Бесклеточной системе Пробирной Оценка нейтрализующей способности ГМ-КСФ антител с использованием рекомбинантных растворимых ГМ-КСФ рецептор

Резюме

Мы разработали бесклеточной связывание с рецепторами анализа для оценки связывания гранулоцитов и макрофагов колониестимулирующий фактор (GM-CSF) с рецепторами. Это позволяет нам оценить конкурентного ингибирования биотинилированного GM-CSF связывания с растворимыми GM-CSF рецепторов альфа-ГМ-КСФ аутоантител с отличной воспроизводимости.

Аннотация

ФОН: Ранее мы показали, что нейтрализующей способности, но не концентрации ГМ-КСФ аутоантител коррелирует с тяжестью заболевания у пациентов с аутоиммунными легочного альвеолярного протеиноз (PAP) ^1-3. Как отмена GM-CSF биологическую активность в легких является вероятной причиной аутоиммунных PAP ^4,5, это перспективное для измерения нейтрализующей способности ГМ-КСФ аутоантител для оценки тяжести заболевания у каждого пациента с PAP.

До сих пор, нейтрализующей способности ГМ-КСФ аутоантител была оценена путем вычисления замедление роста у человека клеток костного мозга или TF-1 клетки стимулировали ГМ-КСФ ^6-8. В биопроб система, однако, часто бывает проблематично получить достоверные данные, а также сравнивать данные из различных лабораторий, в связи с техническими трудностями в поддержании клеток в постоянном состоянии.

ЦЕЛЬ: имитировать GM-CSF привязки к GM-CSF рецепторов на поверхности клетки использованием бесклеточных рецептор-связывающий-анализа.

Методы: Трансгенные шелкопряда технология применяется для получения большого количества рекомбинантных растворимых GM-CSF рецепторов альфа (sGMRα) с высокой чистоты ^9-13. Рекомбинантный sGMRα содержится в гидрофильные слои серицина шелковых нитей, не будучи слит с протеинами шелка, и, таким образом, мы можем легко извлечь из коконов в хорошей чистоты с нейтральным водных растворах ^14,15. К счастью, олигосахарид структур, которые имеют решающее значение для связывания с GM-CSF, больше похожи на структуры человеческого sGMRα, чем те, производимых другими насекомыми или дрожжей.

РЕЗУЛЬТАТЫ: бесклеточной анализа системы с помощью sGMRα дали данные с высокой пластичностью и надежности. GM-CSF привязки к sGMRα была дозозависимой ингибируется поликлональных GM-CSF аутоантител в подобной манере к биопроб использованием ТФ-1 клетках, что свидетельствует о нашей новой бесклеточной анализа системы с помощью sGMRα более полезно для измерения нейтрализующей активностью ГМ-КСФ аутоантител, чем системы с помощью биопроб TF-1 ячейки или человеческих клеток костного мозга.

Заключение: Мы созданы бесклеточной анализа количественного нейтрализующей способности ГМ-КСФ аутоантител.

протокол

1. Производство и очистка sGMRα

1. Amplify кДНК sGMRα из плаценты человека библиотеки кДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).
2. Добавить 50 базовых 5'-UTR последовательность бакуловирус конце полиэдрина и 27 базы кодирования RGS Его-теги к концу 3 'ампликона ПЦР другим ПЦР.
3. Вставьте усиливается ПЦР-продукта в плазмиду pMSG1.1MG.
4. Inject построить psGMR/M1.1MG с помощником вектор pHA3PIG в яйца тутового шелкопряда PND-w1 напряжения.
5. Задняя вылупились G0 личинок моли при температуре 25 ° C. Экран G1 эмбрионов, полученных в результате скрещивания между братьями и сестрами или с PND-W1 для выражения MGFP в глазах целью получения трансгенных шелкопрядов подшипников sGMRα гена.
6. Извлечение рекомбинантный sGMRα из коконов тутового шелкопряда трансгенных с фосфатным буфером, содержащим 500 мм NaCl и перемешивали при 4 ° С в течение 24 часов.
7. Центрифуга образца при 20000 г в течение 15 мин для удаления осадков.
8. Применить к надосадочной Никель-аффинной колонке.
9. Промыть колонку с 10 мМ имидазол, 500 мм и 20 мм NaCl фосфат натрия, pH6.3 и элюируются с градиентом имидазола от 10мм до 250мм. Бассейн Фракции, содержащие очищенный sGMRα и диализировать против фосфатно-солевом буфере (pH7.4) (PBS).

