Este trabalho foi parcialmente financiado por números de concessão JSPS KAKENHI 24700349, 24659093, 25293239, JP18H02536 e 17 K 07086, números de concessão MEXT KAKENHI 25110737 e 23110525, AMED Grant número JP18ek0109311 e o SENSHIN Medical Research Foundation e o Japão Fundação de pesquisa da epilepsia.

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de uso de Tokyo Metropolitan Instituto de ciência médica e cuidado Animal. Pós-natal, 8 - 16 semanas os ratos são recomendados. Toda a tensão pura é aceitável para o experimento. Camundongos C57Bl/6 são mais resistentes a PTZ, Considerando que BALB/c e Swiss ratos albinos são mais sensíveis a PTZ. C57Bl/6 foram utilizados neste estudo. Vulnerabilidade de PTZ também depende da idade do rato. Em comparação aos mais jovens ratos, ratos mais velhos são mais refratários a PTZ35. O número de animais utilizados para este método pode variar, mas pelo menos 6 a 10 animais são necessários para cada condição.
1. preparação de PTZ
<ol><li>Dissolva 2 mg/mL PTZ em estéril 0,9% NaCl (p/v). Prepare PTZ no dia do uso.</li>
</ol>2. injeção de PTZ
<ol><li>Execute todas as experiências entre 09:00 e 12:00 (meio dia).</li>
	<li>Medir o peso do corpo do animal.</li>
	<li>Coloque o animal em uma câmara de observação para habituação.</li>
	<li>Durante o período de habituação (3 min), calcule o volume de solução PTZ para a injeção com base no peso do corpo do animal e a dose de injeção previamente determinada. Nota: por exemplo, quando é usada a 35mg/kg PTZ, 0,875 mg de PTZ é necessário para um rato pesando 25g (35 mg / kg x 0,025 kg = 0.875 mg). Portanto, deve ser injetada 437.5 μL de uma solução PTZ de 2 mg/mL (0.875 mg/2 mg / mL = 0,4375 mL). A dose de injeção de PTZ depende do genótipo do rato e tensão. Para camundongos C57BL/6 de tipo selvagem, recomenda-se uma dose de 30-35 mg PTZ/kg de peso corporal para o primeiro julgamento. Sensibilidade-PTZ depende o rato estirpes utilizadas36,37. A dose de injeção varia de acordo com a finalidade do experimento.</li>
	<li>Injete PTZ intraperitonealmente com uma seringa de 1 mL, conectada a uma agulha de calibre 27 ao quadrante esquerdo ou direito do abdômen do animal. Evite a injectar na linha.<ol>
<li>Evite injeções repetidas na mesma posição.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Observar comportamentos animais por 30 min após a administração de PTZ (figura 1A) e classificar e marcar o comportamento anormal, como mostrado abaixo. Se possível, manter os animais em observação por 24 h, ou pelo menos uma injeção de pós adicionais 6-10 h, especialmente quando o escore de severidade de apreensão atinge 3 ou acima.<ol>
<li>Observe quaisquer apreensões suaves ou mudanças comportamentais nos animais para além do período de observação de 30 min. Esta prolongada observação período pode dirigir um efeito particularmente importante e completo de um subconvulsive dose de PTZ na geração de crônicas não provocadas convulsões em epilepsia.</li>
		<li>Além disso, medida a duração de apreensão de cada apreensão observada como alterações na duração da convulsão referem-se a gravidade do ataque. Além disso, a latência para a primeira convulsão após a injeção de PTZ é outra medida importante para coletar. A latência, duração e frequência de apreensão de monitoramento é fundamental para qualquer estudos moleculares após um ataque.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injete PTZ cada outro dia (figura 1A). O número de injeções varia de acordo com o objetivo do experimento. Estes são exemplos representativos.<ol>
<li>Para gerar animais completamente acendeu, uma vez que um animal experimenta um ataque com uma pontuação de 5 (tónico-clónica), termine a injeção nas três administrações adicionais. Neste caso, aumente a dose de injeção se o escore de apreensão não aumenta para três administrações consecutivas. Cada animal pode receber um número diferente e dose de injecções de PTZ.</li>
		<li>Fixa o número e a dose de injeção de PTZ em todas as condições para avaliar a vulnerabilidade de PTZ, incluindo avaliações de antidrogas epilepsia e estudos do fenótipo de camundongos geneticamente modificados. Dar a todos os animais o mesmo número de injeções de PTZ; recomenda-se um total de 8 a 12 injeções. Se um animal morre, a pontuação de ataque deve ser classificada com 6.</li>
		<li>Determinar a dose de injeção necessária para manter uma convulsão de alta pontuação (4 ou 5) para 10 ou mais injeções estudar as alterações histopatológicas que ocorrem ataques epilépticos. Neste caso, o número total de injeção deve variar de 25 a 30. Diminua a dose da injeção, se a pontuação de ataque atinge 5. Se a pontuação de ataque diminui para 3 ou mais baixo, aumente a dose de injeção.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. apreensão Pontuação
<ol><li>Observar os comportamentos animais e gravar os resultados.<ol>
