Gostaríamos de agradecer o espírito cooperativo de todos os membros Caldwell Lab. A Basil O&#39;Connor Scholar Award da March of Dimes e uma concessão de CARREIRA do National Science Foundation para GAC, bem como uma Bolsa de Investigação Graduação Programa de Ciência da Howard Hughes Medical Institute para a Universidade do Alabama, ter financiado a excitabilidade neuronal e pesquisa da epilepsia no Laboratório de Caldwell.

Aldicarbe Paradigm Exposição <ol><li> No primeiro dia, garantir que pelo menos trinta vermes adultos jovens estágio de cada genótipo e de cada repetição estará disponível para ensaios aldicarbe no segundo dia. É melhor se um experimentador seleciona cinquenta ou mais vermes estágio L4 em placas NGM fresco (melhor sem nistatina), que contêm E. coli (de preferência OP50) como fonte de alimento, e cultivá-las por 12-24 horas a uma temperatura constante e permissivo (20 ° C a 22 ° C é melhor, apesar de 25 ° C está bem). </li><li> No segundo dia, fazer uma solução estoque 100 mM de aldicarbe com etanol 70% (EtOH) e 30% DDH 2 O. Espalhe a quantidade adequada de aldicarbe em NGM menos nistatina placas com volumes definidos para alcançar as concentrações de aldicarb desejado. Nós sempre usar 0,5 mM aldicarbe por plaqueamento 37,5 mL de 100 mM aldicarbe em 7,5 mL placas NGM. Permitir que as placas de aldicarbe para secar por cerca de 30-60 minutos em temperatura ambiente. Não é necessário para quebrar as tampas. Alternativamente, aldicarb podem ser adicionados a NGM e armazenados a 4 ° C durante uma semana. &nbsp;</li><li> Após a secagem da placa, volumes consistente de E. coli (de preferência OP50) para o centro de cada prato aldicarbe e secar por mais 30-60 minutos em temperatura ambiente. Nós placa consistentemente 25 mL de OP50, o que cria um gramado alimentos tamanho suficiente para manter os worms concentrados em um local pequeno, sem superlotação. &nbsp;</li><li> Quando o alimento é gramado seco, pode-se prosseguir com testes de aldicarbe. Devido à natureza subjetiva de ensaios aldicarb, é altamente recomendado que as experiências sejam realizadas &quot;às cegas&quot;. Um colega do experimentador primária pode re-rotular as placas originais com worms a ser testada. Da mesma forma, o colega poderia transferir worms das placas originais para placas aldicarbe ciphered imediatamente antes de iniciar um temporizador. Se o experimentador antecipa assaying uma cepa particular de worms com um fenótipo característico, tais como incoordenação, então também deve haver um controle com um fenótipo semelhante para reduzir viés. Além disso, é melhor se o experimentador ensaios uma cepa do tipo selvagem, assim como uma cepa resistente e uma estirpe de hipersensibilidade, em paralelo para ajudar a padronizar os experimentos. O pesquisador deve se esforçar para analisar um número consistente de worms para cada repetição. Estamos constantemente analisar thirty worms de um genótipo único para cada repetição. Nós também realizar pelo menos três repetições para cada experimento. Um experimentador experiente deve ser capaz de analisar, pelo menos, seis estirpes de cada vez. &nbsp;</li><li> Contar o número de worms paralisado por insistência de uma forma consistente de cada verme com um fio de platina. Estamos constantemente nossos produtos worms duas vezes na cabeça e duas vezes na cauda a cada 30 minutos para um total de três horas. Cessação do bombeamento da faringe também pode ser usado para definir a paralisia, mas apenas se o pesquisador emprega uma definição consistente de paralisia de todos os ensaios. Além disso, é importante notar que alguns vermes, especialmente aqueles que são resistentes ao aldicarb, pode tentar rastejar fora do prato. Neste caso, o pesquisador pode se espalhar uma quantidade consistente de ácido palmítico, uma barreira física para locomoção worm, em torno das placas aldicarbe. Nós espalhamos 25 mL de ácido palmítico 10 mg / mL EtOH. </li></ol> PTZ Paradigm Exposição <ol><li> No primeiro dia, garantir que pelo menos trinta vermes adultos jovens estágio de cada genótipo e de cada repetição estará disponível para ensaios PTZ no segundo dia. É melhor se um experimentador seleciona cinquenta ou mais vermes estágio L4 em placas NGM fresco (melhor sem nistatina), que contêm E. coli (de preferência OP50) como fonte de alimento, e cultivá-las por 12-24 horas a uma temperatura constante e permissivo (20 ° C a 22 ° C é melhor, apesar de 25 ° C está bem). </li><li> No segundo dia, fazer um 0,5 g PTZ / mL solução estoque DDH 2 O de PTZ. Espalhe a quantidade adequada de PTZ para NGM menos placas nistatina com volumes definidos para alcançar as concentrações PTZ desejado. Porque preferimos dose-resposta ensaios para PTZ, nós placa quantidades variadas de PTZ para 7,5 mL placas NGM. Por exemplo, pode-se 37,5 mL placa da solução-mãe PTZ em uma placa NGM 7,5 mL para fazer uma solução de 5 mg PTZ / mL. Permitir que as placas PTZ para secar por cerca de 60-120 minutos em temperatura ambiente. Não é necessário para quebrar as tampas. Alternativamente, PTZ podem ser adicionados diretamente a NGM, mas deve ser imediatamente utilizada para os ensaios, quando solidificar. A estabilidade do PTZ é consideravelmente menor do que a de aldicarbe. Portanto, os ensaios com placas PTZ mais velhos são menos confiáveis. PTZ devem ser armazenadas a -20 ° C em um dessecador com um agente de secagem antes do uso. Nós preferimos descartar PTZ cerca de dois meses após a abertura para assegurar a estabilidade. </li><li> Após a secagem da placa, volumes consistente de E. coli (de preferência OP50)para o centro de cada prato PTZ e secar por mais 30-60 minutos em temperatura ambiente. Nós placa consistentemente 25 mL de