2. Биотинилирование рекомбинантного GM-CSF

1. Удалить сорбитол подготовки путем диализа против PBS.
2. Добавить 1 мл 20 мМ холодной натрия мета-периодатом решение при 4 ° С до решения на льду.
3. Инкубируйте образца в течение 30 минут на льду в темноте.
4. Добавить глицерина в растворе при конечной концентрации 15 мм.
5. Диализировать решение против 100 мМ буфера ацетата натрия (pH5.5)
6. Добавить биотин гидразида к раствору при конечной концентрации 5 мМ и непрерывно перемешивать раствор для 2 часа при комнатной температуре.
7. Удалить непрореагировавшего материала путем диализа против PBS, pH7.4.

3. Бесклеточной ГМ-КСФ рецептор-лиганд-связывающего анализа

1. Пальто планшет с 50 мкл моноклональных анти-polyHistidine антител течение ночи при 4 ° C.
2. Вымойте пять раз с 500 мкл из PBST.
3. Добавить 100 мкл блокирующего раствора и инкубировать в течение 3 часов при температуре 4 ° C.
4. Вымойте пять раз с 500 мкл из PBST.
5. Добавить 50 мкл sGMRα в блокировании решения и инкубировать в течение ночи при 4 ° C.
6. Вымойте пять раз с 500 мкл из PBST.
7. Добавить 25 мкл образцов, содержащих ГМ-КСФ аутоантител, а затем 25 мкл биотинилированного GM-CSF. Инкубировать 1 час при температуре 4 ° С с образованием sGMRα-GM-CSF комплекса.
8. Вымойте пять раз с 500 мкл из PBST.
9. Добавить 50 мкл 0,4 стрептавидином щелочной фосфатазы на 1 час при температуре 4 ° С до обнаружения биотинилированного GM-CSF связана sGMRα.
10. Вымойте пять раз с 500 мкл из PBST.
11. Добавить 50 мкл хемилюминесцентного субстрата в раствор и выдерживают в течение 1 часа при комнатной температуре.
12. Использование читателя пластины хемилюминесценции, обнаружения хемилюминесценции деятельности.

4. Представитель Результаты:

Первый шаг в ГМ-КСФ рецептор путь передачи сигнала является обязательным ГМ-КСФ, ГМ-КСФ рецептор альфа на поверхности клетки. Потому что ГМ-КСФ аутоантитела специфически связывается GM-CSF и блокировать его связывания с рецептором в пробирке ^16,17, мы предположили, что аутоантитела подавляют эту первую реакцию непосредственно привязки к ГМ-КСФ. Как было описано ранее (см. 9-15), мы применили трансгенных шелкопряда технологии получения большого количества рекомбинантных sGMRα с высокой чистоты.

Когда шелкопряда полученных рекомбинантных sGMRα был погружен на SDS-PAGE при невосстанавливающих условиях, sGMRα показал как мономерные (45 кДа) и димерных (90 кДа) формы, тогда как только мономерной форме был обнаружен в восстановительных условиях (рис. 1В) , указывая, что рекомбинантные sGMRα был смеси мономеров и дисульфид-связанных диммеры ^18.

