Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre o papel direto do tau no compartimento nuclear, excluindo qualquer contaminação citoplasmática potencial de tau. A principal vantagem dessa técnica é que ela é amplamente aplicável ao estudo sobre a função nuclear do tau em outros tipos celulares e sob diferentes condições celulares. Demonstrando o procedimento será Giacomo Siano, um pós-doutor do meu laboratório.
Comece emplacando quatro vezes 10 para as cinco células celulares do neuroblastoma humano SH-SY5Y para serem transfeinadas com o vetor de controle vazio, quatro vezes 10 para as cinco células a serem transfectadas com tau não grampeado, quatro vezes 10 para as cinco células para serem transfeinadas com tau-NLS, e quatro vezes 10 para as cinco células a serem transfeinadas com tau-NES em poços individuais de uma placa de seis poços. No dia seguinte ao revestimento, incubar separadamente 400 nanogramas de DNA e o volume apropriado de lipídios cátônicos em um tubo de 250 microliters de soro reduzido por poço. Após cinco minutos em temperatura ambiente, misture cada vetor com um volume de lipídio cônico e incuba os complexos lipídicos de DNA por 20 minutos à temperatura ambiente.
No final da incubação, substitua os supernacantes em cada poço por dois mililitros de cultura completa fresca e transfete cada poço com a solução apropriada do complexo lipídedo de DNA para uma incubação noturna a 37 graus Celsius. No dia seguinte, substitua os supernantes por um novo meio de diferenciação. Para a análise de Western Blot, lave as células transfeinadas e diferenciadas em cada poço com PBS e incuba as células com 500 microliters de 0,1% Trypsin por poço por quatro minutos a 37 graus Celsius.
Quando as células tiverem se destacado, pare a reação com um volume igual de meio completo e transfira a suspensão celular de cada poço para tubos individuais para centrifugação. Depois de remover cuidadosamente os supernacantes, resuspense as pelotas em um mililitro de PBS por tubo para uma segunda centrifugação e remova novamente os sobrenantes. Para extratos totais de proteínas, incubar as pelotas por 30 minutos no gelo em 50 a 100 microliters de tampão de lise suplementados com inibidores de protease e fosfatase.
Ao final da incubação, centrifugar o extrato a 16.000 vezes g por 15 minutos e quantificar a concentração de proteína por qualquer ensaio de quantificação padrão. Em seguida, misture 20 microgramas de cada amostra de proteína com cinco microliters de tampão 4X Laemmli a um volume total de 20 microliters e ferva as amostras a 100 graus Celsius por cinco minutos. Para fracionamento subcelular, resuspenco as células em meio completo para contagem e gire uma vez 10 para as seis células por amostra.
Para isolar a fração citosolica, incubar as pelotas em 100 microliters de tampão de extração citoplasmica gelada complementado com inibidores de protease a quatro graus Celsius com mistura suave por 10 minutos. No final da incubação, colete as amostras por centrifugação e transfira os supernantes em tubos pré-refrigerados. Adicione 100 microliters de tampão de extração de membrana fria de gelo complementado com inibidores de protease à pelota para uma incubação de 10 minutos a quatro graus Celsius com mistura suave.
Em seguida, centrifugar as pelotas por cinco minutos a quatro graus Celsius e 3.000 vezes g e coletar os supernantes em novos tubos. Para coletar a fração nuclear solúvel, adicione 50 microlitadores de tampão de extração nuclear suplementados com inibidores de protease às pelotas com vórtice antes de incubar as amostras a quatro graus Celsius por 30 minutos. No final da incubação, centrifufique as amostras e colete os supernantes.
Para coletar a fração nuclear insolúvel, adicione 50 microliters de tampão de extração nuclear suplementado com inibidores de protease, cloreto de cálcio e nuclease microcócica às pelotas com vórtice. Incubar as amostras por cinco minutos a 37 graus Celsius antes de vórtice e centrifugação. Então recolha os supernantes.
Para coletar a fração citoesquelético, adicione 50 microliters de tampão de extração citoesquelético complementado com inibidores de protease às pelotas com vórtice. Após uma incubação de 10 minutos à temperatura ambiente, centrifufique as amostras e colete os sobrenantes. Para análise SDS-PAGE, adicione sete microlitadores de tampão 4X Laemmli a 20 microliters de cada uma das amostras de fração subcelular coletadas e ferva as amostras a 100 graus Celsius por cinco minutos.
No final da incubação, carregue as amostras em um gel de acrilamida e realize a eletroforese a uma tensão constante de 120 volts. Em seguida, transfira as proteínas para uma membrana de nitrocelulose a 250 miliamperes por 90 minutos. Incubar a membrana por cinco minutos na solução de coloração de Ponceau para verificar se há eletroforese adequada do gel proteico e uma mancha bem sucedida.
No final da incubação, enxágue a membrana em água destilada até que o fundo esteja limpo e remova a mancha com lavagem contínua com soro fisiológico tris-tampão complementado com Interpol 20 por 10 minutos em um shaker. Em seguida, incubar a membrana com solução de bloqueio por uma hora à temperatura ambiente com agitação antes de lavar três vezes com soro fisiológico tris-tampão mais Tween 20 por cinco minutos por lavagem. Após a última lavagem, hibridize a membrana com o anticorpo primário de interesse em bloquear a solução durante a noite a quatro graus Celsius seguido por três lavagens com soro fisiológico tris-tampão mais Interpol 20 por cinco minutos.
Após a última lavagem, hibridize a membrana com um anticorpo secundário conjugado de rabanete apropriado em solução de bloqueio por uma hora à temperatura ambiente antes de lavar a membrana com soro fisiológico tris-tampão mais Tween 20 três vezes por cinco minutos por lavagem. Após a última lavagem, detecte a banda de proteínas usando chemiluminescence e quantifique a intensidade das bandas western blot pela ImageJ. Na ausência de ácido retinóico e fator neurotrófico derivado do cérebro, células SH-SY5Y indiferenciadas assumem uma morfologia de rounder e formam aglomerados celulares.
Como esperado, após cinco dias de tratamento com ácido retinóico, os aglomerados se desenrolam e as células se espalham. Após três dias adicionais de tratamento com fator neurotrófico derivado do cérebro, as células parecem uniformemente distribuídas e interconectadas através de uma rede de neurites ramificados. Após a transfecção tau-NLS ou tau-NES, a localização subcelular tau pode ser detectada por imunofluorescência com anticorpos anti-tau.
Dependendo da eficiência da transfecção, as células exibem uma forte coloração nuclear se fundindo com o sinal DAPI após a transfecção tau-NLS ou uma coloração citoplasmática com os núcleos vazios após tau-NES. A análise da Mancha Ocidental revela o enriquecimento da actina dentro da fração citoesquelélnica, tubulina dentro das frações citoplasmáticas e citoesqueletal, e H2B dentro das frações nucleares. A análise de Western Blot também confirma a expressão de tau marcado e não marcado dentro do compartimento nuclear e transportador de glutamato vesicular uma expressão no extrato total.
De fato, a razão de tau nas frações nucleares e citoplasmáticas solúveis destaca o fato de que tau-NLS é altamente enriquecido na fração nuclear solúvel enquanto tau-NES é diminuído. Além disso, o tau-NLS é enriquecido na fração ligada à cromatina em relação à fração citoplasmática, enquanto o tau-NES é diminuído. Certifique-se de verificar cuidadosamente o número de células utilizadas para o fracionamento de cada amostra e verificar o enriquecimento dos genes de limpeza nas frações adequadas.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ser capaz de isolar compartimentos celulares e avaliar o papel funcional de tau no núcleo.