OP50, o que cria um gramado alimentos tamanho suficiente para manter os worms concentrados em um local pequeno, sem superlotação. &nbsp;</li><li> Quando o alimento é gramado seco, pode-se prosseguir com testes de PTZ. Embora ensaios PTZ são menos subjetivos que os ensaios aldicarb, ainda é altamente recomendado que as experiências sejam realizadas &quot;às cegas&quot;. Um colega do experimentador primária pode re-rotular as placas originais com worms a ser testada. Da mesma forma, o colega poderia transferir worms das placas originais para placas PTZ ciphered imediatamente antes de iniciar um temporizador. Se o experimentador antecipa assaying uma cepa particular de worms com um fenótipo característico, tais como incoordenação, então também deve haver um controle com um fenótipo semelhante para reduzir viés. Além disso, é melhor se o experimentador ensaios uma cepa do tipo selvagem, assim como com cepas anterior ou de corpo inteiro convulsões, em paralelo para ajudar a padronizar os experimentos. O pesquisador deve se esforçar para analisar um número consistente de worms para cada repetição. Estamos constantemente analisar thirty worms de um genótipo único para cada repetição. Nós também realizar pelo menos três repetições para cada experimento. Um experimentador experiente deve ser capaz de analisar, pelo menos, três cepas de cada vez. No entanto, a freqüência ea intensidade das convulsões induzidas por PTZ-geral pico entre 15-30 minutos de exposição, e depois como worms atenuar-se paralisado ou, em alguns casos, se aclimatar à droga. </li><li> Contar o número de &quot;epilepsia-like&quot; convulsão worms a cada 30 minutos para um total de uma hora. É melhor para marcar o número de vermes com convulsões anterior, que chamamos de &quot;cabeça-bobs&quot;, separada do número de vermes com o corpo inteiro convulsões, paralisia de corpo inteiro, o que chamamos de &quot;tônico&quot;, ou uma combinação de convulsões anterior com paralisia BWM, que chamamos de &quot;tônico-clônicas&quot;. A maioria dos worms de um genótipo único exibem somente um tipo de convulsão. No entanto, tônico-clônicas worms muitas vezes se tornam completamente tônico, por isso deve-se continuar o ensaio últimos 30 minutos, mesmo se todos os worms já exibiu convulsões. Além disso, é importante notar que alguns vermes podem tentar rastrear fora do prato. Neste caso, o pesquisador pode se espalhar uma quantidade consistente de ácido palmítico em torno das placas PTZ. Nós espalhamos 25 mL de ácido palmítico 10 mg / mL EtOH. </li></ol> As respostas comportamentais dos selecionados C. elegans Mutants Transmissão Synaptic para aldicarbe e PTZ <table style="height: 157px;" border="1"><tbody><tr><th> Nome mutante </th><th> Papel Synaptic </th><th> Comportamento sem Drogas </th><th> Resposta comportamental de Aldicarb (em comparação ao tipo selvagem do N2) </th><th> Resposta comportamental para PTZ </th></tr><tr><td> tom-1 (ok188) </td><td> inibe a transmissão sináptica </td><td> descoordenada </td><td> taxa aumentada de paralisia </td><td> indistinguível de tipo selvagem </td></tr><tr><td> unc-43 (n498n1186) </td><td> complexo </td><td> descoordenada </td><td> taxa aumentada de paralisia </td><td> de corpo inteiro convulsões </td></tr><tr><td> unc-25 (e156) </td><td> promove a transmissão GABA </td><td> descoordenada </td><td> taxa aumentada de paralisia </td><td> convulsões anterior, de corpo inteiro paralisia </td></tr><tr><td> snb-1 (md247) </td><td> promove a transmissão sináptica </td><td> descoordenada </td><td> taxa reduzida de paralisia </td><td> convulsões anterior </td></tr><tr><td> unc-4 (E120) </td><td> ACh promove a transmissão </td><td> descoordenada </td><td> taxa reduzida de paralisia </td><td> indistinguível de tipo selvagem </td></tr></tbody></table> Dois estimulantes neural, um inibidor da acetilcolinesterase, chamado aldicarbe e um antagonista dos receptores GABA, chamado pentilenotetrazol (PTZ), pode ser usado de forma complementar para caracterizar C. elegans mutantes transmissão sináptica. Acetilcolina excitatórios em excesso (ACh) se acumula no corpo de verme parede neuromuscular junções (NMJs) de mutações deletérias em reguladores negativos da ACh transmissão (por exemplo, tom-1 e unc-43) ou reguladores positivos da transmissão inibitória GABA (por exemplo, unc-25). Inversamente, os níveis de excitação ACh em NMJs verme são obscurecidos por mutações deletérias em reguladores positivos da transmissão sináptica geral (por exemplo, snb-1) ou ACh genes específicos de transmissão (por exemplo, unc-4). Quando comparado com vermes do tipo selvagem N2, worms mutante com elevada transmissão de ACh excitatórios na NMJs apresentam acréscimos de aldicarbe induzida por paralisia, enquanto worms mutante com baixa transmissão ACh excitatórios demonstram taxas reduzidas de aldicarbe induzida por paralisia. Embora PTZ interrompe sincronia neuronal em C. elegans músculos da parede do corpo, não muito diferente aldicarb, PTZ também antagoniza inibitória GABA em músculos da cabeça C. elegans. Como resultado, a sensibilidade aldicarbe não pode prever com precisão a sensibilidade PTZ. Worms mutantes com defeitos específicos no regul negativo ou positivoção da transmissão ACh são indistinguíveis dos vermes do tipo selvagem N2 na presença de PTZ, enquanto worms mutantes com defeitos na regulação positiva da transmissão sináptica geral ou defeitos específicos na exposição a transmissão inibitória GABA robusta PTZ convulsões induzidas anterior. Além disso, unc-43-perda da função-mutantes mostrar de corpo inteiro convulsões na presença de PTZ e provavelmente outras anormalidades transmissão sináptica, que contribuem para as suas respostas droga única.

