A assistência técnica e instrumentação do Mecanismo de Universidade de Maryland Greenebaum Cancer Center Translational Core, especialmente os drs. Rena Lapidus e Mariola Sadowska, é altamente apreciada. O trabalho responsável pelo desenvolvimento deste ensaio foi financiado em parte pelo NIH RO1CA108846, AHA Grant-in-Aid GRNT2130014, um VA Prémio de Mérito a AP, e pela Universidade de Maryland cigarro fundos de reembolso (CRF), desde a Marlene &amp; Stewart Centro de Câncer Greenebaum.

Vários passos são realizados antes do tempo e vários reagentes são preparados e armazenados antes do procedimento seguinte: (1) cultura de células e isolamento de proteína, (2) preparação de oligonucleótido, (3) a preparação de placas de 96 poços, (4) o extracto nuclear durante a noite de incubação. Processo requer dois dias, devido à incubação durante a noite das proteínas nucleares com os oligonucleótidos de ADN. 1. Preparação de Amortecedores 1.1 isolamento de proteínas Nuclear <ol><li> Tampão hipotónico: Para preparar 100 ml de tampão hipotónico, adicionar 1 ml (1 M de HEPES, pH 7,9), 150 ul (1 M MgCl 2), 333 ul (3 M KCl) a 98,3 ml de H 2 O. As concentrações finais: 10 mM de HEPES, 1,5 mM de MgCl 2, 10 mM de KCl. Para tampão hipotónico + NP40 (para utilização no passo 2.11): Adicionar 0,5 ml (10% NP40) de 9,5 ml de tampão hipotónico por último NP40 a 0,5%. </li><li> Baixo Sal Tampão: Para preparar 100 ml de tampão de sal baixo (para uso na etapa 2.15), adicionar 1 ml (1 M HEPES, pH 7,9), 25 ml de glicerol, 150 mL (1 M MgCl 2), 666 ul (3 M KCl), 40 ul (0,5 M de EDTA) a 73 ml de H 2 O. As concentrações finais: HEPES 10 mM, 25% de glicerol, 1,5 mM de MgCl 2, KCl 20 mM, EDTA 0,2 mM. </li><li> Tampão de sal elevado: Para preparar 100 ml de tampão de elevado teor de sal (para utilização no passo 2.15), adicionar 1 ml (1 M de HEPES, pH 7,9), 25 ml de glicerol, 150 mL (1 M MgCl 2), 26,7 ml (3 M KCl), 40 ul (0,5 M de EDTA) a 47 ml de H 2 O. As concentrações finais: HEPES 10 mM, 25% de glicerol, 1,5 mM de MgCl 2, KCl 800 mM, EDTA 0,2 mM. </li><li> 10% de NP40 Detergente: 10 ml de NP40 a 90 ml de H2O </li><li> Os inibidores de protease e fosfatase [adicionado ao tampão hipotônico + NP40 (passo 2.11), ao buffer de sal baixo (passo 2.15), e tampão elevado de sal (passo 2.15) pouco antes de usar]: Adicionar 2,5 mL (1 M DTT) e 50 ul de inibidores de protease (100x) de 5 ml de cada tampão para uma concentração final de DTT 0,5 mM e inibidores de protease de 1x. A mistura da pasta de 100x inibidor de protease inclui:fluoreto de sódio (Ser / Thr, fosfatases ácidas), ortovanadato de sódio (Tyr, fosfatase alcalina), β-glicerofosfato (fosfatases Ser / Thr), pirofosfato de sódio (fosfatases Ser / Thr), Aprotinina (Ser proteases), Bestatina (amino-peptidases ), E64 (proteases de cisteína), leupeptina (proteases Ser / Cys), EDTA (metaloproteases). </li></ol> 1.2 Preparação das placas de ensaio <ol><li> Placa de solução de fixação: Para preparar 500 ml de solução, adiciona-se carbonato de sódio a 5,25 g para 500 ml de H2O, misturar bem e ajustar o pH a 9,7 para uma concentração final de carbonato de sódio 0,1 M. </li><li> Placa de solução de bloqueio: Para preparar estoque de poli dI / dC oligonucleótido, ressuspender 1 Unidade (~ 50 mg) de poli dI / dC em 1 ml de 10 mM Tris / HCl, pH 