<li>Classificar e marcar os comportamentos epilépticos como segue38,39 (figura 1B): 0: comportamento normal, nenhuma anormalidade. 1: imobilização, deitado de barriga. 2: cabeça acenando, facial, membro anterior ou membro posterior mioclonia. 3: mioclonia contínua de todo o corpo, Mioclônicas empurrões, rabo preso rigidamente. 4: criação, tônico apreensão, caindo de lado. 5: tônico-clônica, caindo nas suas costas, selvagem, correndo e pulando. 6: morte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Altere os critérios comportamentais com base na Racine Pontuação40, dependendo das condições experimentais.</li>
</ol>4. após um ataque análise
<ol><li>Análise de Immunohistopathological<ol>
<li>Fixação de perfusão<ol>
<li>Preparação<ol>
<li>Dissolva o paraformaldeído 4% (p/v) (PFA) em tampão de fosfato 0,1 M (pH 7,4). Aquece a solução a cerca de 70 ° C com a adição de uma gota de 1 M de NaOH (aproximadamente 1 µ l de 1 M NaOH para 50 mL de solução de PFA).</li>
				<li>Preparar o gelado 4% PFA e tampão fosfato salino (PBS).</li>
				<li>Configure uma bomba peristáltica, com um tubo e agulha. Execute cerca de 20 mL de água através do tubo para limpar resíduos. Em seguida, coloque a extremidade aberta do tubo em PBS gelado.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Transcardial perfusão e preparação do cérebro fixa<ol>
<li>Anestesia profundamente o mouse com etanol a 50% isoflurane/50% em um pequeno pote.</li>
				<li>Mantenha o mouse na posição supina fixando as pontas de suas patas dianteiras e os membros traseiros.</li>
				<li>Corte da linha mediana ventral do abdômen e expor o diafragma.</li>
				<li>Corte o diafragma ao longo da margem costal. Em seguida, corte ambas as partes laterais das costelas e corpo. Beliscar o processo xifoide pela pinça de bloqueio e evert a caixa torácica. Manter a posição do processo xifoide, fixando-o com uma agulha ou Beliscá-lo com pinça. Expor o coração.</li>
				<li>Insira a agulha no ventrículo esquerdo e fazer um corte no átrio direito com uma tesoura. Estar ciente para não empurrar a agulha longe demais para o coração, como ele pode furar uma parede interior.</li>
				<li>Iniciar um fluxo constante de PBS gelado através da agulha para lavar o sangue (aproximadamente 15-20 mL/min).</li>
				<li>Quando o sangue foi limpo do corpo, mova o tubo para uma solução de paraformaldeído 4% (cerca de 60 mL) sem a adição de bolhas. Em seguida, pare a perfusão.</li>
				<li>Cortar o pescoço traseiro e espinha e retire a pele da cabeça e a parte dorsal do crânio com tesoura de dissecação.</li>
				<li>Corte o osso pré-maxilar entre as órbitas oculares e remover completamente a porção dorsal do crânio.</li>
				<li>Criar um fosso entre o cérebro e o osso jugal do lado posterior e cortar os nervos trigêmeo e quiasma óptico em baixo do cérebro. Retire o cérebro cuidadosamente e colocá-lo em um frasco contendo 4% PFA. Fixe o cérebro a 4 ° C, durante 12-16 h.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Preparação de fatia do cérebro<ol>
<li>Transferi o cérebro fixo de 20% sacarose/PBS até o cérebro afunda-se na solução para permitir a cryoprotection.</li>
			<li>Corte o cérebro fixo baseado na fatia necessária orientação e uma parte necessária do cérebro.</li>
			<li>Defina o cryomicrotome. Coloque a lâmina na posição e manter a fase de micrótomo em uma temperatura abaixo dos-20 ° C.</li>
			<li>Coloque o cérebro pré-cortados no palco e revestir o cérebro com 20% de sacarose/PBS. A solução de sacarose/PBS gradualmente irá congelar, cobrindo o cérebro no palco, até que o cérebro está completamente incorporado no congelado 20% sacarose/PBS.</li>
			<li>Corte o cérebro (30 µm de espessura) deslizando a lâmina através do tecido. Transfira as fatias em PBS e mantê-los em 4 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Imuno-histoquímica fluorescente<ol>
<li>Lave as fatias necessárias em 0,1% Triton X-100/PBS (PBST) durante 10 minutos, 3 vezes a temperatura ambiente (RT).</li>
			<li>Bloquear as fatias incubando-os em PBST com 2% cabra soro ou 5% albumina de soro bovino (BSA) para 1-2 h em RT</li>
			<li>Incubar as fatias em uma solução de anticorpos com a concentração adequada de anticorpo primário em PBST com 2% cabra soro ou 5% BSA para pernoites de 1 a 7 a 4 ° C.</li>
			<li>Lave as fatias em PBST durante 10 minutos, 3 vezes a RT</li>
			<li>Incube as fatias em uma solução de anticorpo secundário com a concentração adequada de anticorpo secundário em PBST por 1-2 h em RT, protegido de luz.</li>
			<li>Monte as fatias em lâminas de vidro e cubra com meio de montagem e cobertura de vidro.</li>
			<li>Observe as fatias com microscopia de fluorescência.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Teste da três-câmara<ol>
<li>Preparação<ol>
<li>Preparar pelo menos 2 2 - ratos de 129/Sv 6 meses de idade do mesmo sexo como os ratos de assunto para ser o "mouse estranho." Se habituar todos os ratos na gaiola antes da análise. Para cada sessão de treino, coloque o rato na gaiola e deixar o mouse por 15 min.</li>