<ol>
	<li>Mahoney, T. R., Luo, S., Nonet, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+synaptic+transmission+in+Caenorhabditis+elegans+using+an+aldicarb-sensitivity+assay.">Analysis of synaptic transmission in Caenorhabditis elegans using an aldicarb-sensitivity assay.</a> Nat. Protoc. 1, 1772-1777 (2006).</li><li>Williams, S. N., Locke, C. J., Braden, A. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epileptic-like+convulsions+associated+with+LIS-1+in+the+cytoskeletal+control+of+neurotransmitter+signaling+in+Caenorhabditis+elegans.">Epileptic-like convulsions associated with LIS-1 in the cytoskeletal control of neurotransmitter signaling in Caenorhabditis elegans.</a> Hum. Mol. Genet.. 13, 2043-2059 (2004).</li></ol>

Os protocolos atuais para a exposição com aldicarb C. elegans não permitem que pesquisadores a distinguir entre mutantes com déficits específicos de ACh transmissão e mutantes com déficits generalizados na transmissão sináptica, como ambas as classes de mutantes apresentam resistência ao aldicarbe. Da mesma forma, aldicarbe não pode ser usado para determinar se os mutantes têm déficits específicos na transmissão GABA ou falhas generalizadas para regular negativamente ACh transmissão, como ambas as classes de mutante...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Aldicarb</td>
<td>Reagent</td>
<td>Supelco, Inc.</td>
<td>PS734</td>
<td>Purchasable from Sigma</td>
</tr>
<tr>
<td>Pentylenetetrazole</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P6500</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

paradigms for pharmacological characterization of c. elegans synaptic transmission mutants