7,9, contendo EDTA 1 mM para uma concentração de estoque de 50 mg / ul. Banco é diluída para 1 mg / mL antes da utilização. </li></ol> 1,3 buffers de lavagem e diluições de anticorpos NOTA: tampão de lavagem é Streptavidin<html> utilizada para lavar pratos, entre adições e para diluir os anticorpos primários e secundários. <ol><li> Para preparar 1 litro de tampão de lavagem de estreptavidina, adicionar 2,4 g de Tris / HCl, 37,5 ml (4 M de NaCl), 10 ml (10% de BSA), 5 ml (10% de Tween-20), a 1 L de água filtrada Millipore estéril , pH 7,18. Armazenar a 4 ° C. As concentrações finais: 20 mM Tris / HCl, NaCl 150 mM, 0,1% BSA, 0,05% Tween-20. </li></ol> 1.4 tampão de ligação ao DNA NOTA: Este tampão é armazenado a -20 ° C. <ol><li> Para preparar 15 ml de tampão de ligação de ADN, adicionar 180 ul (1 M de HEPES, pH 7,9), 300 ul (3 M KCl), 12 ul (0,5 M EDTA, pH 8,0), 7,5 mL (1 M DTT), 3,0 ml (60% de glicerol), 300 uL (50 ug / mL de poli dI / dC) diluída com água desionizada / destilada H 2 O (12 ml). As concentrações finais: 12 mM HEPES / pH 7,9, KCl 60 mM, EDTA 0,4 mM, DTT 0,5 mM, 12% de glicerol, 1 ug / mL de poli dI / dC. </li></ol> 2. Cultura de Células e Isolamento Proteína Nuclear t &quot;&gt; NOTA: A preparação requer cerca de 3 horas de estimulação de células dependerá de experiência O número de células utilizadas para cada experiência irá variar e todos os volumes de reflectir uma experiência típica usando 3 x 10 7 células / ponto Ajustar para acomodar volumes... o número de células realmente usado na experiência 6. <ol><li> Para preparar proteína nuclear para ensaios de ligação de DNA, células humanas de cultura que expressam RUNX2 (endotelial, osteossarcoma, células de câncer de mama) nos meios de comunicação apropriados 6. </li><li> Tratamento de células confluentes com nocodazole (0,2 ug / ml para 16 horas), para reter as células na fase G2 / M do ciclo celular 6 fronteira. Sob estas condições, a proteína é estabilizada RUNX2 e ADN ligação máxima é alcançada. Desta forma, a proteína nuclear suficiente disponível para ensaios múltiplos e inibidores podem ser comparados a partir da mesma preparação. </li><li> Para cada passo, pré-arrefecer a centrífuga a 4 ° C e preparar tampões e relaxar 20 min a 4 ° C antes da colheita de células.</li><li> Células Frio (4 ° C) e procedimentos de conduta no gelo. </li><li> Células centrifugar a 1.000 rpm por 5 min em 15 ml de polipropileno tubo de fundo redondo. </li><li> Wash 1x com PBS gelado (Ca 2 + e Mg 2 + livre). </li><li> Centrifugar novamente e descartar PBS sobrenadante. </li><li> Adicionar 500 ul de tampão hipotónico, sem inibidores de protease, tendo o cuidado para ressuspender completamente o sedimento celular. </li><li> Transferir o conteúdo para um tubo de Eppendorf de 1,5 ml. </li><li> Centrifugar imediatamente a 5.500 rpm para 5,5 min; desprezar o sobrenadante e manter o pellet celular. </li><li> Ressuspender o sedimento celular em 500 ul de tampão hipotónico contendo 0,5% de NP40. Adicionar protease e inibidores de fosfatase e DTT 0,5 mM (conforme descrito no passo 1.1.5). </li><li> Deixar a amostra repousar em gelo durante 30 min. </li><li> Centrifugar a 13.000 rpm durante 10 min. </li><li> Descartar o sobrenadante (contém as proteínas citosólicas). </li><li> Ressuspender o sedimento em 60 mL nuclear