The authors thank Dr. Dario Bonetta for providing Arabidopsis thaliana seeds and for technical assistance in regards to the triple response assay, as well as Simone Quaranta for help with FT-IR. This work was supported by a Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada Discovery Grant (NSERC-DG) to JLS, an Ontario Graduate Scholarship (OGS) to RVA, and a Queen Elizabeth II Graduate Scholarship in Science and Technology (QEII-GSST) to AJV.

1. Produtos químicos <ol><li> Prepara-se uma solução de CEPA mM 500 (144,49 g / mol), e uma solução que consiste em ambos NaCl 500 mM (58,44 g / mol) e 500 mM de NaH 2 PO 4? H 2 O (137,99 g / mol) em acidificada (pH 2.5) de água ultra-pura ou HCl 0,1 N. Misture usando um vortex até que as soluções são claras. </li><li> Seriadamente diluído (10x) as soluções 500 mM no mesmo solvente para se obter a 5 mM e 50 mM de stocks. </li><li> Prepara-se uma solução de 10 mM de 1-aminociclopropano-carboxílico (ACC; 101,1 g / mol) em água ultra-pura. </li><li> Filtro-esterilizar soluções de reserva e alíquotas armazenar a -20 ° C. </li><li> Filtrar-esterilizar celulase. alíquotas armazenar a 4 ° C. </li></ol> 2. Verificação de produção de eteno a partir de 2-cloroetilfosfônico Ácido decomposição: ensaio de resposta Triplo <ol><li> Surface-esterilizar Arabidopsis thaliana Sementes Ecótipo Columbia Usando a fase de vapor Método: CUIDADO: O passo seguinte produz tgás de cloro ico. Realizar a esterilização de sementes em um exaustor. <ol><li> Obter um recipiente lacrado profundo o suficiente para acomodar uma proveta de vidro de 250 ml para esterilização de sementes e colocá-lo em um exaustor. </li><li> Adicionar A. thaliana sementes para um tubo de microcentrífuga e colocar o tubo em um rack. Colocar o suporte com o tubo aberto para o recipiente lacrado. Nota: Não encha tubos individuais mais da metade completo para permitir que o gás cloro para penetrar as sementes mais baixos. </li><li> Coloque um copo de 250 ml contendo 100 ml de lixívia comercial no recipiente selável. Adiciona-se cuidadosamente 3 mL de HCl concentrado para a água sanitária e selar imediatamente o recipiente com a sua tampa. CUIDADO: Bleach e HCl reagem para produzir gás tóxico de cloro que actua à superfície-esterilizar as sementes. </li><li> Incubam-se as sementes na presença de cloro gasoso durante 4 horas na fumehood. Nota: Os tempos de esterilização mais longos irá reduzir a eficiência de germinação. </li><li> Após a esterilização, permitir que o chlorine gás de ventilação, na hotte durante pelo menos 1 h, em seguida selar o tubo de microcentrífuga. Deixe a água sanitária e mistura de HCl na fumehood por pelo menos 24 horas antes de descartar. Nota: As sementes esterilizadas podem ser armazenadas à temperatura ambiente para uso imediato. </li><li> Manter as sementes a 4 ° C para armazenamento a longo prazo. Traga sementes à temperatura ambiente antes de abrir o tubo de microcentrífuga para evitar a condensação. sementes armazenar no escuro. </li></ol></li><li> Prepare placas de ágar em 4 sectoriais placas de petri (90 x 15 mm): <ol><li> Preparar 110 ml de meio de crescimento de A. thaliana mudas: 1x Murashige e Skoog (MS), meio basal de 15 (4,33 g / L) contendo 1% (w / v) de sacarose e 0,8% (w / v) de agar. Ajustar o meio MS a pH 6 com NaOH. </li><li> Preparação de 100 ml de meio de crescimento bacteriano para a decomposição CEPA: Schramm e Hestrin (SH) meio 16 contendo 1,5% (w / v) de agar. Ajustar o meio SH-se até pH 7 com NaOH. </li><li> Esterilizar media por autoclavagem e temper em um banho de água a 55 ° C. </li><li> Uma vez que a MS tem de agar temperado, adicionar 40 ml a um frasco estéril. Para preparar o meio de crescimento de controlo positivo para A. thaliana mudas, complementar a 40 ml de aliquota de agar MS com 40 ul de 10 mM ACC para obter uma concentração final de 10 uM ACC. </li><li> Adicionar 5 ml de meio para os quadrantes adequadas das placas de Petri sectored (Figura 1) e deixar o agar solidificar. Prepare todas as placas em triplicado. Nota: CEPA não é adicionado ao meio de crescimento, até mais tarde no protocolo. </li></ol></li></ol><img alt="figura 1" src="/files/ftp_upload/54682/54682fig1.jpg" /> Figura 1:. Configuração de placas de agar utilizadas para o ensaio de resposta tripla com CEPA Um esquema ilustra os quadrantes específicos para o controlo negativo (A), controlo positivo (B), e as placas experimentais (C). Este valor foi modificado a partir Augimeri e Alça 9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54682/54682fig1large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <ol start="3"><li> Stratify A. thaliana Sementes para garantir Germinação Synchronous: <ol><li> Adicionar aproximadamente cinquenta A. sementes thaliana em cada quadrante que contém o MS ou MS + ACC agar. Garantir sementes são distribuídas uniformemente para facilitar a remoção e análise de mudas. </li><li> Incubar as placas contendo as sementes no escuro a 4 ° C durante 3-4 dias. </li></ol></li><li> Decompor CEPA em Meio de Crescimento Bacteriano (SH) e executar Triplo resposta do ensaio: <ol><li> Após a estratificação, expor as sementes à luz fluorescente durante 2 h. </li><li> Espalhe 10 ul da solução de estoque 500 mM CEPA para os quadrantes de as placas experimentais contendo ágar SH (pH 7; Figura 1) para se obter uma concentração final CEPAde 1 mM. </li><li> Selar as placas com filme de laboratório e cobrir com folha para criar um ambiente escuro para as sementes. </li><li> Germinar sementes de placas por incubação no escuro a 23 ° C durante 3 dias com o lado de agar para baixo. Nota: As placas podem ser empilhadas, mas os controlos negativos devem ser colocados na parte inferior uma vez que o etileno é mais leve do que o ar. </li></ol></li><li> Analise Triplo resposta do ensaio Dados: <ol><li> Com uma pinça esterilizada por chama, retire uma única plântula de uma placa correspondente a cada tratamento e vista sob uma dissecação ou um microscópio USB digital. Assegurar a parte inferior das plântulas são alinhados e fotografia. </li><li> Retirar 30 mudas de cada quadrante (60 plântulas por repetição biológica e 180 mudas por tratamento). Alinhar sobre uma superfície com um fundo preto e uma fotografia com uma régua. </li><li> Meça o comprimento do hipocótilo (mm) de mudas em replicado usando software ImageJ 17. Defina a escala clicando e arrastando o * Liso *ferramenta para seleccionar um comprimento de 10 mm. Selecione &quot;Scale Set&quot; sob a guia &quot;Analisar&quot; e defina a distância conhecida a 10. Usando a ferramenta * segmentado *, clique e arraste para selecionar o comprimento do hipocótilo e pressione M para medir a distância. Comparar as médias de repetições biológicas usando um one-way ANOVA com teste de comparação múltipla de Tukey. As diferenças são considerados significativos se p &lt;0,05. </li></ol></li></ol> 3. Análise do pH ao longo do crescimento bacteriano <ol><li> Cresça e quantificar Komagataeibacter culturas xylinus de arranque em triplicado: <ol><li> Inocular uma única colônia de K. xylinus em 5 ml de meio SH (pH 5) suplementada com 0,2% (v / v) de celulase, esterilizada por filtração. Incubar as culturas a 30 ° C com agitação a 150 rpm até uma DO600 de 0,3 a 0,4 é atingida (cerca de 72 hr). </li><li> Colheita de arranque culturas por centrifugação (2000 xg; 4 ° C; 10 min). Com 5 ml estéril a 0,85% (w / v) NaCL solução, lavar as células duas vezes e ressuspender o sedimento celular. Manter as células no gelo. </li><li> Quantificar células usando uma câmara de contagem Petroff-Hausser. </li></ol></li><li> Análise para inocular culturas de pH: <ol><li> Adicionar 150 ml de caldo SH (pH 7) suplementado com 0,2% (v / v) de celulase, esterilizada por filtro de doze frascos de 500 ml com tampas de alumínio. Inocular frascos com K. xylinus culturas de arranque, a uma concentração de 5 a 10 células / ml. Usando as três culturas de arranque, preparar três repetições biológicas por tratamento. </li><li> culturas suplementadas com 300 ul da 5, 50, ou 500 mM de soluções de reserva CEPA para se obter concentrações finais CEPA de 0,01, 0,1, e 1,0 mM, respectivamente. Suplemento as culturas de controlo não tratadas com 300 ul de o solvente utilizado para dissolver CEPA. </li><li> Selar os frascos por firmemente gravando as tampas de folha para os frascos e incubar as culturas durante 14 dias a 30 ° C com