O nematóide, Caenorhabditis elegans, tornou-se um modelo conveniente para estudar a neurotransmissão. C. elegans é único entre os modelos animais, como a anatomia e conectividade de seu sistema nervoso foi determinada a partir de micrografias eletrônicas e refinado por ensaios farmacológicos. Neste vídeo, descrevemos como dois complementares estimulantes neural, um inibidor da acetilcolinesterase, chamado aldicarbe, e um ácido gama-aminobutírico (GABA) antagonista do receptor, chamado de pentilenotetrazol (PTZ), pode ser empregada para caracterizar especificamente sinalização em C. elegans junções neuromusculares (NMJs) e facilitar nossa compreensão da antagônicas circuitos neurais. De 302 C. elegans neurônios, dezenove neurônios GABAérgicos D-tipo do motor corpo inervam os músculos da parede (BWMs), enquanto quatro neurônios GABAérgicos, chamado RMEs, músculos da cabeça inervam. Por outro lado, os neurônios do motor 39 expressar o neurotransmissor excitatório, a acetilcolina (ACh), e antagonizar a transmissão GABA em BWMs para coordenar a locomoção. A natureza antagônica dos neurônios motores GABAérgicos e colinérgicos em corpo NMJs parede foi inicialmente determinada por ablação a laser e, mais tarde reforçada pela exposição aldicarbe. Resultados aldicarbe aguda de exposição em uma paralisia tempo-curso ou dose-resposta no tipo selvagem worms. No entanto, a perda de transmissão ACh excitatórios confere resistência ao aldicarb, como ACh menos acumula em NMJs worm, levando a uma menor estimulação da BWMs. Resistência ao aldicarb pode ser observado com ACh-específicas ou gerais mutantes função sináptica. Consistente com GABA antagônicas e transmissão de ACh, a perda de transmissão GABA, ou uma falta de regular negativamente ACh lançamento, confere hipersensibilidade ao aldicarbe. Embora a exposição aldicarbe levou ao isolamento de vírus homólogos numerosos genes de neurotransmissão, a exposição aldicarbe por si só não pode determinar de forma eficiente papéis predominantes para os genes e as vias de neurônios específicos C. elegans motor. Para esse fim, introduzimos uma abordagem complementar experimental, que usa PTZ. Mutantes neurotransmissão exibir fenótipos clara, distinta de aldicarbe induzida por paralisia, em resposta a PTZ. Do tipo selvagem worms, bem como os mutantes com incapacidades específicas para liberar ou receber ACh, não mostram sensibilidade aparente para PTZ. No entanto, os mutantes GABA, bem como em geral os mutantes função sináptica, display convulsões anterior de uma maneira tempo-curso ou dose-resposta. Mutantes que não podem regular negativamente a liberação do neurotransmissor em geral e, assim, secretam quantidades excessivas de ACh em BWMs, tornam-se paralisado em PTZ. Os fenótipos PTZ-induzida de discreta aulas mutante indicam que uma abordagem complementar com aldicarb e paradigmas exposição PTZ em C. elegans pode acelerar nossa compreensão da neurotransmissão. Além disso, vídeos demonstrando como realizamos os ensaios farmacológicos devem estabelecer métodos consistentes para C. elegans pesquisa.

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Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

Este vídeo demonstra como empregar dois estimulantes neural, aldicarb e pentilenotetrazol (PTZ), de forma complementar para estudar a função sináptica no nematóide, C. elegans. Esta abordagem complementar também podem ser usados ​​para lançar luz sobre mecanismos evolutivamente conservados para sincronia neuronal modular e tem implicações para a epilepsia e convulsões.

Paradigmas para Caracterização farmacológica de C. elegans Mutants Transmissão Sináptica

The nematode, Caenorhabditis elegans, has become an expedient model for studying neurotransmission. C. elegans is unique among animal models, as the ...

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Research

JoVE Journal

Biology

14.0K visualizações.  University of Alabama. Este vídeo demonstra como empregar dois estimulantes neural, aldicarb e pentilenotetrazol (PTZ), de forma complementar para estudar a função sináptica no nematóide, C. elegans. Esta abordagem complementar também podem ser usados ​​para lançar luz sobre mecanismos evolutivamente conservados para sincronia neuronal modular e tem implicações para a epilepsia e convulsões.