cada um baixo saltampão T (para os quais os inibidores da protease e DTT 0,5 mM, foram adicionados a partir do passo 1.1.5) e tampão de elevado teor de sal (para os quais os inibidores da protease e DTT 0,5 mM, foram adicionados a partir do passo 1.1.5) para um total de 120 ul. Adicionar 60 ul de tampão de baixa salinidade para o sedimento primeiro e ressuspender, em seguida, adicionar 60 ul de tampão de alto teor salino. Vortex a pelota para ajudar na re-suspensão. </li></ol> NOTA: Este passo ajuda a se livrar de algumas das proteínas da membrana nuclear e configurar para a etapa de lise: baixo teor de sal primeiro (ressuspender pellet, vortex), depois de alta de sal (vórtice) otimiza este passo. Manter extracto em gelo durante 30 min, com agitação em vórtex após os primeiros 10 min. <ol start="16"><li> Centrifugar a 12.000 rpm durante 15 min, manter-se o sobrenadante contendo a proteína nuclear. </li><li> Medir a concentração de proteína (tentar manter amostras de 2-5 mg / ml), da alíquota em quantidades adequadas (10 mL / tubo) e armazenar a -80 ° C. </li></ol> NOTA: rendimento estimado: 30 x 10 6 cells irá dar origem a 5 ug / mL de proteína em 120 pi. 5 x 10 6 células irá originar 2,2 ug / mL de proteína em 40 ul. 3. Preparação de Duplo Stranded Oligonucleotídeo <ol><li> Projete oligonucleotídeos complementares com sites meia compatíveis nas extremidades. Para RUNX2 estes são: 5&#39;-CGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATACTCGCGTATT AACCACA ATAC TCG-3&#39;-biotina (sentido) e 5&#39;CGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT TGTGGTT AATACGCGAGTAT T GTGGTT AATACG-3&#39;-biotina (antisense). </li></ol> NOTA: As experiências-piloto determinou que três sítios de ligação Runx2 e single-end biotina marcada produziu os resultados mais reprodutíveis. <ol start="2"><li> Preparar tampão de emparelhamento 5x: Adicionar 300 ul (1 M Tris-HCl, pH 7,6), 30 ul (1 M MgCl 2), 10 ul (1 M DTT) a 260 mL de H 2 O (600 mL final). </li><li> Para 200 pmol de cada oligo de cadeia simplesonucleotide (3 mL), adicionar 12 ul de tampão de emparelhamento 5x e 45 mL de H 2 O para um total de 60 uL (200 pmol/60 ul). </li><li> Aquece-se a 95 ° C durante 5-10 min num bloco de aquecimento. </li><li> Arrefecer até 65 ° C lentamente (ajustando a temperatura para 65 ° C, leva-se 15 minutos), depois arrefece-se até à temperatura ambiente lentamente ao desligar a energia do bloco de aquecimento (ou colocando em 50 ml de água a 65 ° C num copo com gelo, o que demora cerca de 15-20 minutos). </li></ol> 4. Preparação de placas de 96 poços NOTA: Não use proteínas do leite nos buffers de lavagem. <ol><li> Fix placa com solução de fixação (carbonato de sódio 0,1 M): adicionam-se 300 ul / poço. </li><li> Incubar durante 2 horas por balançar à temperatura ambiente (RT), ou sem balançar a 4 ° C (S / N). </li><li> Lavar 3x com tampão de lavagem de placa de estreptavidina (WB): adicionam-se 300 ul / poço de cada vez. </li><li> Adicionar oligonucleótido de cadeia dupla marcado com biotina (sítios de ligação de consenso por três nucleótidos) durante 2 h wom de balanço (1,25 nmol / poço, 100 uL / ​​poço). </li><li> Lavar 3x com frio WB: adicionar 300 mL / poço e depois inverta imediatamente a placa em uma pia e secar as bordas sobre uma toalha de papel após cada adição. </li></ol> NOTA: Não utilize pontas de pipeta para remover o líquido das placas, pois isso pode raspar avidina: biotina: complexos de DNA de poços. Faça isso para todos os passos de lavagem subsequentes. 