			<li>Antes de cada fase de habituação com o mouse do assunto, limpe todo o aparelho e as duas gaiolas por limpar a superfície com etanol a 70%.</li>
			<li>Coloque as gaiolas vazias nos aposentos de aparato 3-câmara dois lado e abra as portas entre as câmaras.</li>
			<li>Para se habituar o mouse do assunto, colocar um rato do assunto na câmara de centro e permitir o mouse para mover-se livremente em todo o aparelho até que o mouse tem investigado as duas gaiolas, além de um adicional de 5 min. animais de assunto que podem ter medo da gaiola que não investigar a gaiola por 20 min e não deve ser usado para esta análise. Esses animais evitar a gaiola e raramente perto da gaiola.</li>
			<li>Depois que o animal move-se para a câmara de centro, feche as portas e deixe o mouse mover-se livremente na câmara centro por 5 min. Durante este período, colocar um dos 129/Sv ratos em uma gaiola para se habituar a gaiola.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Análise de sociabilidade<ol>
<li>Realizar esta análise imediatamente após o período de habituação do mouse assunto.</li>
			<li>Coloque a gaiola contendo um rato 129/Sv, denominado "gaiola de estranho 1", em uma das câmaras de lado e coloque a gaiola vazia, denominada "gaiola de objeto", na câmara do outro lado.</li>
			<li>Abra a porta e monitorar o comportamento do mouse assunto.</li>
			<li>Permitir que o mouse assunto mover-se livremente por 10 min e gravar os seguintes parâmetros comportamentais. Se o mouse do assunto tem medo do rato na gaiola 1 estranho, conforme indicado pelo mouse evitando a forasteiro 1 gaiola e permanecendo no canto de uma das câmaras, o animal não deve ser usado para a análise. a) o tempo gasto em cada câmara, a câmara 1 estranho, a câmara de objeto e câmara do centro. b) o tempo gasto investigando cada gaiola, a gaiola do estranho 1 e a gaiola de objeto. (O rato é classificado como a gaiola a investigar se o mouse está cheirando ou toughing o mouse ou gaiola) c) o número de entradas em cada câmara (opcional) d) total distância percorrida (opcional)</li>
			<li>Depois que o mouse se move para a câmara de centro, feche as portas.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Análise social novidade<ol>
<li>Realizar esta análise imediatamente após a análise da sociabilidade.</li>
			<li>Limpe as duas gaiolas com etanol a 70%.</li>
			<li>Coloque outro rato 129/Sv em uma das gaiolas, denominadas "Gaiola de estranho 2" e gaiola de lugar a 2 de estranho em uma das câmaras. Coloque o mouse estranho 1 na outra gaiola, denominada "gaiola estranho 1" e coloque a gaiola 1 estranho na outra câmara.</li>
			<li>Abra a porta e monitorar o comportamento do mouse assunto.</li>
			<li>Permitir que o mouse do assunto se mover livremente por 10 min e medir os mesmos parâmetros comportamentais descritos para a análise de sociabilidade. Nota: O mouse estranho 1 e 2 de estranho deve ser escolhido aleatoriamente. A câmara de estranho 1 e câmara de objeto, bem como o estranho 1 câmara e câmara estranho 2 devem ser determinados aleatoriamente.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Discriminação do medo contextual<ol>
<li>Condicionado<ol>
<li>Antes de cada tentativa de condicionamento, limpe o aparato experimental por limpar a superfície com etanol a 70%.</li>
			<li>Coloque um rato em um aparelho de condicionamento com condições específicas (forma de aparelho, cor da parede, material do piso, odor, iluminação e volume do ruído de fundo devem ser pre-determinadas). Por exemplo, o aparelho de condicionamento utilizado aqui foi um aparato quadrado com paredes claras do plexiglás, um piso de grade metálica, um odor de etanol, brilho de 100 lux e ruído de 65 dB de fundo branco.</li>
			<li>Condicionar o mouse pelo pé-choque com sincronismo pseudo-aleatório de choques elétricos de 0.1-mA por 2 s x 3 vezes ao longo de 5 min.</li>
			<li>Retorne o rato da gaiola para casa após condicionamento.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Avaliação de memória<ol>
<li>Antes de cada avaliação, limpe o aparato experimental por limpar a superfície com etanol a 70%.</li>
			<li>No dia seguinte seguir condicionado, posicione o mouse no interior do aparelho mesmo como condição de choque e medir o tempo de congelação ao longo de 5 min.</li>
			<li>Mais tarde no mesmo dia, coloque o mouse em um novo aparelho e medir o tempo de congelação durante uma avaliação de 5 min. Um aparelho triangular com paredes brancas do plexiglás, assoalho da placa, sem odor, brilho de 30 lux e ruído de 70 dB branco foi usado aqui.</li>
			<li>Compare o tempo de congelação entre a mesma condição e a condição de romance. Os ratos com uma capacidade de memória normal congelará mais nas mesmas condições do que na condição de romance. O congelamento é definida imobilidade do animal para mais de 2 s.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