agitação a 150 rpm. </li></ol></li><li> A cada dia, aseptically remover amostras de 5 ml de cada frasco e pelotas de células por centrifugação (2000 xg; 4 ° C; 10 min). Transfira os sobrenadantes para um tubo limpo e medir o pH de cada réplica biológica utilizando um medidor de pH. </li><li> Analisar os dados em tempo-curso representando graficamente o pH médio das repetições biológicas. Nota: É importante que o pH da cultura não caia abaixo de 3,5; um pH cultura de 5 reduz significativamente a libertação de etileno a partir de CEPA, e um pH abaixo de 3,5 inibe completamente a libertação de etileno. </li><li> Para controlar os níveis de cloro e de fosfato, realizar uma experiência idêntica utilizando 0,01, 0,1, e 1,0 mM de 4 a solução de NaCl-se NaH 2 PO utilizando as 5, 50, e os stocks a 500 mm, respectivamente. </li></ol> 4. Colony Morfologia <ol><li> Crescer K. Culturas xylinus de arranque, em triplicado: <ol><li> Inocular uma única colônia de K. xylinus em 5 ml de meio SH (pH 5) suplementada com 0,2% (v / v) de celulase, esterilizada por filtração. Incubate culturas a 30 ° C com agitação a 150 rpm até uma DO600 de 0,3 a 0,4 é atingida (cerca de 72 hr). </li><li> Colheita de arranque culturas por centrifugação (2000 xg; 4 ° C; 10 min). Com 5 ml de solução salina estéril, lavar as células e em seguida ressuspender o sedimento celular. Manter as células no gelo. </li></ol></li><li> Prepare a 24 placas de agar contendo 25 ml de SH (pH 7) com 1,5% médios (w / v) de agar. </li><li> Depois de o agar ter solidificado, espalhar 50 ul da 5, 50, e 500 mM de soluções de reserva CEPA sobre o agar para se obter concentrações finais CEPA de 0,01, 0,1, e 1,0 mM, respectivamente. Defina-se placas de controlo não tratadas e de solventes, que consistem em nenhuma alteração e de espalhamento de 50 ul de o solvente utilizado para dissolver os compostos de teste. </li><li> Placas de registo contínuo para colónias isoladas com um loop-cheia (~ 5 mL) de K. xylinus cultura inicial e feche-os com filme de parafina. Inocular todas as placas em triplicado. Incubar as placas durante cinco dias a 30 ° C. </li><li> Photcolónias OGRAFIA com ampliação de 20x usando um microscópio USB digital e qualitativamente avaliar a morfologia e celulose produção colonial em meio sólido. Nota: Celulose aparece como uma substância turva ao longo da margem da colónia. </li><li> Para controlar os níveis de cloro e de fosfato, realizar uma experiência idêntica utilizando 0,01, 0,1, e 1,0 mM de 4 a solução de NaCl-se NaH 2 PO utilizando as 5, 50, e os stocks a 500 mm, respectivamente. </li></ol> 5. Os ensaios película <ol><li> Cresça e quantificar K. Culturas xylinus de arranque, em triplicado: <ol><li> Em triplicado, inocular uma única colônia de K. xylinus em 5 ml de meio SH (pH 5) suplementada com 0,2% (v / v) de celulase, esterilizada por filtração. Incubar as culturas a 30 ° C com agitação a 150 rpm até uma DO600 de 0,3 a 0,4 é atingida (cerca de 72 hr). </li><li> Colheita de arranque culturas por centrifugação (2000 xg; 4 ° C; 10 min). Com 5 ml de solução salina estéril, lavar tele células duas vezes e ressuspender o sedimento celular. Manter as células no gelo. </li><li> Quantificar células usando uma câmara de contagem Petroff-Hausser. </li></ol></li><li> Prepare misturas principais para inocular placas de 24 poços: <ol><li> Suplemento 60 ml de meio SH (pH 7) com 120 uL de a 5, 50, e 500 mM de stocks CEPA para se obter concentrações finais CEPA de 0,01, 0,1, e 1,0 mM, respectivamente. Suplemento mais 60 ml de meio SH (pH 7) com 120 ul de o solvente utilizado para dissolver CEPA. Vortex para misturar. </li><li> Dividir cada 60 ml de meio contendo CEPA em quatro alíquotas de 14 ml. Inocular três das alíquotas de 14 ml com réplicas biológicas da cultura de arranque a uma concentração de 5 a 10 células / ml. Manter os tubos com as células em gelo para evitar a produção de celulose. Nota: Os restantes 14 ml de alíquota irá ser utilizado para poços de controlo estéreis. </li></ol></li><li> Inocular placas de 24 poços: <ol><li> Teste cada tratamento em seu próprio prato com três fileiras de repetições biológicas euma linha de controlos estéreis (Figura 2). </li></ol></li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54682/54682fig2.jpg" /> Figura 2:. Que ilustra o protocolo utilizado para o ensaio e análise da película CEPA suplementado com meio SH pH 7 (60 ml) Fluxograma é dividido em alíquotas em três inoculações em replicado biológica separados e um controlo estéril (14 ml cada). Estas culturas são então divididas em alíquotas em seis repetições técnicas (2 ml) em uma placa de 24 poços e, em seguida, selados com parafilme. Após a incubação durante 7 dias a 30 ° C, películas são colhidas e caracteriza-se por determinar o peso molhado, espessura, peso seco, e cristalinidade por FT-IR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54682/54682fig2large.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura</a> <ol start="2" style="margin-left: 40px;"><li> Usando a 14 ml mistura principal, adicione 2 ml em each de seis poços de uma placa de 24 cavidades estéreis. Completas para os três repetições biológicas e controle estéril (Figura 2). Repetir para cada tratamento. </li><li> placas de vedação com parafilme e incubar estaticamente durante 7 dias a 30 ° C. </li></ol><ol start="4"><li> Colheita e Medida Película Wet peso, espessura, peso seco (Rendimento celulose) e a cristalinidade (Figura 2): <ol><li> Deprimir a um lado da película para elevar a extremidade da película oposta e remover películas individuais com uma pinça. Apesar de manter aderência, coloque-os sobre toalha de papel fresco durante 3 segundos para remover o excesso médio antes da pesagem para determinar os seus pesos molhados. </li><li> Alinhar películas adjacentes a uma régua e uma fotografia do lado usando uma câmera digital de alta resolução. </li><li> Usando o software ImageJ 17, medir a espessura da película sobre o ombro esquerdo, ombro direito e no centro de cada película. Média de todas as repetições técnicas para cada Replicat biológicae. </li><li> Individualmente transferir as películas para as cavidades de uma placa de 6 poços. Tratar películas com 12 ml de NaOH 0,1 N a 80 ° C durante 20 min para lisar as células. </li><li> Remover o NaOH e neutralizar películas por lavagem com água ultra-pura, durante 24 h com agitação. Mudar a água a cada 6 horas. Nota: películas deve ser de cor branca após a conclusão da etapa de lavagem. </li><li> películas lugar nas esteiras de silício e seco a 50 ° C durante 48 horas até peso constante. Depois de seco, retire do esteiras e medir pesos película em escala analítica para determinar o rendimento de celulose bacteriana. </li><li> Analise película cristalinidade usando Fourier-transform infrared spectroscopy (FT-IR) utilizando 32 varrimentos e uma resolução de 4 cm-1 na gama de 4000 a 650 cm1. Calcular o índice de cristalinidade, CI (IR), usando A 1437 / A 895; a relação de absorção da banda &quot;cristalina&quot; e &quot;banda amorfa&quot; como descrito anteriormente 18. </li></ol&gt; </li><li> Para controlar os níveis de cloro e de fosfato, realizar uma experiência idêntica utilizando 0,01, 0,1, e 1,0 mM de 4 a solução de NaCl-se NaH 2 PO utilizando as 5, 50, e os stocks a 500 mm, respectivamente. </li><li> Analise Pellicle Dados: <ol><li> Calcule a hidratação da película, determinando a diferença entre pellicle peso úmido e peso seco. </li><li> Calcular a média dos valores de todas as repetições técnicas para se obter um único valor para cada réplica biológica para análise estatística. Compare tratamentos usando um one-way ANOVA com o teste de comparação múltipla de Tukey. As diferenças são significativas se p &lt;0,05. </li><li> Normalizar os dados como a percentagem de controlos não tratados e traçar os meios de repetições biológicas. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Os métodos aqui descritos descrevem a produção in situ de etileno a partir de CEPA para o estudo da resposta ao etileno bacteriana usando o organismo modelo, K. xylinus. Este método é muito útil como o etileno pode ser produzido, completando qualquer meio aquoso que tem um pH maior do que 3,5 com 10,11 CEPA eliminando a necessidade de gás de etileno puro ou equipamentos de laboratório especializado. Este método não se limita ao estudo dos efeitos do etileno derivado de CEPA em bact...

