has been developed to label viable and non-viable brain pericytes concurrently in brain sections, facilitating observation using a high-resolution confocal microscope.

Neurociência

Induction of the Murine Subarachnoid Hemorrhage Model and Brain Slice Preparation for Fluorescent Imaging

To create the subarachnoid hemorrhage, or SAH model, insert a microinjection needle into an anesthetized rat's suprasellar cistern. With a syringe pump, inject autologous blood acquired from the rat's tail artery into the suprasellar cistern. Now implant another needle into the right lateral cerebral ventricle at the given coordinates.For the SAH models, inject 0.2 milliliters of rat tail artery blood. For the SHAM groups, inject the same volume of isotonic saline. After decapitation, extract the rat's entire brain and submerge them in ice cold artificial cerebral spinal fluid or ACSF.With a vibratome, prepare acute brain slices of 200 micrometers and ice cold equilibrated ACSF. Place the brain slices on a nylon mesh, immersed in equilibrated ACSF in a storage chamber at 35 to 37 degrees Celsius.

Indução do Modelo de Hemorragia Subaracnóidea Murina e Preparo de Fatias Cerebrais para Imagem Fluorescente

Labeling and Staining Rat Brain Pericytes for Fluorescent Imaging

To label the pericytes, add the fluorescent dye TO-PRO-3 to the artificial cerebral spinal fluid or ACSF. Now incubate the freshly sliced rat brain in the dye-laden ACSF for 20 minutes in a dark environment at room temperature. Next, transfer the nylon mesh strainer with the brain slices to a six-well plate rinsing chamber.Let the brain slices rest in the chamber for 10 minutes. To label the non-vital pericytes, incubate the TO-PRO-3 tagged brain slices in conjugated isolectin B4 at 37 degrees Celsius for 30 minutes in the dark. After incubation, rinse the brain slices in artificial cerebral spinal fluid for 15 minutes.Next, place the brain slices in ACSF gassed with 5%carbon dioxide and 95%oxygen. To this, add propidium iodide at a concentration of 37 micromolar at 37 degrees Celsius. To halt the dye uptake and minimize the background labeling, rinse the preparations for 15 minutes in ACSF.Under normal physiological conditions, brain pericytes do not experience cell death. Viable pericytes that were not stained with propidium iodide were detected. The SAH models should vital pericytes within microvasculature.Non-vital pericytes were also detected. Propidium iodide-labeled non-vital pericytes remained attached to the entire microvasculature.

Marcação e coloração de pericitos cerebrais de ratos para imagens fluorescentes

Confocal Imaging of Vital and Non-Vital Pericytes in Rat Acute Brain Slices

To begin, use a plastic Pasteur pipette to gently transfer the fluorescently stained brain slices to glass bottom confocal dishes. Fill these dishes with equilibrated ACSF. With an iron mesh, secure the rat brain slices in place.Next, place the glass bottom confocal dishes onto the stage of a confocal microscope. Position the acute brain slice at the bottom of the dish and perfuse with equilibrating ACSF during imaging. Using the 40X objective, view the wall cells of the cerebral cortical microvasculature.Next, use compatible software to capture image stacks. Identify cerebral microvasculature and pericytes based on their network and morphology, then locate a specific region containing a cerebral microvasculature network on each brain slice and capture images. Under normal physiological conditions, brain pericytes do not experience cell death.Viable pericytes that were not stained with propidium iodide were detected. The SAH models showed vital pericytes within microvasculature. Non-vital pericytes were also detected.Propidium iodide labeled non-vital pericytes"remained detached to the entire microvasculature.