Os autores declaram não há conflitos de interesse.

Aqui, apresentamos um protocolo amplamente acessível para o estabelecimento de um modelo animal farmacológico de epilepsia. Mediada por PTZ inflamação química tem uma longa história e é um modelo comumente aceitado para o estudo da patologia celular e histopatologia de epilepsia41. O modelo de inflamação química da epilepsia tem sido avaliado anteriormente por Suzdak e Jansen, 199542. Indução de convulsão farmacológica, especialmente com PTZ, é um método fá...

Epilepsia é uma doença neurológica crônica que se caracteriza por convulsões recorrentes e afeta aproximadamente 1% das pessoas. Os mecanismos subjacentes da geração epileptogenesis e apreensão em pacientes de epilepsia não podem ser totalmente esclarecidos em estudos clínicos. Portanto, um modelo animal adequado é necessário para o estudo da epilepsia1.
Uma variedade de modelos animais de epilepsia têm sido utilizados para investigar a fisiologia da epilepsia e para identificar a droga anti-epiléptica2,3. Entre estes modelos, indução farmacológica convulsão é um método comum usado para gerar um modelo animal para a investigação da patologia de epilepsia4. Este método é simples e barato. Inflamação mediada por eletrodo também é um método comumente usado, mas os custos deste procedimento são mais elevados, e o método requer habilidades cirúrgicas e elétricas para induzir convulsões repetitivas5.
Indução farmacológica também é vantajosa porque o calendário e o número de apreensões são facilmente controladas. Modelos de genética do rato que apresentam convulsões espontâneas também são usados no estudo da epilepsia. No entanto, prever quando e quantas vezes as convulsões surgem nesses modelos genéticos pode ser impossível6. Um sistema de monitoramento é necessário para observar o comportamento epiléptico de camundongos geneticamente modificados6.
Ácido Kainic, pilocarpina e mielinização (PTZ) são amplamente utilizados como indutora de apreensão de drogas7. O ácido Kainic é um agonista de receptores de glutamato, e pilocarpina ativa receptores colinérgicos. PTZ é um ácido gama aminobutírico (GABA)-um antagonista de receptor8. PTZ suprime a função de sinapses inibitórias, levando ao aumento da atividade neuronal. Este regulamento causa convulsões generalizadas em animais9. Uma única injeção de ácido kainic e Pilocarpina pode induzir convulsões agudas, especialmente estado de mal epiléptico (SE)10,11 e kainic ácido ou pilocarpina-mediada SE promove convulsões espontâneas e recorrentes crônicas12 , 13. gravações eletroencefalográficos (EEG) e análise do comportamento têm indicado que a espontâneas convulsões recorrentes são observadas um mês após uma única injeção de12,13. Uma única injeção de uma dose convulsiva de PTZ também induz convulsão aguda. No entanto, crônicas espontâneas convulsões após uma única injeção de PTZ são difíceis de promover. Administração crônica de PTZ é necessária para induzir convulsões repetitivas14. Em ambos os métodos, a geração de convulsões repetitivas é capaz de induzir a uma patologia mais semelhante da epilepsia humana do que a geração de crises agudas. No caso de PTZ, cada injeção evoca uma convulsão, e severidade de apreensão torna-se mais grave, de forma gradual, com cada injeção. Finalmente, uma única injeção de baixa dose PTZ induz uma severa convulsão tônico-clônica. Nesta fase, cada injeção evoca convulsões graves. Além disso, a duração e a latência de apreensão também mudam ao longo das injeções. A latência de convulsão tônico muitas vezes torna-se mais curta na última fase de acender15. Além disso, agravamento de convulsão é acompanhado por uma apreensão prolongada duração16. Investigar o mecanismo molecular que regula a gravidade do ataque, latência e duração é útil para triagem droga anti-epiléptica17,18,19.
As convulsões comumente são induzidas por uma única administração sistémica de PTZ, e a recuperação é muito rápida, dentro de 30 min4,5. Assim, o número de apreensões é mais controlável no modelo PTZ-gravetos. No entanto, monitorização de EEG indicou que picos generalizados podem ser vistos até 12 h após apreensão mediada por PTZ20. Portanto, animais de preferência devem permanecer em observação por 24 h após a convulsão tônico ou Mioclônicas21 para análise mais precisa dos mecanismos de inflamação.
A administração de fármacos antiepiléptico, como etossuximida, valproato, fenobarbital, vigabatrina e retigabine3, antes ou após a injeção de PTZ atenua o agravamento do ataque gravidade3,22, 23. Da mesma forma, ratos do KO que falta genes envolveram na exacerbação de apreensão, tais como matriz metaloproteinase-9,24, FGF-2225 e neuritin26, foram mostrados para expor a gravidade reduzida convulsão após múltiplas injecções de PTZ. Além disso, observar alterações histopatológicas após ataques epilépticos é possível com este método. Em pacientes com epilepsia do lobo temporal, existem alterações histológicas típicas no cérebro, tais como fibra musgosa brotando de27,28, grânulo anormal neurônio migração29, astrogliosis30celular neuronal morte no hipocampo31,32e esclerose hippocampal33. Alterações semelhantes são observadas em animais modelo epiléptica. Entre os métodos disponíveis, mediada por PTZ inflamação química é um método bom, Reproduzível e baixo custo para produzir um modelo animal de epilepsia. Em um modelo SE mediada por pilocarpina, controle de crises é difícil e muitos ratos morrem ou deixam de desenvolver-SE34. Em contraste, mortalidade e gravidade de apreensão são mais controláveis no modelo de PTZ. Além disso, PTZ é menos caro do que o ácido kainic, e habilidades na cirurgia de cérebro de rato não são necessárias para a administração de drogas.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pentylenetetrazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>MANAC</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse</td>
			<td>CLEA Japan</td>
			<td></td>
			<td>C57Bl/6NJcl, postnatal 8 week, male</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (1mL)</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SS-01T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle(27G x 3/4&#34;) (0.40 x 19 mm)</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>NN-2719S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weighing scale</td>
			<td>Mettler</td>
			<td>PE2000</td>
			<td>This item is a discontinued product. Almost equivalent to FX-2000i with FXi-12-JA from A&#38;D company.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>31511-05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristatic pump</td>
			<td>ATTO</td>
			<td>SJ1211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>nacalai tesque</td>
			<td>30404-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Yamato</td>
			<td>REM-700</td>
			<td>This item is a discontinued product. Almost equivalent to REM-710</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blade</td>
			<td>Feather</td>
			<td>S35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-synaptoporin antibody</td>
			<td>Synaptic systems</td>
			<td>102 002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-ZnT3 antibody</td>
			<td>Synaptic systems</td>
			<td>197 002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-doublecortin</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-8066</td>
			<td>This item is a discontinued product. We did not test equivalent product (sc-271390).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contextual fear discrimination test apparatus</td>
			<td>O&#39;hara</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Three chamber test apparatus</td>
			<td>Muromachi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pentylenetetrazole-induced kindling mouse model

