Este protocolo permite que os pesquisadores observem como os C-elgans respondem ao agonista agonista do receptor acetilcolina Levamisole. A sensibilidade do levamisole alterado pode sugerir defeitos na sinalização em sua junção neuromuscular ou função muscular. Uma grande vantagem é que a natação vigorosa de C-elgans na solução levaisole permite aos pesquisadores quantitativar o tempo dependente da paralisia de centenas de vermes em apenas uma hora.
Contar o número de vermes em cada poço a cada cinco minutos pode ser esmagador. Número de poços avaliados ou pontos de tempo podem ser ajustados se necessário. Para começar a preparar a mídia de crescimento nematoide combinando três gramas de cloreto de sódio, 2,5 gramas de tom de pep e 17 gramas de ágar com um litro de água deionizada em um frasco com uma barra de mexida.
Depois de autoclaving, coloque a mídia em uma placa quente definida para 70 graus Celsius e mexa a uma velocidade moderada por uma hora. Adicione um mililitro de cinco miligramas por mililitro de colesterol em sentido para evitar a precipitação. Um mililitro de um cloreto de cálcio molar, um mililitro de um sulfato de magnésio molar, e 25 mililitros de um tampão de fosfato de potássio de pH 6.0 molar para a mídia.
Transfira dois mililitros de mídia de crescimento de nematoides em cada poço de uma placa de poço 24 com uma pipeta sorológica estéril. Permitiu que as placas secassem na parte superior do banco por dois dias antes de sentar com bactérias. Escolha uma única colônia op 50 em caldo B e coloque a cultura tremendo a 37 graus Celsius durante a noite.
Usando uma pipeta estéril, solte 30 microliters de suspensão OP50 no ágar no meio de cada poço. deixe as placas sentarem-se à temperatura ambiente por pelo menos dois dias após o assento para permitir que um gramado bacteriano se forme. Cresça tipo selvagem unc-63 Lev10 e unc-49 C-elgan até a idade adulta em placas de seis centímetros, preparando pelo menos oito placas por cepa.
Prepare a solução de branqueamento sob o capô no dia da sincronização. Misture 10 mililitros de alvejante, 2,5 mililitros de hidróxido de sódio e 37,5 mililitros de água deionizada em um tubo de crônica de 50 mililitros. Usando uma pipeta de transferência de plástico lavar vermes adultos gravid de pelo menos quatro placas com tampão M9 e transferi-los para um tubo de crônica de 15 mililitros.
Gire esse 716 G por um minuto em temperatura ambiente e, em seguida, remova o super natant usando uma pipeta de transferência. Adicione 10 mililitros da solução de branqueamento. Agite suavemente o tubo por quatro minutos até que a maioria, mas nem todas as carcaças de vermes se dissolveram.
Gire a 716 G por um minuto. Despeje a solução de alvejante em um movimento. Enquanto o tubo não estiver agitado neste momento, os ovos grudarão na lateral do tubo a 15 mililitros de tampão M9 e invertido.
Gire a 716 G por um minuto e despeje o tampão M9 em um movimento suave. Repita esta lavagem com a solução tampão três vezes. Após a lavagem final, adicione 10 mililitros de M9 fresco e coloque em um rotador durante a noite a 15 graus Celsius para isolar uma população sincronizada de animais de estágio larval famintos.
Imprima até 24 placas de poço e atribua cepas a lugares randomizados. Aproximadamente 24 horas após a preparação do alvejante, gire para baixo eclodidos vermes L1 famintos a 716 G por um minuto em temperatura ambiente. Remova aproximadamente nove mililitros de tampão M9 com uma pipeta de transferência de plástico e, em seguida, misture suavemente os vermes de estágio larval famintos no tampão M9 restante.
Imediatamente pipete três microlitros dos worms e tampão M9 em um slide de microscópio e determine o número de L1.. O número desejado é de 20 a 30 L1 em três microliters. Pipeta três microliters de L1 em cada poço de acordo com o mapa da placa pré-feita, deixe os vermes crescerem até a idade adulta por três dias a 20 graus Celsius.
Imprima a ficha de dados em branco que será usada para registrar o número de worms movendo-se em cada poço a cada cinco minutos durante uma hora. Verifique os vermes nas 24 placas do poço. Usando um marcador, faça um X na tampa da placa sobre quaisquer poços que tenham contaminação, tenham fome ou tenham muitos vermes, o que dificultará a contagem.
Faça a solução Levaisole 0,4 milimão adicionando 200 microliters de 100 mililitros de levamisole a 50 mililitros de M9. Inicie um temporizador e, em seguida, usando uma pipeta de transferência adicione um mililitro de 0,4 mililitro de levamisole aos dois primeiros poços, de tal forma que os animais estão nadando livremente. Continue adicionando Levamisole aos poços adjacentes, cambaleando o tempo de acordo com o número de poços a serem avaliados. Em cinco minutos, comece contando manualmente apenas o número de worms em movimento em cada poço, começando com o primeiro poço, e regise esse número na ficha técnica.
Continue contando o número de vermes em movimento em cada poço a cada cinco minutos por uma hora. No final do ensaio ou quando o tempo permitir, registo o número total de vermes em cada poço. Obtenha a placa, mapa e registro qual cepa corresponde a cada poço.
Digite os dados em uma planilha começando com o número total de worms em cada poço e organizando por genótipo. Combinando dados dos poços, determine o número de vermes se movendo em cada ponto de partida. Use isso para calcular o número que paralisa em cada ponto de tempo.
Faça uma tabela de dados de modo que a coluna da mão esquerda indique tempo e as colunas subsequentes contenham os dados de cada cepa. Para cada animal que estiver paralisado nos primeiros cinco minutos, crie uma linha e entre em uma por cinco minutos. Repita isso para cada ponto de tempo.
Para todos os animais que não paralisam até o final do ensaio, entre em um zero por 60 minutos. Use esses dados para criar uma curva de sobrevivência no software estatístico específico utilizado aqui para exibir visualmente a paralisia dependente do tempo da população. Os dados de todas as cepas indicadas devem ser inseridos na mesma tabela de dados, deixando os espaços conforme necessário.
Mutações em subunidades do receptor de acetilcolina levamisole, bem como em genes necessários para o agrupamento de receptores de acetilcolina sensível levamisole pós-sináptico, causam resistência à paralisia induzida por Levamisole, como observado nos mutantes unc-63 e Lev-10, respectivamente. A perda do canal de íons porta-se GABA unc-49 causou hipersensibilidade de Levamisole devido à interrupção do equilíbrio adequado da sinalização colinérgica e GABAérgica. A preparação adequada de 24 placas de poço é essencial.
Se os gramados bacterianos não estiverem secos antes de detectar a solução levamisole de L1 pode ficar nublado durante o ensaio, o que inibe a observação. Modificando as 24 placas do poço, este protocolo pode ser realizado com animais abatidos pela RNAi. Isso permite que os pesquisadores estudem os genes de C-elgan, para os quais os mutantes não estão disponíveis.