5. Incubação com Extrato Nuclear NOTA: Não substituir salmão ou arenque DNA do esperma para o poli tampão de bloqueio dI / DC. Evite bloquear placas com proteínas do leite. Ambos estes agentes bloqueadores resultar em elevados valores de fundo. <ol><li> Incubar com fator de transcrição específico à base de extrato nuclear (90 mL / poço). Prepare uma mistura de mestre contendo extrato nuclear (proteína de ligação de DNA; 3-9 mg / poço) tampão + poli dI / DC (1 mg / mL a partir de um estoque de 50 mg / ul) em DNA 1x vinculativo. O volume é tão necessária para o número total depoços necessários (90 ul / poço). </li><li> Qualquer inibidor potencial, tais como a vitamina D3 (Figura 2) ou composto CADD 5.221.975 (Figura 3), ou a diluição apropriada do controlo de solvente, tal como etanol, é adicionado neste passo. </li><li> Coloque placa de balanço plataforma, O / N a 4 ° C. </li><li> Lavar 3x com WB: adicionar 300 uL / ​​poço </li></ol> 6. A adição de primário Anticorpo NOTA: diluições anticorpo primário deve ser preparado - armazenamento não é recomendado. <ol><li> Dilui-se o anticorpo monoclonal específico para RUNX2 (estoque 1 mg / mL) 1/5, 000, em tampão de lavagem de estreptavidina. Prepare o suficiente para a adição de cada poço da placa de 96 poços (90 ul / poço) em triplicado. </li><li> Incubar durante 1 hora à temperatura ambiente numa plataforma oscilante. </li><li> Lavar 3x com WB; adicionar 300 l / poço. </li></ol> 7. A adição de um anticorpo secundário NOTA: diluições de anticorpos secundários podem ser stovermelho, a 4 ° C durante a noite, se necessário, no dia seguinte. <ol><li> Diluir F purificada por afinidade, anticorpo conjugado com HRP (7,1 mg / ml) de ab-específica para 1:1,400 em estreptavidina Tampão de lavagem: tampão de 3,5 ul antibody/5.0 ml de lavagem. Prepare o suficiente para a adição de cada poço da placa de 96 poços (90 ul / poço) em triplicado. </li><li> Incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente numa plataforma oscilante. </li><li> Wash 6x com WB invertendo a placa em pia (300 mL / poço). </li></ol> 8. HRP Substrato e Desenvolvimento de Produto <ol><li> Adicionar 50 mL de substrato TMB por poço diretamente do frasco estoque. </li><li> Incubar 10-20 minutos à temperatura ambiente no escuro (parar método de reação) ou medir absorção direta (monitoramento cinética contínua). </li></ol> 9. Medição Reaction <ol><li> Pare método de reação: Para reação parada visual, verificar se há mudança de cor de claro a azul e parar de reação com ácido sulfúrico 50 mL. </li><li> Medir a absorvância a 450 nm como Biotrak II espectrofotômetro leitor de placa visível (Amersham Biosciences, GE Healthcare Biosciences Corp Piscataway NJ, EUA) ou um instrumento similar. </li><li> Método cinético contínuo monitoramento: Adicionar substrato após a última lavagem e apenas antes de colocar no espectrofotômetro (não pare a reacção). </li><li> Medir a absorvância a 635 nm com o Bio-Tek Synergy HT Multi-reação leitor de microplacas espectrofotômetro (Bio-Tek Instruments, Inc; Winooski, VT, EUA) ou um instrumento similar. </li></ol>