O etileno olefina (C 2 H 4) foi descoberto pela primeira vez como uma hormona vegetal, em 1901, quando foi observado que as mudas de ervilha, cultivadas em laboratório que utilizadas lâmpadas de gás de carvão, exibiu uma morfologia anormal em que hastes (hipocótilos) eram mais curtos, mais espessa e inclinou-se para os lados em relação às plantas de ervilha normais; um fenótipo mais tarde denominado a 1,2 resposta tripla. Estudos posteriores demonstraram que o etileno é um hormônio vegetal vital que regula vários processos de desenvolvimento como o crescimento, a resposta ao estresse, o amadurecimento dos frutos e senescência 3. Arabidopsis thaliana, um organismo modelo para a investigação biologia vegetal, tem sido bem estudada em relação à sua resposta ao etileno. Mutantes de resposta Vários etileno foram isolados, explorando o fenótipo triplo resposta observada em dark-grown A. mudas thaliana na presença de etileno 1,4,5. O precursor biossintético para a produção de etileno em plantas é 1-Aácido minocyclopropane carboxílico (ACC) e 6 é comumente utilizado durante o ensaio de resposta tripla para aumentar a produção endógena de etileno que conduz ao fenótipo triplo 1,4,5 resposta. Embora a resposta ao etileno é amplamente estudada em plantas, o efeito do etileno exógeno em bactérias é muito pouco estudada, apesar da estreita associação de bactérias com plantas. Um estudo relatou que certas estirpes de Pseudomonas pode sobreviver usando etileno como única fonte de carbono e energia 7. No entanto, apenas dois estudos demonstraram que as bactérias responder ao etileno. O primeiro estudo mostrou que as estirpes de Pseudomonas aeruginosa, P. fluorescens, P. putida, e P. syringae foram quimiotáctica para etileno utilizando um ensaio de tampão de agarose no qual agarose fundida foi misturada com um tampão de quimiotaxia equilibrada com etileno puro gás 8. No entanto, a nosso conhecimento, não houve nenhum further relatórios que utilizam gás de etileno puro para caracterizar a resposta de etileno bacteriana, provavelmente devido à dificuldade de manipulação de gases no laboratório sem equipamento especializado. O segundo relatório de resposta ao etileno bacteriana demonstrou que o etileno aumento da produção de celulose bacteriana e expressão do gene influenciado na bactéria associada à fruta, Komagataeibacter (anteriormente Gluconacetobacter) xylinus 9. Neste caso, o composto libertador de etileno, ácido 2-cloroetilfosfônico (CEPA) foi utilizado para a produção de etileno in situ no interior do meio de crescimento bacteriano, evitando a necessidade de gás de etileno puro ou equipamento especializado. CEPA produz etileno numa proporção de 1: 1 molar de pH acima de 3,5 através de um 10,11 catalisada por base, a reacção de primeira ordem 12-14. A degradação do CEPA é positivamente correlacionada com o pH e temperatura 13,14 e resulta na produção de acetatoeno, cloreto e fosfato. CEPA fornece aos pesquisadores interessados ​​em estudar respostas bacterianas etileno com uma alternativa conveniente para o etileno gasoso. O objectivo global dos seguintes protocolos é fornecer um método simples e eficaz para estudar a resposta de etileno bacteriana e inclui a validação de níveis f isiologicamente relevantes de produção de etileno a partir de decomposição CEPA em meio de crescimento bacteriano, análise de pH da cultura para garantir CEPA decomposição não é prejudicada durante crescimento bacteriano, e avaliação do efeito do etileno na morfologia bacteriana e fenótipo. Nós demonstramos esses protocolos usando K. xylinus, no entanto, estes protocolos podem ser adaptados para estudar a resposta ao etileno nas outras bactérias, utilizando o meio de crescimento apropriado e analisa fenótipo.