Vídeo: Paradigms for Pharmacological Characterization of C. elegans Synaptic Transmission Mutants

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Geração de transgênicos Estável C. elegans Usando microinjeção

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Biologia

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical shock or electrical stimulation is available for study of various aspects of seizure activity and behavior. All flies, including wild-type, will undergo seizure-like activity if stimulated at a high enough voltage. Seizure like activity is an all-or-nothing response and each genotype has a specific seizure threshold. The seizure threshold of a specific genotype of fly can be altered either by treatment with a drug or by genetic suppression or enhancement. The threshold is easily measured by electrophysiology. Seizure-like activity can be induced via high frequency electrical stimulation delivered directly to the brain and recorded through the dorsal longitudinal muscles (DLMs) in the thorax. The DLMs are innervated by part of the giant fiber system. Starting with low voltage, high frequency stimulation, and subsequently raising the voltage in small increments, the seizure threshold for a single fly can be measured.

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Using high frequency electrical stimulation, seizure-like activity can be induced in Drosophila. This activity is easily recorded from the giant fiber system.

Ensaios Neurocircuit para Apreensões em mutantes de Epilepsia Drosophila</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Geração de transgênicos C. elegans Por biobalística Transformação

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

Básico<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Métodos: Sincronização e observação

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Um Método para o cultivo embrionário<em&gt; C. elegans</em&gt; Células

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that exhibit partial and variable transmission rates of extrachromosomal arrays to the next generation. In addition, transgenic animals are mosaic and express the transgene in a variable number of cells. Extrachromosomal arrays can be integrated into the C. elegans genome using UV irradiation to establish nonmosaic transgenic strains with 100% transmission rate of the transgene. To that extent, F1 progenies of UV irradiated transgenic animals are screened for animals carrying a heterozygous integration of the transgene, which leads to a 75% Mendelian transmission rate to the F2 progeny. One of the challenges of this method is to distinguish between the percentage of transgene transmission in a population before (X% transgenic animals) and after integration (&#8805;75% transgenic F2 animals). Thus, this method requires choosing a nonintegrated transgenic line with a percentage of transgenic animals that is significantly lower than the Mendelian segregation of 75%. Consequently, nonintegrated transgenic lines with an extrachromosomal array transmission rate to the next generation &#8804;60% are usually preferred for integration, and transgene integration in highly transmitting strains is difficult. Here we show that the efficiency of extrachromosomal arrays integration into the genome is increased when using highly transmitting transgenic lines (&#8805;80%). The described protocol allows for easy selection of several independent lines with homozygous transgene integration into the genome after UV irradiation of transgenic worms exhibiting a high rate of extrachromosomal array transmission. Furthermore, this method is quite fast and low material consuming. The possibility of rapidly generating different lines that express a particular integrated transgene is of great interest for studies focusing on gene expression pattern and regulation, protein localization, and overexpression, as well as for the development of subcellular markers.

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

This protocol describes a rapid and low material consuming procedure for the integration of transgenic extrachromosomal arrays into the Caenorhabditis elegans genome using ultra violet (UV) irradiation. Furthermore, this protocol is particularly well suited for transgenic lines that transmit extrachromosomal arrays at a high rate.

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that ...

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed under anoxia for 20 hr&#160;(simulated ischemia), and subsequently moved to a normal atmosphere with food (simulated reperfusion). This experimental paradigm results in increased death and neuronal damage, and techniques are presented to assess organism viability, alterations to the morphology of touch neuron processes, as well as touch sensitivity, which represents the behavioral output of neuronal function. Finally, a method for constructing hypoxic incubators using common kitchen storage containers is described. The addition of a mass flow control unit allows for alterations to be made to the gas mixture in the custom incubators, and a circulating water bath allows for both temperature control and makes it easy to identify leaks. This method provides a low cost alternative to commercially available units.

An Anoxia-starvation Model for Ischemia/Reperfusion in C. elegans

A protocol is described that uses anoxia/starvation in C. elegans to model ischemia/reperfusion. Functional outcomes include increased mortality, visible abnormalities in GFP-labeled neuronal processes, and impaired behavioral responses that require neuronal function.

Um modelo de anóxia-inanição por isquemia / reperfusão em<em&gt; C. elegans</em

Protocols for anoxia/starvation in the genetic model organism C. elegans simulate ischemia/reperfusion. Worms are separated from bacterial food and placed ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

Métodos para a pele ferimento e Ensaios para Responses ferida no<em&gt; C. elegans</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

Métodos para avaliar Subcelulares Compartimentos de músculo em<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...