Nosso laboratório projeta receptores imunes artificiais, como receptores de antígenos quiméricos, e estuda como eles afetam a biologia regulatória das células T. Ao inventar novas sequências de DNA e usar modelos de doenças em camundongos humanizados, pretendemos criar terapias de células imunes projetadas para doenças autoimunes, rejeição de transplantes, câncer e envelhecimento. Ao projetar receptores de antígenos quiméricos para células T reguladoras, é crucial considerar sua força.
As CAR Tregs de alta afinidade se comportam mais como células T efetoras, produzindo citocinas inflamatórias aumentadas e demonstrando maior atividade de morte. Nossa pesquisa em andamento indica que a redução da afinidade do CAR leva a melhores perfis de citocinas e função em CAR Tregs. O campo CAR Treg é incipiente e carece de padronização.
Nosso protocolo apresenta uma abordagem robusta e universal para gerar e testar CAR Tregs. Isso aumenta a reprodutibilidade e acelera a inovação, ao mesmo tempo em que orienta os laboratórios novos na pesquisa do CAR Treg, especialmente devido aos desafios da escassez de Tregs e requisitos especializados. Estudamos os mecanismos que as células T reguladoras usam para manter o equilíbrio imunológico e promover a cicatrização dos tecidos.
Nossa pesquisa inclui a compreensão da sinalização e função do CAR Treg, bem como a exploração de novos contextos de doenças em que a terapia com CAR Treg pode oferecer benefícios únicos em comparação com as estratégias atuais. Para começar, transfira o conteúdo do leucopak para um tubo cônico de 50 mililitros. Adicione um volume igual de DPBS com 2% de soro bovino fetal e misture delicadamente com uma pipeta.
Gire o tubo a 300g por 10 minutos em temperatura ambiente. Uma vez aspirado o sobrenadante, reconstituir o sedimento celular em dois mililitros de DPBS com soro bovino fetal a 2%. Em seguida, adicione oito mililitros de solução de cloreto de amônio à suspensão celular e misture por inversão suave.
Com a quebra, gire as células lavadas a 150g por 10 minutos em temperatura ambiente. Após aspirar o sobrenadante, ressuspender o pellet celular em 30 mililitros de DPBS com soro bovino fetal a 2%. Em seguida, gire 10 elevado a oito a 10 elevado a nove PBMCs a 500g por cinco minutos em temperatura ambiente.
E ressuspenda no tampão de separação celular a uma concentração de cinco vezes 10 elevado a sete células por mililitro. Para a classificação celular assistida por fluorescência de células T reguladoras, gire as células CD4 positivas a 500g por cinco minutos. Em seguida, reconstitua as células em 200 microlitros de DPBS.
Para cada um milhão de células, adicione um microlitro de FITC CD4 anti-humano, um microlitro de APC CD25 anti-humano e um microlitro de PE CD127 anti-humano. Depois de agitar suavemente o tubo, coloque-o em uma geladeira de quatro graus Celsius por 30 minutos. Depois que as células forem lavadas com 10 mililitros de DPBS com soro bovino fetal a 2%, gire-as a 500g por cinco minutos e ressuspenda suavemente as células coradas a 1,5 vezes 10 à potência de sete células por mililitro em DPBS com soro bovino fetal a 2%. Em seguida, passe a suspensão de células coradas através de uma tampa de filtro de 40 micrômetros em tubos de classificação de células assistidas por fluorescência.
Prepare tubos de coleta de 15 mililitros contendo três mililitros de meio RPMI10 e coloque-os no gelo. Finalmente, classifique as células T reguladoras CD4 positivas, CD25 altas, CD127 negativas e as células T convencionais CD4 positivas, CD25 baixas, CD127 positivas usando a classificação de células assistida por fluorescência. Para começar, pegue as células T reguladoras isoladas do sangue humano 48 horas após a ativação e ressuspenda-as.
Depois de contar as células, gire a 500g por cinco minutos em temperatura ambiente. Ressuspenda as células T reguladoras em RPMI10 a 1,25 vezes 10 elevado a seis células por mililitro com 1.000 unidades internacionais por mililitro de interleucina-2. Agora, adicione cada alíquota de lentivírus a 2,5 vezes 10 à potência de cinco células T reguladoras em 200 microlitros em um tubo de microcentrífuga.