<table><tbody><tr><td>1-aminocyclopropane carboxylic acid (ACC)</td><td>Sigma</td><td>A3903</td><td>Biosynthetic precursor of ethylene in plants</td></tr><tr><td>4-sector Petri dish</td><td>Phoenix Biomedical</td><td>CA73370-022</td><td>For testing triple response</td></tr><tr><td>Agar</td><td>BioShop</td><td>AGR001.1</td><td>To solidify medium</td></tr><tr><td>Canon Rebel T1i DLSR camera</td><td>Canon</td><td>3818B004</td><td>For pictures of pellicles</td></tr><tr><td>Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>C2730</td><td>Aqueous solution</td></tr><tr><td>Citric acid</td><td>BioShop</td><td>CIT002.500</td><td>For SH medium</td></tr><tr><td>Commercial bleach</td><td>Life Brand</td><td>57800861874</td><td>Bleach for seed sterilization</td></tr><tr><td>Concentrated HCl</td><td>BioShop</td><td>HCL666.500</td><td>Hydrochloric acid for pH adjustment</td></tr><tr><td>Digital USB microscope</td><td>Plugable</td><td>N/A</td><td>For pictures of colonies</td></tr><tr><td>Ethephon (&amp;ge;96%; 2-chloroethylphosphonic acid)</td><td>Sigma</td><td>C0143</td><td>Ethylene-releasing compound</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>BioBasic</td><td>GB0219</td><td>For SH medium</td></tr><tr><td>Komagataeibacter xylinus ATCC 53582</td><td>ATCC</td><td>53582</td><td>Bacterial cellulose-producing alphaproteobacterium</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube</td><td>LifeGene</td><td>LMCT1.7B</td><td>1.7 ml microcentrifuge tube</td></tr><tr><td>Murashige and Skoog (MS) basal medium&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M5519</td><td>Arabidopsis thaliana growth medium</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>BioShop</td><td>SPD579.500</td><td>Sodium phosphate, dibasic heptahydrate for SH medium</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioBasic</td><td>SOD001.1</td><td>Sodium chloride for saline and control solution</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&amp;nbsp;</td><td>BioShop</td><td>SPM306.500</td><td>Sodium phosphate, monobasic monohydrate for control solution</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>BioShop</td><td>SHY700.500</td><td>Sodium hydroxide for pH adjustment</td></tr><tr><td>Paraffin film</td><td>Parafilm</td><td>PM996</td><td>For sealing plates and flasks</td></tr><tr><td>Peptone (bacteriological)</td><td>BioShop</td><td>PEP403.1</td><td>For SH medium</td></tr><tr><td>Petroff-Hausser counting chamber</td><td>Hausser scientific</td><td>3900</td><td>Bacterial cell counting chamber</td></tr><tr><td>Polyethersulfone sterilization filter 0.2 &amp;micro;m</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td>For sterilizing cellulase</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>BioShop</td><td>SUC600.1</td><td>Sucrose for MS medium</td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>BioBasic</td><td>G0961</td><td>For SH medium</td></tr></tbody></table>