<ol>
	<li>Hellman, L. M., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assay+(EMSA)+for+detecting+protein-nucleic+acid+interactions.">Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions.</a> Nat. Protoc. 2, 1849-1861 (2007).</li><li>Bhattacharya, N., Sarno, A., Idler, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+detection+of+nuclear+factor-kappaB+activity+using+a+sensitive+oligo-based+chemiluminescent+enzyme-linked+immunosorbent+assay.">High-throughput detection of nuclear factor-kappaB activity using a sensitive oligo-based chemiluminescent enzyme-linked immunosorbent assay.</a> Int. J. Cancer. 127, 404-411 (2010).</li><li>Hartzell, D. D., Trinklein, N. D., Mendez, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+analysis+of+the+CREB+signaling+pathway+using+HaloCHIP-chip+and+high+throughput+reporter+assays.">A functional analysis of the CREB signaling pathway using HaloCHIP-chip and high throughput reporter assays.</a> BMC Genomics. 10, 497 (2009).</li><li>Vuori, K. A., Ahlskog, J. K., Sistonen, L., Nikinmaa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TransLISA,+a+novel+quantitative,+nonradioactive+assay+for+transcription+factor+DNA-binding+analyses.">TransLISA, a novel quantitative, nonradioactive assay for transcription factor DNA-binding analyses.</a> FEBS J. 276, 7366-7374 (2009).</li><li>D'Souza, D. R., Salib, M. M., Bennett, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperglycemia+Regulates+RUNX2+Activation+and+Cellular+Wound+Healing+through+the+Aldose+Reductase+Polyol+Pathway.">Hyperglycemia Regulates RUNX2 Activation and Cellular Wound Healing through the Aldose Reductase Polyol Pathway.</a> J. Biol. Chem. 284, 17947-17955 (2009).</li><li>Underwood, K. F., D'Souza, D. R., Mochin, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+RUNX2+transcription+factor-DNA+interactions+and+cell+proliferation+by+Vitamin+D3+(cholecalciferol)+prohormone+activity.">Regulation of RUNX2 transcription factor-DNA interactions and cell proliferation by Vitamin D3 (cholecalciferol) prohormone activity.</a> J. Bone Miner Res. 27, 913-925 (2012).</li><li>Held, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+ß-galactosidase+activity+using+the+PowerWave+HT+and+Gen5+data+analysis+software:+basic+enzyme+kinetic+determinations.">Kinetic analysis of ß-galactosidase activity using the PowerWave HT and Gen5 data analysis software: basic enzyme kinetic determinations.</a> Biotek Instruments Application Note. , (2007).</li><li>Renard, P., Ernest, I., Houbion, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+sensitive+multi-well+colorimetric+assay+for+active+NFkappaB.">Development of a sensitive multi-well colorimetric assay for active NFkappaB.</a> Nucleic Acids Res. 29, E21 (2001).</li><li>Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+topoisomerase+I+inhibitors:+chemistry,+biology,+and+interfacial+inhibition.">DNA topoisomerase I inhibitors: chemistry, biology, and interfacial inhibition.</a> Chem Rev. 109, 2894-2902 (2009).</li><li>Pennisi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomics.+ENCODE+project+writes+eulogy+for+junk+DNA.">Genomics. ENCODE project writes eulogy for junk DNA.</a> Science. 337, 1159-1161 (2012).</li></ol>

