Este método demonstra a transfecção baseada em eletroporação de células epiteliais primárias de pigmento humano usando o Sistema de Transposon da Bela Adormecida, uma evidência para a expressão transgênica e secreção de proteínas. A combinação do Sistema de Transposon da Bela Adormecida e da eletroporação permite a transfecção eficiente de células epiteliais primárias de pigmento humano, bem como a expressão transgênica estável e persistente e a secreção de proteínas. O objetivo geral é estabelecer uma terapia de adição genética baseada em células para o tratamento de doenças degenerativas da retina, que requer secreção estável e persistente da proteína terapeuticamente ativa.
Demonstrando o procedimento estarão Anne Freialdenhoven e Antje Schiefer, assistentes médicos técnicos do laboratório. Para preparar o DNA plasmídico para a eletroporação primária de células RPE humanas, use um espectrofotômetro de microvolume para quantificar o conteúdo de DNA plasmídico e ajuste a concentração para 250 nanogramas por microlitro em Tris-HCL 10 milimolares. Misture um volume de 250 nanogramas por microlitro de DNA plasmídico da transposase SB100X com 16 volumes de 250 nanogramas por microlitro de fator derivado do epitélio pigmentar transposon DNA plasmídico.
Adicione dois microlitros da mistura de plasma resultante em um tubo de microcentrífuga de bloqueio seguro estéril de 1,5 mililitros no gelo e encha um tubo tampão com três mililitros de buffer E.Em seguida, insira o tubo na estação de pipeta até que um clique seja ouvido e defina o dispositivo de transfecção para 1, 100 volts, uma largura de pulso de 20 milissegundos e dois pulsos. Para preparar as células para eletroporação. Primeiro, verifique a morfologia das culturas primárias de células de PSE via microscopia de contraste de fase para avaliar seu crescimento e confluência.
Trate as células com 500 microlitros de 0,05% de tripsina EDTA por poço por sete a 15 minutos na incubadora de cultura celular. Quando as células tiverem se desprendido, coletem as células por centrifugação, ressuspenda as células em um mililitro de PBS e centrifugar de uma a 10 vezes 10 para as quatro alíquotas celulares por reação de transfecção. Ressuscite os pellets em 11 microlitros de tampão R por tubo e adicione dois microlitros da mistura plasmídica preparada a cada tubo.
Insira a cabeça de uma pipeta de transfecção em uma ponta de transfecção de 10 microlitros até que a braçadeira pegue totalmente a haste de montagem do pistão e carregue a célula e a solução plasmídica na ponta de transfecção. Insira a pipeta de transfecção no tubo tampão colocado dentro da estação de pipeta até que um clique seja ouvido e pressione start para iniciar o processo de eletroporação. Após a transfecção, remova cuidadosamente a pipeta de transfecção da estação de pipeta e imediatamente pipete a célula e a solução plasmídica para os poços preparados da placa de cultura celular.
Para purificar suas proteínas de fusão de fator derivado do epitélio pigmentar de sobrenadantes de cultura de células RPE. Primeiro, use uma ponta de corte chanfrado para coletar uma alíquota de 30 microlitros de pasta NTA de níquel por amostra e pellet a resina NTA de níquel por centrifugação. Ressuscite cuidadosamente a resina NTA de níquel com 200 microlitros de tampão de incubação One X e retire a solução com uma centrifugação adicional duas vezes.
Após a segunda centrifugação, ressuscite cuidadosamente os pellets de resina NTA de níquel com 40 microlitros de tampão de incubação Four X por amostra. Em seguida, misture 55 microlitros de uma alíquota de pasta de níquel NTA pré-tratada com 260 microlitros de tampão de incubação Four X e 900 microlitros de cada sobrenadante de cultura de células RPE transefcted. Incubar a mistura num agitador de balanço à temperatura ambiente durante 60 minutos e repeltar as misturas de resina NTA de níquel.
Ressuscite cuidadosamente os pellets em 175 microlitros de tampão de incubação One X e centrifugar as misturas mais duas vezes. Após a segunda centrifugação, ressuspenda cuidadosamente os pellets de resina NTA de níquel em 30 microlitros de tampão de eluição por uma incubação de 20 minutos à temperatura ambiente com agitação e centrifugação das amostras novamente. Em seguida, colete cuidadosamente os sobrenadantes e misture-os com o tampão de amostra Two X SDS para análise do sangue ocidental das proteínas purificadas.
Células primárias de PSE cultivadas isoladas de olhos de doadores humanos demonstram uma morfologia típica de paralelepípedos, independentemente da idade do doador, tempo post-mortem de isolamento ou tempo de cultivo. A aplicação de pulsos elétricos de curto prazo a células primárias de EPR humanas. O uso do sistema de transfecção capilar não afeta negativamente a morfologia epitelial.
A análise sanguínea ocidental de sobrenadantes primários transfectados de cultura de células de PSE humana demonstram secreção de fator derivado do epitélio pigmentar em níveis consistentes sem silenciamento transgênico por mais de 500 dias. Como observado nesta análise sanguínea ocidental representativa do meio de cultura celular de transfecções realizadas em série, uma taxa de secreção de fator derivado do epitélio pigmentar universalmente maior é observada em 21 dias após a transfecção. Em uma cultura seguida, a secreção elevada de PEDF a longo prazo dura pelo menos 165 dias.
Além disso, a quantificação baseada em ELISA revela um aumento de 20 vezes da secreção do fator derivado do epitélio pigmentar total em células RPE humanas primárias transfectadas em comparação com as respectivas células de controle não transfectadas. Esse incremento também foi afirmado no nível de expressão gênica em que a expressão total do PEDF foi aumentada mais de 30 vezes. Ao tentar este protocolo, é importante usar células epiteliais pigmentares cuja morfologia corresponda ao status In Vivo.
Além disso, lembre-se de extrair a solução celular na ponta de transfecção sem bolhas de ar. As células transfectadas de forma estável podem ser usadas em diferentes modelos Ex Vivo ou In vivo para verificar a funcionalidade desta terapia de adição de genes baseada em células.