utilizing the ethylene-releasing compound, 2-chloroethylphosphonic acid, as a tool to study ethylene response in bacteria

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ripening. Exogenous ethylene applied during early plant development triggers the triple response phenotype; a shorter and thicker hypocotyl with an exaggerated apical hook. Despite the intimate relationship between plants and bacteria, the effect of exogenous ethylene on bacteria has been greatly overlooked. This is partly due to the difficulty of controlling gaseous ethylene within the laboratory without specialized equipment. 2-Chloroethylphosphonic acid (CEPA) is a compound that decomposes into ethylene, chlorine, and phosphate in a 1:1:1:1 molar ratio when dissolved in an aqueous medium of pH 3.5 or greater. Here we describe the use of CEPA to produce in situ ethylene for the investigation of ethylene response in bacteria using the fruit-associated, cellulose-producing bacterium Komagataeibacter xylinus as a model organism. The protocols described herein include both the verification of ethylene production from CEPA via the Arabidopsis thaliana triple response assay and the effects of exogenous ethylene on K. xylinus cellulose production, pellicle properties and colonial morphology. These protocols can be adapted to examine the effect of ethylene on other microbes using appropriate growth media and phenotype analyses. The use of CEPA provides researchers with a simple and efficient alternative to pure ethylene gas for the routine determination of bacterial ethylene response.

Uma configuração de placa esquemática para verificação da libertação de etileno CEPA em meio SH (pH 7) pelo ensaio de resposta tripla é mostrado na Figura 1A - C. Um fluxograma que ilustra o protocolo da película é mostrada na Figura 2. escuro cultivadas A. thaliana mudas exibem o fenótipo resposta tripla (mais curto e mais espessa do hipocótilo com um gancho apical exagerado) na presença da ACC e na presença de et...

