Em nosso laboratório, investigamos a transferência de elétrons extracelulares, ou EET, em bactérias como lactiplantibacillus plantarum, que é uma bactéria fermentativa crítica nas indústrias alimentícias. No EET, a célula transfere elétrons para um cetro eletrônico extracelular, como um eletrodo em um sistema químico bioelétrico. Queremos entender e projetar EET para aplicações em biossensoriamento, biocatálise e fermentação de alimentos.
Descobrimos que o túnel alpino pode comprar corrente através do EET na presença de quinona, como o DHNA. Este processo regenera o NAD plus, acelera a perda geral das vias de fermentação primária e aumenta o crescimento celular. Além disso, descobrimos que diversos derivados de quinona, além do DHNA, também podem mediar o EET em L plantarum.
A investigação de EET mediada requer configurações bioquímicas especializadas. Especificamente, usamos um sistema bioeletroquímico de três eletrodos e duas câmaras para evitar a interferência entre as reações anódica e catódica. Também usamos um eletrodo de trabalho de campo de carbono que possui uma grande área de superfície para melhorar a transferência de elétrons dos mediadores de elétrons.
Nosso trabalho explorando as vias EET em L plantarum e como essas vias interagem com o metabolismo fermentativo pode ter aplicações úteis nas indústrias alimentícias. Sabemos que EET e L plantarum alteram o fluxo metabólico através da fermentação, e isso pode ser manipulado para aplicações úteis e alterando os sabores dos alimentos e produzindo produtos químicos valiosos na eletrofermentação. No futuro, continuaremos a aumentar nosso conhecimento fundamental de EET e buscar novas aplicações de EET em organismos como L plantarum.
Planejamos projetar proteínas na via EET, o que nos permitirá controlar ainda mais o EET para aplicações em eletrofermentação e biossensoriamento. Para começar, lixe fios de titânio pré-cortados de um milímetro de diâmetro para o trabalho em contra-eletrodos, com lixa de óxido de alumínio até ficar uniformemente brilhante. Usando um alicate, dobre uma extremidade de cada fio do eletrodo de trabalho em um pequeno gancho.
Deslize um cartucho de feltro de carbono de 16 centímetros quadrados em cada fio de eletrodo de trabalho, tecendo o fio para dentro e para fora do feltro de carbono uma vez e puxando o cartucho para baixo do fio até ficar preso no gancho. Prenda os eletrodos de encontro de trabalho nas tampas GL 45 perfurando o septo de borracha com o fio e puxando-o por alguns centímetros. Para construir reatores emparelhados, monte o O-ring e coloque uma membrana de troca catiônica pré-cortada, pré-embebida em água no O-ring montado.
Coloque o O-ring com a membrana entre as grandes aberturas inferiores de duas garrafas de reator emparelhadas. Prenda os frascos do par de reatores e um anel com a membrana com uma braçadeira de articulação. Coloque uma barra de agitação magnética em cada câmara anódica antes de fechar todas as pequenas aberturas na parte superior de cada frasco com tampas GL14, equipadas com septos de borracha.
Encha cada garrafa do reator com 110 mililitros de água deionizada. Insira as tampas equipadas com um eletrodo de trabalho redondo de feltro de carbono e pressione suavemente a parte superior do feltro redondo para mantê-lo preso ao gancho. Feche os frascos com a tampa GL45 apropriada e encaixada no eletrodo.
Reatores a água em autoclave e tampas de eletrodos GL14. Em condições estéreis, raspe a cultura de lactoplanta abasilisk plantarum do topo de um estoque de glicerol e inocule em três mililitros de demanda comercial rugosa afiada ou meio MRS. Incube a cultura durante a noite a 37 graus Celsius, sem agitar.
Para começar, em um gabinete de biossegurança estéril, descarte a água autoclavada dos reatores do sistema bioeletroquímico. Encha as câmaras catódicas com 110 mililitros de meio M9 autoclavado e as câmaras anódicas com 110 mililitros de MCDM recém-preparado. Substitua uma tampa GL14 da câmara anódica por uma tampa GL14 de autoclave com um anel de teto de silicone.
Pulverize os eletrodos de referência preparados com etanol a 70% antes de colocá-los através da tampa do eletrodo em cada câmara anódica. Aperte todas as tampas e clamps para evitar vazamentos. Para conectar os reatores ao sistema de bomba de água, primeiro coloque cada reator na plataforma apropriada da barra de agitação.
