Este protocolo descreve um processo simplificado e compatível com GNP de transdução de células T primárias humanas com gene de interesse. Esta técnica em particular foi projetada para ser econômica e compatível com o PNB sem o uso de plataformas caras de fabricação de sistemas fechados atualmente disponíveis em muitos centros acadêmicos. Este método poderia potencialmente ser aplicado à geração de terapias celulares modificadas por genes, incluindo, mas não limitado a, células T CAR, que têm sido uma mudança de paradigma para combater malignidades hematológicas.
Para isolar as CMSP das células coletadas após leucaferese do sangue do doador, realizar uma centrifugação por gradiente de densidade baseada em polissacarídeo da amostra, mantendo uma relação reagente/amostra de 1:2, centrifugando a mistura a 800 G por 30 minutos à temperatura ambiente com os freios desligados. Em seguida, usando uma micropipeta, colete os PBMCs em um tubo limpo de 50 mililitros. Lave as células duas vezes com PBS por centrifugação.
Antes de ressuspender as células lavadas em meio hematopoiético completo. Ativar cerca de 20 milhões das células obtidas adicionando 10 microlitros de reagente de estimulação de células T para cada 2 milhões de células. Em seguida, depois de adicionar interleucina-2 humana recombinante a 20 unidades por mililitro, misture a solução suavemente e transfira-a para uma placa de seis poços.
Incubar as células a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 72 horas antes de realizar a transdução viral. No terceiro dia, transferir a cultura celular para um tubo cônico de 50 mililitros e misturá-lo completamente. Centrifugar o tubo a 300G por 10 minutos à temperatura ambiente para remover o reagente de ativação.
Descarte completamente o sobrenadante e ressuspenda o pellet em um mililitro de meio completo antes de contar as células. Ajuste o volume de suspensão da célula usando meio completo para alcançar uma concentração que permita chapear 0,5 milhão de células por poço em uma placa de 24 poços. Adicionar interleucina-7 humana recombinante e interleucina-15 humana recombinante às células em concentrações adequadas.
Em um tubo separado, adicionar a quantidade desejada de vectofusina-1 ao meio Opti-MEM, considerando o volume viral final a ser utilizado. Combine esta mistura com o vírus concentrado em uma proporção de um para um, garantindo uma mistura completa. Em seguida, adicione a mistura resultante contendo o vírus às células.
Ajuste o volume total de cada poço para 400 microlitros usando meio completo, se necessário. Depois de cobrir a placa com uma tampa, selá-la usando uma película de parafina antes de centrifuga-la a 1000G por duas horas a 32 graus Celsius. Incubar a placa durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
No dia seguinte, colete e puxe as células de cada poço para um tubo de 50 mililitros. Em seguida, centrifugar as células a 400G e temperatura ambiente por cinco minutos. Depois de remover cuidadosamente o sobrenadante, ressuspenda totalmente o pellet em um mililitro de meio completo antes de contar as células.
Em seguida, ajuste a concentração celular com o meio para atingir 1 milhão de células por mililitro e adicione interleucina-7 recombinante humana e interleucina-15 recombinante humana a 155 e 290 unidades por mililitro, respectivamente, antes de cultivar as células. Uma vez atingido o número de células desejado, colete e transfira as células para tubos de 50 mililitros e centrifugue-as. Após a remoção do sobrenadante, ressuspenda o pellet em 10 mililitros de meio para contar as células.
Após centrifugar novamente, descarte completamente o sobrenadante e ressuspenda o pellet em uma solução de criopreservação composta por 50% de HSA e 40% de HBSS, na concentração de 10 milhões de células por mililitro por frasco de crio. Transfira 0,9 mililitros de suspensão celular cada para o número necessário de frascos para injetáveis de crio e adicione 10% de dimetilsulfóxido a cada frasco para injetáveis de crio. Coloque os frascos de crio no gelo e leve-os rapidamente para um congelador de taxa controlada para criopreservação.
Em seguida, transfira as amostras criopreservadas para um tanque de nitrogênio líquido monitorado para armazenamento de longo prazo. Para avaliar a eficiência da transdução, adicione 500 microlitros de tampão FACS à amostra em um tubo de separação de células ativadas por fluorescência ou FACS. Depois de centrifugar a amostra a 400G e temperatura ambiente durante cinco minutos, eliminar completamente o sobrenadante utilizando uma pipeta.
Ressuspender o pellet em uma solução diluída de um a cinco CD3 em tampão FACS. Vórtice a amostra e incube por 30 minutos em gelo no escuro antes de centrifugar, como demonstrado anteriormente. Em seguida, após descartar totalmente o sobrenadante, ressuspenda o pellet em uma solução diluída de um a 20 de 7-AAD em tampão FACS.
Vórtice essa mistura antes de incubá-la por 10 minutos no gelo em um ambiente escuro. Finalmente, adicione 200 microlitros de tampão FACS e proceda à análise da amostra usando um citômetro de fluxo. A análise de viabilidade das células transduzidas revelou que, no 14º dia, mais de 95% das células estavam CD3 positivas e vivas após a exclusão de células 7-AAD positivas, indicando sucesso na ativação e expansão das células T.
A eficiência de transdução dentro da população CD3 positiva foi medida em 58,7% em comparação com as células não transduzidas, que exibiram uma eficiência de transdução de 0,51%Quando as células transduzidas foram expandidas do quarto dia até o dia 14, com subcultura a cada dois dias, as células sofreram uma expansão de 25 vezes. O produto passou por diversos testes de controle de qualidade e atendeu a todos os critérios estabelecidos, indicando sua adequação para uso posterior. Todo o procedimento deve ser realizado com técnicas rigorosamente assépticas.
E a etapa mais complicada é o processo de transdução, onde é preciso levar em conta todos os reagentes a serem adicionados para manter um volume total específico.