Mielinização (PTZ) é um antagonista dos receptores GABA-A. Uma injeção intraperitoneal de PTZ em um animal induz uma convulsão aguda, grave em uma dose alta, Considerando que injeções sequenciais de uma dose de subconvulsive têm sido utilizadas para o desenvolvimento da química kindling, um modelo de epilepsia. Uma única injeção de baixas doses de PTZ induz uma convulsão leve sem convulsão. No entanto, injeções de baixas doses repetitivas de PTZ diminuem o limiar para evocar um ataque convulsivo. Finalmente, administração contínua de baixa dose de PTZ induz uma severa convulsão tônico-clônica. Este método é simples e amplamente aplicável para investigar a fisiopatologia da epilepsia, que é definida como uma doença crônica que envolve ataques repetitivos. Este produto químico acender protocolo causa convulsões repetitivas em animais. Com este método, estimou-se a vulnerabilidade a ataques mediada por PTZ ou o grau de agravamento de crises epilépticas. Estas vantagens levaram à utilização desse método para triagem de droga anti-epiléptica e genes relacionados com epilepsia. Além disso, este método utilizou-se para investigar o dano neuronal após ataques epiléticos, porque as alterações histológicas observadas no cérebro de pacientes epilépticos também aparecem nos cérebros dos animais acendeu o produto químico. Assim, este protocolo é útil para produzir convenientemente modelos animais de epilepsia.

Injeção repetitiva de PTZ induz um aumento na severidade de apreensão. Seis camundongos C57BL/6 foram tratados com PTZ, e outro de 6 ratos foram tratados com soro fisiológico como um grupo de controle. A dose PTZ foi 35 mg/kg e 10 injeções foram administradas. A pontuação de ataque aumentado gradualmente com injeções de PTZ, Considerando que sem convulsões ou comportamentos anormais foram evocados por injeções de solução Salinas (Figura 2). ANO...