Espinar a 1.000g durante uma hora a 32 graus Celsius. Mova cada reação de 200 microlitros para uma placa de 24 poços. Incube a placa com as células T reguladoras transduzidas em uma incubadora de cultura de tecidos durante a noite.
Complete cada poço até dois mililitros com meio RPMI10, com a concentração final de interleucina-2 sendo de 1.000 unidades internacionais por mililitro. Avalie a eficiência da modificação gênica usando citometria de fluxo, conforme mostrado aqui. Para começar, tome células T reguladoras ressuspensas com esferas anti-CD3, CD28 em um tubo cônico de 15 mililitros 48 horas após a ativação.
Incube a suspensão celular em um ímã por três minutos. Enquanto estiver no ímã, transfira as células do meio via pipeta para um novo tubo. Após a remoção do grânulo, deixe as células T reguladoras desbeadadas descansarem em RPMI10 por duas horas.
Em seguida, gire as células T reguladoras a 500g por cinco minutos. Uma vez decantado o sobrenadante, ressuspender as células em meio sérico reduzido pré-aquecido a quatro vezes 10 à potência de seis células por mililitro. Alíquotas de células em 100 microlitros em tubos de centrífuga de 1,5 mililitro de baixa ligação a proteínas.
Adicione o vírus adeno-associado do receptor de antígeno quimérico a uma multiplicidade de infecção de 20.000 a cada amostra e ressuspenda. Em seguida, incube os tubos de reação na incubadora de cultura de tecidos por uma hora. Durante a incubação, prepare complexos de ribonucleoproteínas CRISPR-Cas9 adicionando 8,3 microlitros de proteína Cas9 a 2,5 microlitros de RNA guia único, visando o locus do gene de rastreamento.
Depois de misturar bem os componentes, incube a mistura de ribonucleoproteínas por 15 minutos a 37 graus Celsius na incubadora de cultura de tecidos. Em seguida, encha um novo tubo de eletroporação com três mililitros de tampão de eletroporação de alta osmolaridade. Insira o tubo de eletroporação cheio na estação de pipeta do sistema de eletroporação até ouvir um clique.
Defina as condições de eletroporação para 2.200 volts, 20 milissegundos, um pulso no sistema de eletroporação. Quando a incubação de uma hora com o vírus adeno-associado estiver concluída, gire as células com o vírus a 300g por cinco minutos em temperatura ambiente. Uma vez aspirado o sobrenadante, ressuspenda o pellet celular em 100 microlitros do tampão de ressuspensão celular fornecido pelo sistema de eletroporação por amostra.
Em seguida, adicione 10,8 microlitros de complexo de ribonucleoproteína por amostra e misture bem com uma pipeta sem criar bolhas. Agora, insira uma ponta de eletroporação de 100 microlitros empurrando a pipeta até sua segunda parada para abrir a pinça. Posicione a cabeça superior da pipeta na ponta de eletroporação até que o clamp encaixe firmemente na haste de montagem do pistão.
Solte gradualmente o botão enquanto mantém a pressão para baixo na pipeta para garantir que a ponta se encaixe perfeitamente sem folgas. Em seguida, pressione a pipeta até a primeira parada e mergulhe a ponta de eletroporação na mistura de ribonucleoproteína celular. Puxe suavemente a amostra para dentro da pipeta sem bolhas.
Insira a pipeta com a ponta de eletroporação montada contendo a amostra verticalmente no tubo E até ouvir um clique. Depois de confirmar as configurações ideais para células T reguladoras humanas, pressione Iniciar na tela sensível ao toque para eletroporar as células. Aguarde até que a tela sensível ao toque seja exibida como concluída.
Remova suavemente a pipeta e transfira imediatamente a amostra para a placa preparada de seis poços contendo 2,5 mililitros de meio RPMI10 livre de antibióticos pré-aquecido com interleucina-2 por poço. Depois de balançar suavemente a placa em movimentos lineares, coloque-a na incubadora de cultura de tecidos. No dia seguinte, 16 a 18 horas depois, substitua o meio por meio contendo antibióticos.
Conte as células T reguladoras eletroporadas e cultive a 10 elevado a seis células por mililitro com 1.000 unidades internacionais por mililitro de interleucina-2.