Использование бесклеточной системе (рис. 2), мы оценили, ингибирование GM-CSF привязки к sGMRα ГМ-КСФ аутоантител (рис. 2, б и рис. 2С). Эти методы были описаны в ссылке 19, Урана и соавт. Ингибирование роста был тесно связан с обязательным торможение (г = 0,988, р = 0,002) при различных концентрациях ГМ-КСФ аутоантител (рис. 3А) ^19. Кроме того, обязательным торможение было значительно коррелирует с ростом торможения. Обязательные торможение увеличилась в зависимости от дозы, по GM-CSF аутоантител (рис. 3Б) ^19. Эти два параметра для сыворотки фракции IgG у разных больных были соотнесены друг с другом (г = 0,589 р = 0,006, рис. 3C). Ни одна из обязательных торможение, ни ингибирование роста коррелирует с Kd ценности, и таким образом, оба параметра были затронуты сродство ^19. Поэтому воспроизводимость данных между обязательными и гrowth торможение получены с помощью трех независимых экспериментах на трех различных образцов было оценено. Коэффициент вариации показал, что бесклеточной системе было больше отличных, чем у биопроб (таблица 1).

Рисунок 1. Блок-схема процедуры для производства sGMRα использованием трансгенных шелкопрядов. ) Структуры преобразования векторов ^9-11. Б) SDS-PAGE и Кумасси бриллиантовый синий-окрашивания очищенная sGMRα под сокращение и не-восстановительных условиях. sGMRα, растворимые GM-CSF рецепторов альфа MGFP, монстр зеленый флуоресцентный белок; BmNPVpol5'-UTR, 5'-нетранслируемой области последовательность Bombyx море ядерного полиэдроза вирус полиэдрина; SV40 Поля, SV40 полиА сигнальной последовательности, P _3xP3, 3xP3 промоутер, P _Ser1, Ser1 промоутер; FiBL Поля, фиброина L-цепи полиА сигнальной последовательности; HR3, Bombyx море ядерного полиэдроза вирус HR3 усилитель.

Рисунок 2. Схема бесклеточной анализа системы. ) Конкурентного связывания методом с использованием sGMRα производства тутового шелкопряда. В) Влияние нейтрализации и не-нейтрализующих антител на обязательную ингибирования бесклеточной системе. C) разница между обязательными торможение различных концентраций нейтрализующих антител и не-нейтрализующих антител. GM-CSF, гранулоцитов и макрофагов колониестимулирующий фактор; sGMRα, растворимые GM-CSF рецепторов альфа, Его, РГС-His-теги; А.П., щелочной фосфатазы.

Рисунок 3. GM-CSF обязательным торможения к sGMRα от влияния ГМ-КСФ или поликлональных антител в сыворотке крови фракции IgG у пациентов с аутоиммунными PAP. ) Взаимосвязь между обязательными торможение и торможение роста ГМ-КСФ аутоантител. Б) Привязка торможения при различных концентрациях ГМ-КСФ аутоантител. C) Взаимосвязь между IC ₅₀ процентов обязательными для торможения и торможения процентов роста в сыворотке крови фракции IgG ^19. IC _50, 50% ингибирующая концентрация, GM-CSF, гранулоцитов и макрофагов колониестимулирующий фактор.

Образец		B	C
Inter-анализа
# Определений	3	3	3
Среднее значение (% обязательные торможения)	61,6	63,8	69,7
Среднее значение (ингибирование% роста)	21,0	73,4	82,8
Коэффициент вариации (%) (% обязательные торможения)	6,0	5,6	8,3
Коэффициент вариации (%) (торможение% роста)	64,4	18,3	10,4

И анализы были проведены на 5 нг / мл GM-CSF и концентрации, равной GM-CSF аутоантител.

Таблица 1. Сравнение коэффициент вариации между обязательными процентов, а рост запреты получены с помощью трех независимых экспериментах.

Обсуждение

Бесклеточной анализа оценкам нейтрализующей способности ГМ-КСФ аутоантител с отличной воспроизводимостью и быстротой. Обязательные ингибирования GM-CSF аутоантитела IgG или сыворотке пациента фракций оценивали результаты анализа. Данные показали корреляцию между обязательными тормож...

Материалы