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Utilizing the Ethylene-releasing Compound, 2-Chloroethylphosphonic Acid, as a Tool to Study Ethylene Response in Bacteria

The protocols outlined herein facilitate the convenient investigation of bacterial ethylene responses by utilizing 2-chloroethylphosphonic acid (CEPA). Ethylene is produced in situ through the decomposition of CEPA in an aqueous bacterial growth medium, circumventing the requirement for pure ethylene gas.

Utilizando o composto libertador de etileno, ácido 2-cloroetilfosfônico, como uma ferramenta para estudar a resposta do etileno em bactérias

Ethylene (C2H4) is a gaseous phytohormone that is involved in numerous aspects of plant development, playing a dominant role in senescence and fruit ...

utilizing-ethylene-releasing-compound-2-chloroethylphosphonic-acid-as

Research

JoVE Journal

Biochemistry

7.8K visualizações.  University of Ontario Institute of Technology. The protocols outlined herein facilitate the convenient investigation of bacterial ethylene responses by utilizing 2-chloroethylphosphonic acid (CEPA). Ethylene is produced in situ through the decomposition of CEPA in an aqueous bacterial growth medium, circumventing the requirement for pure ethylene gas. 

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Assessing Stomatal Response to Live Bacterial Cells using Whole Leaf Imaging

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of guard cells, which are able to close the stomatal pore in response to a number of external factors including light intensity, carbon dioxide concentration, and relative humidity (RH). The stomatal pore is also the main route for pathogen entry into leaves, a crucial step for disease development. Recent studies have unveiled that closure of the pore is effective in minimizing bacterial disease development in Arabidopsis plants; an integral part of plant innate immunity. Previously, we have used epidermal peels to assess stomatal response to live bacteria (Melotto et al. 2006); however maintaining favorable environmental conditions for both plant epidermal peels and bacterial cells has been challenging. Leaf epidermis can be kept alive and healthy with MES buffer (10 mM KCl, 25 mM MES-KOH, pH 6.15) for electrophysiological experiments of guard cells. However, this buffer is not appropriate for obtaining bacterial suspension. On the other hand, bacterial cells can be kept alive in water which is not proper to maintain epidermal peels for long period of times. When an epidermal peel floats on water, the cells in the peel that are exposed to air dry within 4 hours limiting the timing to conduct the experiment. An ideal method for assessing the effect of a particular stimulus on guard cells should present minimal interference to stomatal physiology and to the natural environment of the plant as much as possible. We, therefore, developed a new method to assess stomatal response to live bacteria in which leaf wounding and manipulation is greatly minimized aiming to provide an easily reproducible and reliable stomatal assay. The protocol is based on staining of intact leaf with propidium iodide (PI), incubation of staining leaf with bacterial suspension, and observation of leaves under laser scanning confocal microscope. Finally, this method allows for the observation of the same live leaf sample over extended periods of time using conditions that closely mimic the natural conditions under which plants are attacked by pathogens.

We have developed a simple and reproducible protocol to access stomatal response to live bacteria. This method minimizes wounding and manipulation of the leaf as compared to the use of epidermal peels reported previously.

Avaliar a resposta estomática ao vivo células bacterianas usando imagens Folha Inteira

Stomata are natural openings in the plant epidermis responsible for gas exchange between plant interior and environment. They are formed by a pair of ...

Imunologia e Infecção

Functional Characterization of RING-Type E3 Ubiquitin Ligases In Vitro and In Planta

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent attachment of 76 amino acid ubiquitin modifiers to a target protein, depending on the length and topology of the polyubiquitin chain, can result in different outcomes ranging from protein degradation to changes in the localization and/or activity of modified protein. Three enzymes sequentially catalyze the ubiquitination process: E1 ubiquitin-activating enzyme, E2 ubiquitin-conjugating enzyme, and E3 ubiquitin ligase. E3 ubiquitin ligase determines substrate specificity and, therefore, represents a very interesting study subject. Here we present a comprehensive approach to study the relationship between the enzymatic activity and function of the RING-type E3 ubiquitin ligase. This four-step protocol describes 1) how to generate an E3 ligase deficient mutant through site-directed mutagenesis targeted at the conserved RING domain; 2&#8211;3) how to examine the ubiquitination activity both in vitro and in planta; 4) how to link those biochemical analysis to the biological significance of the tested protein. Generation of an E3 ligase-deficient mutant that still interacts with its substrate but no longer ubiquitinates it for degradation facilitates the testing of enzyme-substrate interactions in vivo. Furthermore, the mutation in the conserved RING domain often confers a dominant negative phenotype that can be utilized in functional knockout studies as an alternative approach to an RNA-interference approach. Our methods were optimized to investigate the biological role of the plant parasitic nematode effector RHA1B, which hijacks the host ubiquitination system in plant cells to promote parasitism. With slight modification of the in vivo expression system, this protocol can be applied to the analysis of any RING-type E3 ligase regardless of its origins.

The goal of this manuscript is to present an outline for the comprehensive biochemical and functional studies of the RING-type E3 ubiquitin ligases. This multistep pipeline, with detailed protocols, validates an enzymatic activity of the tested protein and demonstrates how to link the activity to function.