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Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

Este protocolo descreve um método de inflamação química com mielinização e fornece um modelo do rato da epilepsia. Este protocolo também pode ser usado para investigar a vulnerabilidade à indução de convulsões e patogênese após crises epilépticas em ratos.

Inflamação induzida pela mielinização Mouse modelo

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

pentylenetetrazole-induced-kindling-mouse-model

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Pharmacology

Neuroscience

Unit 1

Pharmacotherapy of the Epilepsies

SCIENTISTS IN ACTION

32.2K visualizações.  Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science. Este protocolo descreve um método de inflamação química com mielinização e fornece um modelo do rato da epilepsia. Este protocolo também pode ser usado para investigar a vulnerabilidade à indução de convulsões e patogênese após crises epilépticas em ratos.

Vídeo: Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Múltiplas mouse-Imagem por Ressonância Magnética neuroanatômicos

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Neurociência

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer's Disease Mouse Model

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks of Alzheimer's disease. The central component of neuritic plaques is a small filamentous protein called amyloid &beta; protein (A&beta;)1, which is derived from sequential proteolytic cleavage of the beta-amyloid precursor protein (APP) by &beta;-secretase and &gamma;-secretase. The amyloid hypothesis entails that A&gamma;-containing plaques as the underlying toxic mechanism in AD pathology2. The postmortem analysis of the presence of neuritic plaque confirms the diagnosis of AD. To further our understanding of A&gamma; neurobiology in AD pathogenesis, various mouse strains expressing AD-related mutations in the human APP genes were generated. Depending on the severity of the disease, these mice will develop neuritic plaques at different ages. These mice serve as invaluable tools for studying the pathogenesis and drug development that could affect the APP processing pathway and neuritic plaque formation. In this protocol, we employ an immunohistochemical method for specific detection of neuritic plaques in AD model mice. We will specifically discuss the preparation from extracting the half brain, paraformaldehyde fixation, cryosectioning, and two methods to detect neurotic plaques in AD transgenic mice: immunohistochemical detection using the ABC and DAB method and fluorescent detection using thiofalvin S staining method.

Detection of Neuritic Plaques in Alzheimer&#039;s Disease Mouse Model

One of the pathological characteristics of AD is the formation of Amyloid &#x03B2; protein positive neuritic plaques. In this protocol we describe two methods to detect neuritic plaques in transgenic AD model mice: immunohistochemical detection using the ABC and DAB method and fluorescent detection using thioflavin S staining method.

Detecção de placas neuríticas no rato da doença de Alzheimer Modelo

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disorder leading to dementia. Neuritic plaque formation is one of the pathological hallmarks ...

Methods for Intravenous Self Administration in a Mouse Model

Animal models have been developed to study the reinforcing effects of drugs, including the intravenous self-administration (IVSA) paradigm. The advantages of using an IVSA paradigm to study the reinforcing properties of drugs of abuse such as cocaine include the fact that the drug is self-administered instead of experimenter-administered, the schedule of reinforcement can be altered, and accurate measurement of the quantities of drug consumed as well as the timing and pattern of IV injections can be obtained. Furthermore, the intravenous route of administration avoids potential confounds related to first pass metabolism or taste, and produces rapid increases in blood and brain drug levels. As outlined in this video, intravenous self-administration can be obtained without prior food restriction or prior drug training following careful catheter placement during surgery and meticulous daily catheter flushing and maintenance. Experimental procedures outlined in this paper include a description of animal housing and acclimation methods, operant training using sweetened milk solutions, and catheter implantation surgery.

The intravenous self-administration (IVSA) paradigm is considered to be the gold standard in examining the reinforcing properties of drugs of abuse in rodents. This manuscript outlines the experimental procedures and surgical techniques necessary to obtain reliable IVSA data. In particular, meticulous catheter implantation and maintenance are highlighted.

Métodos de auto-administração intravenosa em um modelo de camundongo

Animal models have been developed to study the reinforcing effects of drugs, including the intravenous self-administration (IVSA) paradigm. The advantages ...

Trypsin Digest Protocol to Analyze the Retinal Vasculature of a Mouse Model

Trypsin digest is the gold standard method to analyze the retinal vasculature 1-5. It allows visualization of the entire network of complex three-dimensional retinal blood vessels and capillaries by creating a two-dimensional flat-mount of the interconnected vascular channels after digestion of the non-vascular components of the retina. This allows one to study various pathologic vascular changes, such as microaneurysms, capillary degeneration, and abnormal endothelial to pericyte ratios. However, the method is technically challenging, especially in mice, which have become the most widely available animal model to study the retina because of the ease of genetic manipulations 6,7. In the mouse eye, it is particularly difficult to completely remove the non-vascular components while maintaining the overall architecture of the retinal blood vessels. To date, there is a dearth of literature that describes the trypsin digest technique in detail in the mouse. This manuscript provides a detailed step-by-step methodology of the trypsin digest in mouse retina, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

Trypsin digest is one of the most commonly used methods to analyze retinal vasculature. This manuscript describes the method in detail, including key alterations to optimize the technique and remove the non-vascular tissue while preserving the overall architecture of the vessels.