Não temos nada a divulgar.

Os ensaios de ligação de ADN são usadas para medir a capacidade de factores de transcrição que interagem com o ADN. Os ensaios para a ligação de ADN incluem deslocamento da mobilidade electroforética (EMSA) e 1 immuneprecipitation cromatina (ChIP) Ensaios baseados em 3, bem como ensaios que utilizem formatos de 96 cavidades 4 tais como ensaios quimioluminescentes 2. A EMSA não é quantitativa e usa radioativo (32 P) oligonucleotídeos. Estas são incubadas ...

Os ensaios de ligação a DNA têm utilidade na medição da capacidade dos factores de transcrição que interagem com o ADN. Ensaios para DNA de ligação incluem ensaios de mudança de mobilidade eletroforética (EMSA) que dependem de oligonucleotídeos radiolabeled 1 ou 2 ensaios de quimiluminescência. Ensaios de cromatina immuneprecipitation (ChIP) com base 3, bem como ensaios que utilizem formatos de 96 poços 4 foram também descritas. No entanto, o EMSA é um ensaio quantitativo que não requer o uso de oligonucleotídeos marcados radioactivamente. Quando as proteínas nucleares associar com as sequências de nucleótidos de promotores específicos, complexos de ligação são retardados em géis de poliacrilamida e o factor de transcrição específico pode ser validado com um anticorpo &quot;supershift&quot;. Nós desenvolvemos um ensaio quantitativo de ligação de ADN utilizando um formato de imunossorvente ligado a enzima (ELISA-D), o qual é capaz de medir a interacção de RUNX2 com sequências de ligação de ADN correspondentes aos elementos promotores definidos igenes alvo n Runx2. Utilização de um anticorpo anti-RUNX2 fornece especificidade para o ensaio e a ausência de marcação radioactiva distinguir este ensaio a partir do teste de deslocamento em gel tradicional 5. Detecção de complexos de ligação é possível com a utilização de um anticorpo secundário acoplado a peroxidase de rábano (HRP), que converte um substrato de HRP, tetrametilbenzidina (TMB) a um produto de cor para a análise espectrofotométrica. O ensaio aqui relatado pode incorporar a utilização de oligonucleótidos de ADN mutados como controlo e pode ser utilizada para detecção de inibidores competitivos ou não-competitivos da ligação de DNA. O rastreio de compostos anti-tumorais novos também é possível com este ensaio.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the Reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly dI/dC</td>
			<td>GE Healthcare, Piscataway, NJ</td>
			<td>US20539-5UN</td>
			<td>1 U ~50mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RUNX2 antibody</td>
			<td>MBL International Corp., Woburn, MA</td>
			<td>D130-3</td>
			<td>1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fab-specific peroxidase conjugated antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A9917</td>
			<td>7.1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TMB Substrate (tetramethyl benzidine)</td>
			<td>EXALPHA Biologicals, Shirley, MA</td>
			<td>X1189S</td>
			<td>100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>57995</td>
			<td>Plate-fixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sulfuric Acid</td>
			<td>VWR, West Chester, PA</td>
			<td>BDH-39922-1</td>
			<td>Stop solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One, Basel, Switzerland</td>
			<td>655996</td>
			<td>Avidin-coated, black sides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HALT</td>
			<td>Thermo-Scientific/Pierce, Rockford, IL</td>
			<td>78440</td>
			<td>Protease and phosphatase inhibitors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemicals</td>
			<td>Various manufacturers</td>
			<td>Laboratory grade</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 1. Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer: Biotrak II Visible plate reader</td>
			<td>Amersham Biosciences</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>For use with stop reaction method</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer: Bio-Tek Synergy HT Multi-reaction microplate reader</td>
			<td>Bio-Tek Instruments, Inc.</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>For use with continuous kinetic monitoring</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Table 2. Equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a quantitative assay to study protein:dna interactions, discover transcriptional regulators of gene expression, and identify novel anti-tumor agents