Caracterização funcional do RING-Tipo E3 Ubiquitin Ligases In Vitro e In Planta

Ubiquitination, as a posttranslational modification of proteins, plays an important regulatory role in homeostasis of eukaryotic cells. The covalent ...

Bioquímica

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend themselves against pathogen attack. The contribution of a specific Arabidopsis gene to the overall plant immune response can be specifically and quantitatively assessed by assaying the pathogen growth within the infected tissue. For over three decades, the hemibiotrophic bacterium Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 (Psm ES4326) has been widely applied as the model pathogen to investigate the molecular mechanisms underlying the Arabidopsis immune response. To deliver pathogens into the leaf tissue, multiple inoculation methods have been established, e.g., syringe infiltration, dip inoculation, spray, vacuum infiltration, and flood inoculation. The following protocol describes an optimized syringe infiltration method to deliver virulent Psm ES4326 into leaves of adult soil-grown Arabidopsis plants and accurately screen for enhanced disease susceptibility (EDS) towards this pathogen. In addition, this protocol can be supplemented with multiple pre-treatments to further dissect specific immune defects within different layers of plant defense, including Salicylic Acid (SA)-Triggered Immunity (STI) and MAMP-Triggered Immunity (MTI).

Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem

Quantification of pathogen growth is a powerful tool to characterize various Arabidopsis thaliana (hereafter: Arabidopsis) immune responses. The method described here presents an optimized syringe infiltration assay to quantify the Pseudomonas syringae pv. maculicola ES4326 growth in adult Arabidopsis leaves.

Bacteriana Folha Infiltração Ensaio para Belas Caracterização das respostas de defesa da planta usando o Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Patossistema

In the absence of specialized mobile immune cells, plants utilize their localized programmed cell death and Systemic Acquired Resistance to defend ...

Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, including work with bacteriophages and bacteriocins, proteinaceous antibacterial agents. This approach is relatively inexpensive, with minimal resource requirements. This technique consists of spotting supernatant from a donor strain (potentially harboring a toxic compound(s)) onto a solidified soft agar overlay that is seeded with a bacterial test strain (potentially sensitive to the toxic compound(s)). We utilized this technique to screen a library of Pseudomonas syringae strains for intraspecific killing. By combining this approach with a precipitation step and targeted gene deletions, multiple toxic compounds produced by the same strain can be differentiated. The two antagonistic agents commonly recovered using this technique are bacteriophages and bacteriocins. These two agents can be differentiated using two simple additional tests. Performing a serial dilution on a supernatant containing bacteriophage will result in individual plaques becoming less in number with greater dilution, whereas serial dilution of a supernatant containing bacteriocin will result a clearing zone that becomes uniformly more turbid with greater dilution. Additionally, a bacteriophage will produce a clearing zone when spotted onto a fresh soft agar overlay seeded with the same strain, whereas a bacteriocin will not produce a clearing zone when transferred to a fresh soft agar lawn, owing to the dilution of the bacteriocin.

We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.

Uso da técnica de sobreposição de Soft-agar para triagem de compostos inibidores produzida por bactérias

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

Detection of Histone Modifications in Plant Leaves

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent modifications on the amino-terminal tails of histones H3 and H4 play essential roles1-2. H3 and H4 histone modifications include methylation of lysine and arginine, acetylation of lysine, and phosphorylation of serine residues1-2. These modifications are associated either with gene activation, repression, or a primed state of gene that supports more rapid and robust activation of expression after perception of appropriate signals (microbe-associated molecular patterns, light, hormones, etc.)3-7. 
Here, we present a method for the reliable and sensitive detection of specific chromatin modifications on selected plant genes. The technique is based on the crosslinking of (modified) histones and DNA with formaldehyde8,9, extraction and sonication of chromatin, chromatin immunoprecipitation (ChIP) with modification-specific antibodies9,10, de-crosslinking of histone-DNA complexes, and gene-specific real-time quantitative PCR. The approach has proven useful for detecting specific histone modifications associated with C4 photosynthesis in maize5,11 and systemic immunity in Arabidopsis3.

A reliable and useful approach to detect histone modifications on specific plant genes is described. The approach combines chromatin immunoprecipitation (ChIP) and real-time quantitative PCR. It allows detection of histone modifications on specific genes with a role in diverse physiological processes.

Detecção de histona Modificações nas folhas das plantas

Chromatin structure is important for the regulation of gene expression in eukaryotes. In this process, chromatin remodeling, DNA methylation, and covalent ...

Biologia

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It contains sugars, amino acids, proteins, RNA, lipids and other metabolites. While there is a large interest in understanding the composition and function of the phloem, the role of many of these molecules and thus, their importance in plant development and stress response has yet to be determined. One barrier to phloem analysis lies in the fact that the phloem seals itself upon wounding. As a result, the number of plants from which phloem sap can be obtained is limited. One method that allows collection of phloem exudates from several plant species without added equipment is the EDTA-facilitated phloem exudate collection described here. While it is easy to use, it does lead to the wounding of cells and care has to be taken to remove contents of damaged cells. In addition, several controls to prove purity of the exudate are necessary. Because it is an exudation rather than a direct collection of the phloem sap (not possible in many species) only relative quantification of its contents can occur. The advantage of this method over others is that it can be used in many herbaceous or woody plant species (Perilla, Arabidopsis, poplar, etc.) and requires minimal equipment and training. It leads to reasonably large amounts of exudates that can be used for subsequent analysis of proteins, sugars, lipids, RNA, viruses and metabolites. It is simple enough that it can be used in both a research as well as in a teaching laboratory.