Em seguida, conecte as torneiras da camisa de água de cada reator ao próximo com tubos de borracha, conectando os reatores finais aos tubos de entrada e saída da bomba d'água. Encha a bomba com água e adicione quatro a seis gotas de condicionador de água. Ligue o sistema de bomba e ajuste a temperatura para 30 graus Celsius.
Ligue a bomba e observe o fluxo de água através de todas as camisas de água do reator, confirmando que não há vazamentos. Ligue as plataformas de agitação e ajuste-as para agitação contínua a 220 RPM. Para conectar os reatores às linhas de gás poupador de nitrogênio, primeiro conecte um filtro de ar a uma agulha de calibre 22 e insira a agulha através do septo superior de uma câmara anódica do reator no meio.
Insira uma agulha de calibre 18 no septo superior de uma câmara anódica do reator, conecte a linha de gás de uma fonte de nitrogênio ao filtro de ar e abra a válvula para permitir que o gás borbulhe suavemente através do reator. Para conectar os biorreatores aos cabos do potenciostato, conecte o contador de trabalho e os fios do clipe jacaré do eletrodo de referência do potenciostato aos eletrodos correspondentes. Depois de inserir todos os parâmetros, pressione o triângulo inicial verde para iniciar a corrida.
Observe os traços de tensão de circuito aberto por alguns minutos para garantir que todos os reatores sejam lidos positivamente. e fechar juntos com um sinal constante. Em condições estéreis, subcultive a cultura de L plantarum previamente cultivada de um a 200 em 50 mililitros de MMRS.
Cultive as células durante a noite a 37 graus Celsius, sem tremer. Para começar, remova a cultura L plantarum cultivada em MMRS da incubadora. Transfira a cultura para um tubo cônico de 50 mililitros em condições estéreis e coloque o tubo no gelo.
Centrifugar a cultura a 4 000 g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Remova o sobrenadante antes de ressuspender o pellet em 50 mililitros de PBS. Após a segunda lavagem, ressuspenda as células em PBS frio até a densidade óptica a 600 nanômetros de 11.
Coloque dois mililitros de células ressuspensas em uma seringa de três mililitros, equipada com uma agulha. Na estação do reator, decape uma seringa de células e insira a agulha no topo de uma câmara anódica do reator. Quando todas as seringas estiverem no lugar, pressione os êmbolos para injetar as células.
Registar a hora da injecção a partir do traçado de cronoamperometria. Deixe a corrente estabilizar no traço por duas a quatro horas. No sistema bioeletroquímico, rotule os reatores experimentais como mais DHNA e os reatores de controle de solvente como menos DHNA.
Decape uma seringa carregada com 110 microlitros de 20 miligramas por mililitro de DHNA e insira-a na parte superior da câmara anódica, designada como mais DHNA. Insira uma seringa carregada com 110 microlitros de DMSO na câmara anódica, designada como menos DHNA. Usando uma seringa de três mililitros equipada com uma agulha de calibre 21, remova dois mililitros de meio de cada câmara anódica através do septo de tampa pequena não utilizado.
Transfira as amostras para uma placa de 24 poços de profundidade para medir o pH para o ponto de tempo de zero hora. Pressione os êmbolos das seringas de DHNA e DMSO para injetar nos reatores. Registar a hora da injecção a partir do traçado de cronoamperometria.
Descarte todas as seringas e agulhas. Após 24 horas, remova dois mililitros de meio de cada câmara anódica conforme descrito anteriormente e transfira-o para uma placa de 24 poços profundos para medições de pH de 24 horas. Execute a voltametria cíclica para o ponto de tempo de 24 horas.
Meça e registre o pH das amostras de 24 horas de cada reator. A densidade de corrente devido à transferência de elétrons extracelulares atingiu um pico de aproximadamente 132 microamperes por centímetro quadrado, oito horas após a injeção de DHNA. Em contraste, a injeção de DMSO resultou em uma densidade de corrente insignificante.
Os dados de voltametria cíclica mostraram um aumento distinto na corrente oxidativa a 50 milivolts na presença de L plantarum com DHNA, em comparação com L plantarum com DMSO e um aumento de 256% na densidade de corrente a 300 milivolts, em comparação com o traço abiótico de DHNA. A transferência de elétrons extracelulares resultou em uma queda notável no pH para uma média de 3,33 em 24 horas nas amostras com L plantarum e DHNA, enquanto as amostras com L plantarum e DMSO tiveram um pH médio de 6,50.