Muitos ensaios de ligação de ADN, tais como ensaios de desvio de mobilidade electroforética (EMSA), ensaios quimioluminescentes, imunoprecipitação da cromatina (ChIP) à base de ensaios e ensaios baseados em múltiplos poços são usadas para medir a actividade do factor de transcrição. No entanto, estes ensaios são não quantitativa, carecem de especificidade, pode envolver o uso de oligonucleotídeos marcados radioactivamente, e pode não ser adaptável para a triagem de inibidores de ligação de ADN. Por outro lado, utilizando uma enzima ligada ao ensaio quantitativo de ligação de ADN imunossorvente (ELISA-D) de ensaio, que demonstram as interacções de proteínas nucleares com ADN, usando o factor de transcrição RUNX2 que dependem associação específica com as sequências de consenso de ligação de ADN presentes em biotina- oligonucleótidos marcados. Preparação de células, a extracção de proteínas nucleares, e concepção de oligonucleótidos de cadeia dupla são descritos. Placas de 96 poços revestidas com avidina foram fixados com tampão alcalino e incubadas com as proteínas nucleares, em tampão de bloqueio de nucleótidos. Folldevido a uma lavagem exaustiva das placas, o anticorpo primário específico e as incubações do anticorpo secundário é seguida pela adição de substrato de peroxidase de rábano e o desenvolvimento da reacção colorimétrica. Modo de reação Parar ou monitoramento contínuo cinética foram usados ​​para medir quantitativamente a interação de proteínas com o DNA. Discute-se controlos adequados de especificidade, incluindo o tratamento com a IgG não específica ou sem proteína ou o anticorpo primário. Aplicações do ensaio encontram-se descritos, incluindo a sua utilidade na triagem de drogas e de resultados positivos e negativos representativos são discutidos.

O método D-ELISA é altamente específico para a proteína de ligação de ADN designado enquanto, um oligonucleótido específico da sequência de cadeia dupla contendo três cópias do local de ligação de consenso RUNX2 (ACACCA) é usado. O anticorpo primário que reconhece o factor de proteína, também aumenta a especificidade. O anticorpo secundário contém covalentemente ligado a peroxidase de rábano (HRP), que converte um substrato transparente (tetrametil benzidina) para um produto corado para facilidade de...

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A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

Foi desenvolvido um ensaio quantitativo de ligação de ADN à base de ELISA para medir as interacções com o factor de transcrição do ADN. Alta especificidade para a proteína RUNX2 foi conseguida com um oligonucleótido de ADN de reconhecimento de consenso e de anticorpo monoclonal específico. Detecção Colorimétrico com uma reacção do substrato, o anticorpo acoplado a enzima foi monitorizada em tempo real.

Uma análise quantitativa para o Estudo de Proteína: DNA interações, Discover Transcricionais Reguladores de Expressão Gênica e identificar novos agentes anti-tumorais

Many DNA-binding assays such as electrophoretic mobility shift assays (EMSA), chemiluminescent assays, chromatin immunoprecipitation (ChIP)-based assays, ...

a-quantitative-assay-to-study-proteindna-interactions-discover

Research

JoVE Journal

Biology

18.5K visualizações.  University of Maryland School of Medicine.  Foi desenvolvido um ensaio quantitativo de ligação de ADN à base de ELISA para medir as interacções com o factor de transcrição do ADN. Alta especificidade para a proteína RUNX2 foi conseguida com um oligonucleótido de ADN de reconhecimento de consenso e de anticorpo monoclonal específico. Detecção Colorimétrico com uma reacção do substrato, o anticorpo acoplado a enzima foi monitorizada em tempo real. 

Vídeo: A Quantitative Assay to Study Protein:DNA Interactions, Discover Transcriptional Regulators of Gene Expression, and Identify Novel Anti-tumor Agents

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Elaboração de culturas de células primárias hematopoéticas de medula óssea de camundongos para Eletroporação

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Biologia

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Usando o Sistema de Eletroporação Gene Pulser MXcell para transfectar pilhas com Alta Eficiência

Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

Oi-C: um método para estudar a arquitetura tridimensional de Genomas.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

Usando um contador de células automatizadas para simplificar Estudos da Expressão Gênica: Knockdown siRNA de Expressão IL-4 Gene Dependente em células NAMALWA

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

Cromatina imunoprecipitação (chips) para a Modificação do ensaio dinâmico Histone na expressão dos genes ativados em células humanas