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Knowledge of the composition of the phloem sap as well as the mechanism of its loading and long-distance transport is essential for the understanding of long-distance signaling in plant development and stress/pathogen response and of assimilate transport. This manuscript describes the collection of phloem exudates using the EDTA-facilitated method.

Coleta e análise de<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Floema exsudados Usando o método EDTA facilitada

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It ...

Medição Automatizada da Resposta Estomática à Invasão Bacteriana em Arabidopsis

Direct Observation and Automated Measurement of Stomatal Responses to Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 in Arabidopsis thaliana

Stomata are microscopic pores found in the plant leaf epidermis. Regulation of stomatal aperture is pivotal not only for balancing carbon dioxide uptake for photosynthesis and transpirational water loss but also for restricting bacterial invasion. While plants close stomata upon recognition of microbes, pathogenic bacteria, such as Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pto), reopen the closed stomata to gain access into the leaf interior. In conventional assays for assessing stomatal responses to bacterial invasion, leaf epidermal peels, leaf discs, or detached leaves are floated on bacterial suspension, and then stomata are observed under a microscope followed by manual measurement of stomatal aperture. However, these assays are cumbersome and may not reflect stomatal responses to natural bacterial invasion in a leaf attached to the plant. Recently, a portable imaging device was developed that can observe stomata by pinching a leaf without detaching it from the plant, together with a deep learning-based image analysis pipeline designed to automatically measure stomatal aperture from leaf images captured by the device. Here, building on these technical advances, a new method to assess stomatal responses to bacterial invasion in Arabidopsis thaliana is introduced. This method consists of three simple steps: spray inoculation of Pto mimicking natural infection processes, direct observation of stomata on a leaf of the Pto-inoculated plant using the portable imaging device, and automated measurement of stomatal aperture by the image analysis pipeline. This method was successfully used to demonstrate stomatal closure and reopening during Pto invasion under conditions that closely mimic the natural plant-bacteria interaction.

Autor em destaque: Avançando na pesquisa estomática com medição automatizada de abertura

Here, we present a simple method for direct observation and automated measurement of stomatal responses to bacterial invasion in Arabidopsis thaliana. This method leverages a portable stomatal imaging device, together with an image analysis pipeline designed for leaf images captured by the device.

Observação Direta e Mensuração Automatizada das Respostas Estomáticas a Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 em Arabidopsis thaliana

Stomata are microscopic pores found in the plant leaf epidermis. Regulation of stomatal aperture is pivotal not only for balancing carbon dioxide uptake ...

Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

Beneficial plant-associated bacteria play an important role in promoting growth and preventing disease in plants. The application of plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) as biofertilizers or biocontrol agents has become an effective alternative to the use of conventional fertilizers and can increase crop productivity at low cost. Plant-microbe interactions depend upon host plant-secreted signals and a reaction hereon by their associated bacteria. However, the molecular mechanisms of how beneficial bacteria respond to their associated plant-derived signals are not fully understood. Assessing the transcriptomic response of bacteria to root exudates is a powerful approach to determine the bacterial gene expression and regulation under rhizospheric conditions. Such knowledge is necessary to understand the underlying mechanisms involved in plant-microbe interactions. This paper describes a detailed protocol to study the transcriptomic response of B. mycoides EC18, a strain isolated from the potato endosphere, to potato root exudates. With the help of recent high-throughput sequencing technology, this protocol can be performed in several weeks and produce massive datasets. First, we collect the root exudates under sterile conditions, after which they are added to B. mycoides cultures. The RNA from these cultures is isolated using a phenol/chloroform method combined with a commercial kit and subjected to quality control by an automated electrophoresis instrument. After sequencing, data analysis is performed with the web-based T-REx pipeline and a group of differentially expressed genes is identified. This method is a useful tool to facilitate new discoveries on the bacterial genes involved in plant-microbe interactions.

Plant-Microbe Interaction: Transcriptional Response of Bacillus Mycoides to Potato Root Exudates

The goal of the protocol presented here is to study the transcriptomic response of endosphere-isolated Bacillus mycoides to potato root exudates. This method facilitates the identification of important bacterial genes involved in plant-microbe interactions and is in principle applicable to other endophytes and plants, with minor adjustments.

Utilizando o composto libertador de etileno, ácido 2-cloroetilfosfônico, como uma ferramenta para estudar a resposta do etileno em bactérias

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Caracterização funcional do RING-Tipo E3 Ubiquitin Ligases In Vitro e In Planta

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Uso da técnica de sobreposição de Soft-agar para triagem de compostos inibidores produzida por bactérias

Detecção de histona Modificações nas folhas das plantas

Coleta e análise de

Observação Direta e Mensuração Automatizada das Respostas Estomáticas a Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 em Arabidopsis thaliana

Observação Direta e Mensuração Automatizada das Respostas Estomáticas a Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 em Arabidopsis thaliana

Observação Direta e Mensuração Automatizada das Respostas Estomáticas a Pseudomonas syringae pv. tomate DC3000 em Arabidopsis thaliana

Interação planta-micróbio: Resposta transcricional de Bacillus Mycoides exsudados de raiz de batata