Tripsina Digest protocolo para analisar a vascularização da retina de um rato modelo

Trypsin digest is the gold standard method to analyze the retinal vasculature 1-5. It allows visualization of the entire network of complex ...

The Corneal Micropocket Assay: A Model of Angiogenesis in the Mouse Eye

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets containing specific growth factors that trigger blood vessel growth throughout the naturally avascular cornea, angiogenesis can be measured and quantified. In this assay the angiogenic response is generated over the course of several days, depending on the type and dose of growth factor used. The induction of neovascularization is commonly triggered by either basic fibroblast growth factor (bFGF) or vascular endothelial growth factor (VEGF). By combining these growth factors with sucralfate and hydron (poly-HEMA (poly(2-hydroxyethyl methacrylate))) and casting the mixture into pellets, they can be surgically implanted in the mouse eye. These uniform pellets slowly-release the growth factors over five or six days (bFGF or VEGF respectively) enabling sufficient angiogenic response required for vessel area quantification using a slit lamp. This assay can be used for different applications, including the evaluation of angiogenic modulator drugs or treatments as well as comparison between different genetic backgrounds affecting angiogenesis. A skilled investigator after practicing this assay can implant a pellet in less than 5 min per eye.

The protocol describes the corneal micropocket assay as developed in mice.

A córnea microbolsa Ensaio: Um modelo de angiogênese no mouse Eye

The mouse corneal micropocket assay is a robust and quantitative in vivo assay for evaluating angiogenesis. By using standardized slow-release pellets ...

Measuring Progressive Neurological Disability in a Mouse Model of Multiple Sclerosis

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating disease, with clinical features similar to the progressive forms of multiple sclerosis (MS). The mice show progressive disability with loss of motor and sensory functions, which can be assessed with multiple apparatuses and protocols. Among them, the Rotarod performance test is a very common behavioral test, its advantage being that it provides objective measurements, but it is often used assuming that it is straightforward and simple. In contrast to visual scoring systems used in some models of MS, which are highly subjective, the Rotarod test generates an objective, measurable, continuous variable (i.e., length of time), allowing almost perfect inter-rater concordances. However, inter-laboratory reliability is only achieved if the various testing parameters are replicated. In this manuscript, recommendations of specific testing parameters, such as size, speed, and acceleration of the rod; amount of training given to the animals; and data processing, are presented for the Rotarod test.

An optimized testing protocol is presented in this paper for the Rotarod performance test, used for measuring progressive neurological disability in TMEV-infected mice.

Medindo Progressive Neurological Disability em um modelo de rato com esclerose múltipla

After intracerebral infection with the Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV), susceptible SJL mice develop a chronic-progressive demyelinating ...

Neurobehavioral Assessments in a Mouse Model of Neonatal Hypoxic-ischemic Brain Injury

We performed unilateral carotid artery occlusion on CD-1 mice to create a neonatal hypoxic-ischemic (HI) model and investigated the effects of neonatal HI brain injury by studying neurobehavioral functions in these mice compared to non-operated (i.e., normal) mice. During the study, Rice-Vannucci&#39;s method was used to induce neonatal HI brain damage in postnatal day 7-10 (P7-10) mice. The HI operation was performed on the pups by unilateral carotid artery ligation and exposure to hypoxia (8% O2 and 92% N2 for 90 min). One week after the operation, the damaged brains were evaluated with the naked eye through the semi-transparent skull and were categorized into subgroups based on the absence (&#34;no cortical injury&#34; group) or presence (&#34;cortical injury&#34; group) of cortical injury, such as a lesion in the right hemisphere. On week 6, the following neurobehavioral tests were performed to evaluate the cognitive and motor functions: passive avoidance task (PAT), ladder walking test, and grip strength test. These behavioral tests are helpful in determining the effects of neonatal HI brain injury and are used in other mouse models of neurodegenerative diseases. In this study, neonatal HI brain injury mice showed motor deficits that corresponded to right hemisphere damage. The behavioral test results are relevant to the deficits observed in human neonatal HI patients, such as cerebral palsy or neonatal stroke patients. In this study, a mouse model of neonatal HI brain injury was established and showed different degrees of motor deficits and cognitive impairment compared to non-operated mice. This work provides basic information on the HI mouse model. MRI images demonstrate the different phenotypes, separated according to the severity of brain damage by motor and cognitive tests.

We performed unilateral carotid artery occlusion on postnatal day 7-10 CD-1 mouse pups to create a neonatal hypoxic-ischemic (HI) model and investigated the effects of HI brain injury. We studied neurobehavioral functions in these mice compared to non-operated normal mice.

Neurocomportamentais avaliações em um modelo do rato de lesão cerebral hipóxica-isquêmica Neonatal

We performed unilateral carotid artery occlusion on CD-1 mice to create a neonatal hypoxic-ischemic (HI) model and investigated the effects of neonatal HI ...

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this protocol, we aim to guide the reader not simply through the technical considerations of generating laser-induced lesions to trigger neovascular processes, but rather focus on the powerful information that can be obtained from multimodal longitudinal in vivo imaging throughout the follow-up period.
The laser-induced mouse CNV model was generated by a diode laser administration. Multimodal in vivo imaging techniques were used to monitor CNV induction, progression and regression. First, spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT) was performed immediately after the lasering to verify a break of Bruch&#39;s membrane. Subsequent in vivo imaging using fluorescein angiography (FA) confirmed successful damage of Bruch&#39;s membrane from serial images acquired at the choroidal level. Longitudinal follow-up of CNV proliferation and regression on days 5, 10, and 14 after the lasering was performed using both SD-OCT and FA. Simple and reliable grading of leaky CNV leasions from FA images is&#160;presented. Automated segmentation for measurement of total retinal thickness, combined with manual caliber application for measurement of retinal thickness at CNV sites, allow unbiased evaluation of the presence of edema. Finally, histological verification of CNV is performed using isolectin GS-IB4 staining on choroidal flatmounts. The staining is thresholded, and the isolectin-positive area is calculated with ImageJ.
This protocol is especially useful in therapeutics studies requiring high-throughput-like screening of CNV pathology as it allows fast, multimodal, and reliable classification of CNV pathology and retinal edema. In addition, high resolution SD-OCT enables the recording of other pathological hallmarks, such as the accumulation of subretinal or intraretinal fluid. However, this method does not provide a possibility to automate CNV volume analysis from SD-OCT images, which has to be performed manually.

In Vivo Multimodal Imaging and Analysis of Mouse Laser-Induced Choroidal Neovascularization Model

Here, we present the usefulness of longitudinal in vivo imaging in the follow-up of morphological changes of laser-induced choroidal neovascularization in mice.

Na Vivo Imagiologia multimodal e análise do modelo de neovascularização coroide de induzida por Laser de Mouse

Laser-induced choroidal neovascularization (CNV) is a well-established model to mimic the wet form of age-related macular degeneration (AMD). In this ...

The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded forebrain neuroepithelium is not amenable to wholemount analysis to examine organ-wide neurogenesis patterns. Moreover, defining the mechanisms of forebrain neurogenesis is not necessarily predictive of neurogenesis in other parts of the brain; for example, due to the presence of forebrain-specific progenitor subtypes. The mouse hindbrain provides an alternative model for studying embryonic neurogenesis that is amenable to wholemount analysis, as well as tissue sections to observe the spatiotemporal distribution and behavior of neural progenitors. Moreover, it is easily dissected for other downstream applications, such as cell isolation or molecular biology analysis. As the mouse hindbrain can be readily analyzed in the vast number of cell lineage reporter and mutant mouse strains that have become available, it offers a powerful model for studying the cellular and molecular mechanisms of developmental neurogenesis in a mammalian organism. Here, we present a simple and quick method to use the mouse embryo hindbrain for analyzing mammalian neural progenitor cell (NPC) behavior in wholemount preparations and tissue sections.

This article demonstrates how the mouse embryonic hindbrain can be used as a model for studying developmental neurogenesis in both whole organ and tissue section preparations.

O rombencéfalo Mouse como um modelo para o estudo embrionário neurogênese

The mouse embryo forebrain is the most commonly employed system for studying mammalian neurogenesis during development. However, the highly folded ...

Preparation and Implantation of Electrodes for Electrically Kindling VGAT-Cre Mice to Generate a Model for Temporal Lobe Epilepsy

It was discovered that electrical kindling of VGAT-Cre mice led to the spontaneous motor and electrographic seizures. A recent paper focused on how unique VGAT-Cre mice were used in developing spontaneous recurring seizures (SRS) after kindling and a likely mechanism - insertion of Cre into the VGAT gene - disrupted its expression and reduced GABAergic tone. The present study extends these observations to a larger cohort of mice, focusing on key issues such as how long the SRS continues after kindling and the effect of the animal's sex and age. This report describes the protocols for the following key steps: making headsets with hippocampal depth electrodes for electrical stimulation and for reading the electroencephalogram; surgery to affix the headset securely on the mouse's skull so that it does not fall off; and key details of the electrical kindling protocol such as duration of the pulse, frequency of train, duration of train, and amount of current injected. The kindling protocol is robust in that it reliably leads to epilepsy in most VGAT-Cre mice, providing a new model to test for novel antiepileptogenic drugs.

This report describes the methods to generate a model of temporal lobe epilepsy based on the electrical kindling of transgenic VGAT-Cre mice. Kindled VGAT-Cre mice may be useful in determining what causes epilepsy and for screening novel therapies.

Preparação e implantação de eletrodos para kindling elétrico de camundongos VGAT-CRE para gerar um modelo para epilepsia do lobo temporal

It was discovered that electrical kindling of VGAT-Cre mice led to the spontaneous motor and electrographic seizures. A recent paper focused on how unique ...