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

Na reconstituição in vitro da atividade T. Telomerase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the messagefor review see 1. However, it's now widely accepted that synonymous codon usage is the primary cause of non-uniform translational elongation rates1. Synonymous codons are not used with identical frequency. A bias exists in the use of synonymous codons with some codons used more frequently than others2. Codon bias is organism as well as tissue specific2,3. Moreover, frequency of codon usage is directly proportional to the concentrations of cognate tRNAs4. Thus, a frequently used codon will have higher multitude of corresponding tRNAs, which further implies that a frequent codon will be translated faster than an infrequent one. Thus, regions on mRNA enriched in rare codons (potential pause sites) will as a rule slow down ribosome movement on the message and cause accumulation of nascent peptides of the respective sizes5-8. These pause sites can have functional impact on the protein expression, mRNA stability and protein foldingfor review see 9. Indeed, it was shown that alleviation of such pause sites can alter ribosome movement on mRNA and subsequently may affect the efficiency of co-translational (in vivo) protein folding1,7,10,11. To understand the process of protein folding in vivo, in the cell, that is ultimately coupled to the process of protein synthesis it is essential to gain comprehensive insights into the impact of codon usage/tRNA content on the movement of ribosomes along mRNA during translational elongation.
Here we describe a simple technique that can be used to locate major translation pause sites for a given mRNA translated in various cell-free systems6-8. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA. The rationale is that at low-frequency codons, the increase in the residence time of the ribosomes results in increased amounts of nascent peptides of the corresponding sizes. In vitro transcribed mRNA is used for in vitro translational reactions in the presence of radioactively labeled amino acids to allow the detection of the nascent chains. In order to isolate ribosome bound nascent polypeptide complexes the translation reaction is layered on top of 30% glycerol solution followed by centrifugation. Nascent polypeptides in polysomal pellet are further treated with ribonuclease A and resolved by SDS PAGE. This technique can be potentially used for any protein and allows analysis of ribosome movement along mRNA and the detection of the major pause sites. Additionally, this protocol can be adapted to study factors and conditions that can alter ribosome movement and thus potentially can also alter the function/conformation of the protein.

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

A technique to identify translational pause sites on mRNA is described. This procedure is based on isolation of nascent polypeptides accumulating on ribosomes during in vitro translation of a target mRNA, followed by the size analysis of the nascent chains using a denaturing gel electrophoresis.

Isolamento de Ribossomos ligados a polipeptídeos nascentes<em&gt; In vitro</em&gt; Identificar Sites Pausa translacionais Junto mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Análise da Global RNA Síntese no nível da célula única seguinte hipóxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

Screening siRNA identificar Ubiquitin e ubiquitina-como reguladores do sistema de caminhos biológicos em células de mamíferos cultivadas

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a cytosine-guanine dinucleotide. While DNA methylation provides long-lasting and stable changes in gene expression, patterns and levels of DNA methylation are also subject to change based on a variety of signals and stimuli. As such, DNA methylation functions as a powerful and dynamic regulator of gene expression. The study of neuroepigenetics has revealed a variety of physiological and pathological states that are associated with both global and gene-specific changes in DNA methylation. Specifically, striking correlations between changes in gene expression and DNA methylation exist in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders, during synaptic plasticity, and following CNS injury. However, as the field of neuroepigenetics continues to expand its understanding of the role of DNA methylation in CNS physiology, delineating causal relationships in regards to changes in gene expression and DNA methylation are essential. Moreover, in regards to the larger field of neuroscience, the presence of vast region and cell-specific differences requires techniques that address these variances when studying the transcriptome, proteome, and epigenome. Here we describe FACS sorting of cortical astrocytes that allows for subsequent examination of a both RNA transcription and DNA methylation. Furthermore, we detail a technique to examine DNA methylation, methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) as well as a luciferase promoter assay. Through the use of these combined techniques one is able to not only explore correlative changes between DNA methylation and gene expression, but also directly assess if changes in the DNA methylation status of a given gene region are sufficient to affect transcriptional activity.

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression.