Infinium Анализ на крупномасштабных SNP генотипирования приложений

Резюме

Протокол описано, что использует Infinium анализов Illumina, чтобы выполнить масштабную генотипирование. Эти анализы могут надежно генотипу миллионы ОНП через сотни отдельных образцов ДНК в течение трех дней. После того, как генерируются эти генотипы могут быть использованы для проверки ассоциаций с множеством различных заболеваний или фенотипов.

Аннотация

Варианты генотипирования в геноме человека оказалась эффективным методом для выявления генетических ассоциаций с фенотипами. Распределение вариантов в семьях или популяций может способствовать выявлению генетических факторов заболевания. Панель Illumina в генотипирования BeadChips позволяет исследователям генотип тысячи или миллионы одиночных нуклеотидных полиморфизмов (SNP) или для анализа других геномных вариантов, таких как число копий, по всей большого числа образцов ДНК. Эти ОНП может распространяться по всему геному и не были направлены в конкретных регионах в целях обеспечения максимальной потенциальной открытие. Infinium анализа была оптимизирована, чтобы получить высококачественные, точные результаты быстро. С правильной настройке, один технический специалист может обрабатывать от нескольких сотен до более тысячи образцов ДНК в неделю, в зависимости от типа массива. Этот анализ помогает пользователям на каждом этапе, начиная с геномной ДНК и заканчивая сканирования массива. Использование приличия reageНТС, образцы усиливаются, разобщены, осаждают, ресуспендировали, гибридизации с чипа, продлен на единой базе, витражи, и просмотрел как на уже высокого разрешения системы оптических изображений ISCAN или Привет Scan. Один одночасье шаг необходим для усиления ДНК. ДНК денатурируют и изотермически усиливается целого генома усиления, поэтому нет ПЦР не требуется. Образцы гибридизуют с массивов во время второй стадии в течение ночи. На третий день, образцы готовы быть отсканированы и проанализированы. Усиленный ДНК может быть складированы в больших количествах, позволяя массивы шарик для обработки каждый день недели, тем самым максимизируя пропускную способность.

Введение

Ввод одиночных нуклеотидных полиморфизмов (SNP) является одним из ключевых метод идентификации варианты риска, связанные с болезнью. Исторически сложилось, что сфера генотипирования экспериментов было ограничено имеющейся технологии. Методы генотипирования Гель-электрофорез на основе ограничены в выборки и SNP-пропускной ^[1]. Развивая эти анализы часто может быть трудоемким, опираясь на макияж и структуры области, окружающей вариант для оптимизации ^[1]. TaqMan генотипирования анализы, разработанные Life Technologies, может работать большое количество образцов быстро и с минимальным участием техник [2], но ограничения SNP-мультиплексирования продолжают ограничивать общее количество генотипов хорошо под миллион в день ^{[3,4 ].} Платформа Sequenom в Iplex также может работать много образцов сразу, но, как менее сто ОНП могут быть мультиплексированы вместе, пропускная способность сравнительно низкий общий ^[5]. Технология SNP поток Beckman Coulter втеоретически могли бы производить более трех миллионов генотипов в день, но этот диапазон пределы технологических проект до максимума только сорок восемь SNPs на реакцию ^[4,6]. В то время как анализ GoldenGate может обрабатывать около двухсот образцов ДНК каждый день на сотни или тысячи ОНП на образец, цена за генотипа не конкурировать с передовыми, техники ультра-высокой пропускной при наборе более трех тысяч ОНП сразу ^{[4,7 ].} Для обработки нескольких миллионов генотипов в день, масштаб требуется для больших генома исследования ассоциации, массив-гибридизации стали наиболее экономически эффективным вариантом на рынке.

Линия Affymetrix в гибридизации массивов и линии Illumina в массивов Infinium основе позволяют потенциально сотни образцов должно быть набрано на сотни тысяч или миллионы ОНП параллельно ^[4,8]. Эти ОНП могут быть разбросаны по всему геному, локализуется в регионах интересов, таких как эксОмес, или настроить для предпочтений пользователя. Эти массивы имеют преимущество не только быть в состоянии точно генотипу один миллион SNPs на выборку сразу, но и измерить числа копий изменение, потенциально открытие хромосомные аномалии. Infinium выровненные массивы OMNI BeadChip настоящее время имеют возможность генотипа до почти пять миллионов маркеров на образец, в том числе полмиллиона пользовательского локусов, на до почти ста образцов каждый день.

Как большинство болезней имеют генетический компонент, эти крупные эксперименты могут иметь решающее значение в поиске генов, связанных с болезнью. Высокая пропускная генотипирование позволяет эффективно поколения генотипа в образце устанавливает достаточно большой, чтобы убедительно обнаружить генетическую связь при более низких незначительных частот аллелей. Целого генома генотипирования проекты могут быть использованы, чтобы найти области с статистически значимое случай-контроль частот аллелей или число копий различий ^[9,10,11]. По данным Национального человека GeФ.И.О. научно-исследовательский институт, геномные исследования ассоциаций привело к 1490 отдельных публикациях между 25 ноября 2008 и 25 января 2013, вытекающие из открытия 8283 ОНП с р-значение менее 1 х 10 ^-5 (см. http:// www.genome.gov/gwastudies/). Эти исследования, исследовал условия, начиная с высоты в рак яичек, выгоду от широкого подхода, предоставляемой всего генома анализа. В таких случаях, целые регионы интерес, возможно, избежал уведомление было объем ввода был слишком ограничительный характер. Таким образом, для крупномасштабной ассоциация анализирует, методика генотипирования генома является методом выбора.

Различные версии анализа Infinium существует, каждый из которых предназначен для использования с конкретными типами массивов. InfiniumUltra анализ, обсуждаются в глубине под, подходит для многих 12 - или 24-образцы чипов массива. Они часто генотипу более ста тысяч ОНП на образец ДНК и сосредоточиться на тargeted регионы, такие как на ExoME или пользовательских панелей. Другие версии анализов может потребоваться для других типов чипов, таких как массивы генотипирования целого генома. Однако, как все анализы Infinium имеют общую основу и в основном отличаются только именами реагентов, объемы реагентов, или точной процедуры окрашивания реагентов, методы совершенные на одной версии анализа часто можно повсеместно. Другие массивы, такие как метилирования массивов, может использовать почти-идентичный протокол, а также. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы только использовать версию анализа, необходимого для данного типа микросхем в использовании. Некоторые виды, такие как те, измерения уровня экспрессии гена, может потребоваться использование протокола nonInfinium.

Образцы должны быть обработаны в пакетном режиме. Например, при анализе InfiniumUltra, предгибридизацию реагентов трубы содержат достаточного объема для запуска 96 образцов, и трубы не может быть замораживать. Таким образом, образцы должны быть запущены в пакетах из 96 образцов одновременно. Образцы будут усиливаться на елейт день. После примерно 1 ч в слесарной, образцы должны быть нагреты в конвекционной печи в течение 20-24 часов. На следующий день, почти 4 часа будут потрачены фрагментацию, осаждая и ресуспендированием образцы, после чего образцы могут быть либо заморожены для дальнейшего использования или гибридизовались с чипом. Загрузка чипов занимает около 2 ч, после чего образцы будут гибридизовали в течение ночи в течение 16-24 часов. На третий день, окрашивание и расширение шаг занимает ~ 4 час. Еще час будет потрачено мытье, покрытие, сушка и фишки. Наконец, массивы сканируются, который может занимать от 15-60 мин / чипа, в зависимости от используемого типа.

Стандартные лабораторную безопасность и чистота соблюдать простые правила безопасности. Хотя усиление не на основе ПЦР, отдельные рабочие станции для предварительного и postamplification процедур необходимы для того, чтобы свести к минимуму вероятность загрязнения. Идентификационный номер каждого комплекта поставляемого реагента в использовании необходимо войти в систему отслеживания листа. ReageНТС необходимо разморозить непосредственно перед использованием и несколько раз перевернуть перед разливом. ДНК должно быть набрано должен быть высокого качества геномную ДНК (260/280 Отношение поглощение 1,6-2,0, 260/230 оптическую плотность отношение ниже 3,0), выдел ют стандартными методами и количественно с флуорометре. Деградация ДНК часто фактором, способствующим некачественных результатов анализа. Как правило, 200 нг ДНК требуется, хотя это количество может изменяться для некоторых типов чипов. Tecan жидкость обработки робот может автоматизировать многие действия протокола и свести к минимуму человеческий фактор как фактор.

протокол

День первый

1. Подготовка

1. Внесите 200 нг ДНК в глубокий-хорошо, 96-образец стекла. По крайней мере, 96 образцов (полные тарелки) должны быть покрыты, чтобы убедиться в отсутствии реагент не будет потрачено впустую. Этикетка тарелку с штрих-наклейке, поставляемой комплекта и центрифуги его.
2. Для того, чтобы нормализовать объемы, оставить образцы в ящике или вытяжной шкаф на ночь для выпаривания жидкости. Закройте планшет свободно с крышкой или бумажным полотенцем, чтобы не пустить пыль.

2. Усиление

ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ: образцы не должны подвергаться усиление, если 4 часа не будут доступны на следующий день за шаги, фрагментации, осадков, и ресуспендирование.

1. Снимите флажок компании поставляемые или пачку труб с надписью "Pre" от -20 ° C морозильник (одна трубка из MA1, MA2, и МСМ достаточно для каждого набора 96 образцов). Установите трубки МА2 и МСМ на скамейке таять. Включите правильно откалиброванпечь и установлен на 37 ° С
2. Использование таз реагента и 10 мкл, 8-канальную пипетку, обойтись 4 мкл ДНК ресуспендирующего буфера в каждую лунку увлажняет образцы. Не стоит отбрасывать наконечники между каждой колонке, если приняты меры, чтобы не коснуться жидкости.
3. С 8-канальной пипетки обойтись 20 мкл MA1 в каждую лунку пластины. Для каждого нового реагента, использовать новый бассейн реагентов. Закройте планшет с многоразовой прокладкой, пульс-центрифуге, и вихря течение 1 мин при 1600 оборотах в минуту на микропланшет шейкере.
4. 2,4) инкубируют при комнатной температуре в течение по крайней мере 30 мин.
5. Разлить 4 мкл 0,1 N NaOH в каждую лунку пластины. Закройте планшет с многоразовой прокладкой, пульс-центрифуге, и вихря течение 1 мин при 1600 оборотах в минуту.
6. Инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин.
7. Разлить 34 мкл МА2 в каждую лунку пластины.
8. Разлить 38 мкл МСМ в каждую лунку пластины. Закройте планшетмногоразовый печать, импульсно-центрифуга, и вихрь течение 1 мин при 1600 оборотах в минуту.
9. Место в духовке в течение 20-24 часов.

День второй

3. Фрагментация

1. Удалить FMS трубки от "Пост-1" -20 ° C коробка (одна трубка является достаточным для каждого набора из 96 образцов). Оттепель на скамейке или в водяной бане при комнатной температуре. После установки MIDI-пластины вставку в системе настольный микрообразца инкубации, включите тепла блока и установлен на 37 ° С
2. После того, как трубы оттаивают, удалить образец пластину с духовкой и пульс-центрифуге. Внесите 25 мкл ФМС в каждую лунку планшета ДНК. Установите крышку широтно-центрифуге и вихрь в 1600 оборотах в минуту в течение 1 мин.
3. Инкубируйте пластины в нагревательный блок течение 1 часа.

4. Осадки

1. Удалить PM1 трубку из "Пост-3" 4 ° C коробки или упаковки и нагревают до комнатной температуры (одна трубка является достаточным для каждого набора из 96 образцов). Удалить пластину от теплового блокак и импульсно-центрифуга.
2. Поместите 50 мкл PM1 в каждую лунку пластины. Установите крышку широтно-центрифуге и вихрь в 1600 оборотах в минуту в течение 1 мин.
3. Инкубируйте пластины в нагревательный блок течение 5 мин.
4. Удалить пластину от теплового блока, выключите его, и выбросить крышку пластины. Разлить 155 мкл 100% изопропанола в каждую лунку пластины. Плотно с новой крышкой и вручную пластину перевернули несколько раз перемешать.
5. Поместите пластину в 4 ° С в течение как минимум 30 мин. Включите охлаждаемой центрифуге и установлен на 4 ° С для охлаждения.
6. Баланс пластину и центрифуги при 4 ° С в течение 20 мин при 3000 х г.
7. Проверьте нижней части пластины без его инвертирования и подтвердить образцы осаждают в голубой таблетки. Если нет гранулы не видно, центрифуги снова. Получить бумажные полотенца.
8. Откажитесь крышку и быстро удалить жидкость опрокидыванием планшета и нажав на него с силой по крышке, покрытой бумажными полотенцами. После того, как пластинка яnverted, заботиться, чтобы не вернуться, пока любая жидкость остается. Неоднократно постучите по планшету против лабораторного стола, пока все жидкость не удаляется.
9. Установите пластину на стойке пробирки, перевернутой, чтобы высохнуть. Инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа.

5. Ресуспендирование

1. Удалить RA1 от "Post-2" -20 ° коробке C и оттепели в номере водяной бане температуры. Включите духовку и установить его на 48 ° C.
2. После оттаивания обойтись 23 мкл RA1 в каждую лунку для образца пластины. Не лейте всю бутылку RA1 в бассейн; сохранить 30 мл на потом. Если образцы будут гибридизованы на массивах в тот же день, поместите RA1 в C кулера 4 °. Если образцы будут работать на более поздний срок, маркировать бутылку и заморозить на RA1.
3. Термосвариваемого новую крышку на пластине. Пульс центрифуг тарелку и поместите его в духовке в течение 1 часа.
4. Снять пластину из духовки и вихря на 1800 оборотов в минуту в течение 1 мин.
   Образцы можно смело быть чполем на данном этапе на срок до одной недели. Плиты могут быть складированы и образцы могут быть реорганизованы, чтобы подготовиться к применению чипа шарик, если это необходимо. Если выполнением процедуры, оставьте пластины при комнатной температуре и включите тепла блока. В противном случае, хранить пластины при -20 ° С.

6. Гибридизация

ВНИМАНИЕ: Образцы не должны подвергаться гибридизации, если 5,5 часа не доступны на следующий день для окрашивания и мыть шаги.

1. Включите тепла блока и установить его на 95 ° С Включите духовку и установить его на 48 ° C.
2. Как только температура стабилизировалась, Инкубировать на нагревательный блок течение 20 мин.
3. В то время как пластина денатурации, снимите коробку бортовых чипов от 4 ° С и установить его на скамейке запасных. Возьмите бутылку xc4 (от комплекта комнатной температуры) и добавить 330 мл 100% этанола. Встряхните его и инкубировать при комнатной температуре в течение ночи. Подготовка формамид / EDTA смеси (95% формамид, 0,2%ЭДТА (0,5 М), 4,8% H ₂ O по объему) и заморозить в отдельных шагом 15 мл. Избыток формамид может быть складированы.
4. Снимите образец пластину от теплового блока. Инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин.
5. В то время как пластина охлаждения, подготовить HYB камеру. Одна камера будет необходимо для каждых четырех бортовых чипов обработанных.
   Поместите резиновый коврик на верхней части Hyb основания камеры, совместив толще отверстие в передней части основания. Символ штрих выгравированы на базе еще ​​должны быть видны (см. рисунок 2).
6. Использование 1000 мкл пипетки обойтись 400 мкл PB2 в каждой из восьми увлажняющих водоемов высеченных в базу. РВ2 можно найти в коробке или пачке "Пост-3". Поместите крышку Hyb камеры на базе и обхватить оба конца, закрыв два застежками на диагонально противоположных сторон в первую очередь.
7. Извлеките отдельные серебряные пачек бортовых чипов из своих коробок, но, для того, чтобы свести к минимуму экспо фишки "обязательно воздуха и света, пока не открыть их. Тщательно сканировать штрих-коды чипов и записывать порядок, в котором они будут загружены на отслеживания листа, наряду с идентификаторами коробки, из которых они пришли. Глубокое понимание, где каждый отдельный образец ДНК будут изготавливаться по бортовых чипов необходимо.
8. Извлеките отдельные серебряные пачек бортовых чипов из своих ящиков, но для того, чтобы свести к минимуму воздействие фишки "на воздухе и на свету, пока не открывать их. Тщательно сканировать штрих-коды чипов и записывать порядок, в котором они будут загружены на отслеживания листа, наряду с идентификаторами коробки, из которых они пришли. Глубокое понимание, где каждый отдельный образец ДНК будут изготавливаться по бортовых чипов необходимо.
9. Незадолго до 30 мин остыть завершена, открыть шарик серебра чип пакеты. Удалить фишки от своих прозрачных пластиковых втулок. Не касаясь шарики, положите каждый чип шарик на Hyb камеры вставки, ориентируя чипштрих-символом штрих травления в верхней поверхности режущей пластины.
10. Снимите и выбросьте крышку образец стекла. Возьмите 15 мкл образца из образца пластины и медленно обойтись на входе в массиве (см. Рисунок 3). Чрезвычайный необходимо позаботиться, чтобы поместить правильный образец на правильном чипе шарик в правильном положении, соответствующие порядок чип шарик записанного ранее. Многоканальную пипетку можно использовать для дозирования жидкости на микросхемах, но предусмотрительность должны быть приняты для аспирации только количество образцов, которые могут быть безопасно размещен на чипе борта, а число строк на тарелке не всегда совпадает с количеством строк на чипе.
11. После того, как каждый образец был сделан на его соответствующий массив, осмотрите чип для пузырьков или регионах не покрытых в жидкости. Если эти проблемы существуют, осторожно встряхнуть вставку. Если необходимо, больше жидкости может быть добавлен к массиву. Позаботьтесь, чтобы добавить правильный образец ДНК.
12. Откройте Hyb Палатуе место вставки над увлажнения водоемов. Штрих-код чипа должны быть размещены над штрих-кодом травления в Hyb основания камеры. Замените Hyb отсека и закройте все четыре застежками, закрыв застежками на диагонально противоположных сторон в первую очередь.
13. Выдержите HYB камеру в духовке в течение 16-24 часов. Будьте осторожны, не наклоняйте камер при их перемещении.
14. Если более чем одна пластина должна обрабатываться, вернитесь к шагу 6.2. Обработка более 24 чипов бисера в день не рекомендуется для того, чтобы как минимизировать вероятность человеческой ошибки при обращении большое количество расходных материалов или чипсы и свести к минимуму количество времени, необходимого для обработки чипов в будущих шагов, как уход должны быть приняты меры по ограничению их воздействия как можно больше воздуха. Одна бутылка xc4 достаточно для до 24 бортовых чипов.

День третий

7. Окрашивание Подготовка

1. Удалите HYB камеры из духовки и инкубировать при комнатной тэmperature в течение 25 мин. Если обработка более двух HYB камеры, шатаются их двойной удаление каждые 10 мин. Для того чтобы сохранить чипы от высыхания, пока не открывать HYB камер.
2. В то время как HYB камеры охлаждения, удалить трубки XC1, XC2, TEM, STM и ATM от "Post-1" -20 ° C окне и установите на скамейке растаять. Возьмите бутылку RA1 из коробки при -20 ° С "Пост-2" (или 4 ° С, если повторное использование реагента с предыдущего дня) и оттепели в водяной бане при комнатной температуре. Оттепель тюбик 95% формамида, а также. За 8 бортовых чипов обработанных, два тюбика каждого реагента, 10 мл RA1, 15 мл формамида и 150 мл xc3 (находится в комнатной температуре, компании-поставляется коробкой) будет требоваться.
3. Для каждого чипа обработанного, один стакан горка, одна пластиковая проточный скобки, две металлические застежки, и одна пластиковая прокладка будет необходимо. Для пластиковой прокладкой, использовать только четкое один; отделить и выбросить непрозрачную прокладку. Кроме того, два шарика блюда чип мыть иодин поддон для стружки шарик будет необходимо, наряду с одной жидкой сборки станции и одной пластиковой панели сборки.
4. Очистите стеклянные пластинки, распыляя на них этанола и вытирая их насухо.
5. Включите горячей водяной бане, который прилагается к проточной камеры стойку и установить его на 44 ° C. Аккуратно встряхните камеры стойку, чтобы выбить любые пузыри.
6. Когда Hyb камера остынет в течение 25 мин, заполнить стирки блюдо с PB1 (приблизительно 200 мл). PB1 можно найти в коробке температуры "Пост-4" номера.
7. Открытый одноэтапный HYB камеру. Снимите уплотнение крышки из чипа борта, взявшись за печать в одном углу и аккуратно пилинг диагонали (см. рисунок 4). После того, как печать удаляется, сразу поместить чип в коробке с фишками шарик и погрузите в PB1, не касаясь шариков. Повторяйте, пока лоток не заполнен бортовых чипов, стараясь не оставлять на ней чип сухой.
8. Аккуратно агитировать лоток для удаления пузырьков и оставить фишки погруженные в течение 1 мин.Заполните второй стирки блюдо с PB1. Перемешайте лоток снова.
9. Перемещение поднос бортовых чипов во второй стирки блюдо. Аккуратно агитировать и пусть замочить в течение 1 мин, затем агитировать снова.
10. В жидкой проточного сборки станции, разместить четыре черные пластиковые проточный скобки в канавках. Заполните станцию ​​с PB1, пока жидкость почти не достигнет высоты восьми монтажных кронштейнов (приблизительно 150 мл).
11. Удалить чип шарик из лотка и поместите его в сборном пункте на пластиковой проточной скобки. Чип штрих должен быть выровнен над символом штрих травления в сборном пункте. Повторите эти действия для остальных трех чипов, которые могут поместиться в сборном пункте.
12. Поместите прозрачную пластиковую прокладку в верхней части чипа борта. Внешние края спейсера должна окружать скобки в сборочной станции. Повторите эти действия для других чипов затопленных в PB1.
13. Поместите пластиковую планку сборки в сборном пункте, установив его в канавки. Аккуратно поместить на предметное стекло верхней части пластиковой прокладкой, нажав на задний конец ползуна против бар сборки и медленно понижая фронт в жидкость. Паз на верхней части ползуна обращены вниз, непосредственно над штриховым кодом чипа, оставляя промежуток между стружкой борта и ползуна в конце штрих-кода. Повторите эти действия для других чипов затопленных в PB1. Для полного проточного сборочную диаграмму, см. рисунок 5.
14. Проверьте наличие пузырьков между чипом и горкой. Если появляются пузырьки, аккуратно снимите слайд в конце штрих-кода и попробуйте еще раз. Постоянные пузырьки могут быть стерты с стекла с бумаги лабораторного полотенцем (Kimwipe).
15. Привязать две металлические застежки вокруг стекло, один к концу штрих и один к задней. Края застежками должен захватить пластик проточный скоба под чипа. Повторите эти действия для каждого чипа, погруженной в PB1.
16. Удалить заполненные проточный сборки и поместить горизонтально на бEnch. Будьте осторожны, не чаевые сборку вертикально, что позволяет жидкости под стекло, чтобы убежать. Если больше фишек ждут в лоток для стирки, они могут быть собраны под одной PB1. Если другие чипы ждут в их оригинальных HYB камер, отбросить всю жидкость в актовом станции и мыть посуду, и вернитесь к шагу 7.6.
17. После того как все шарик чипы в их проточных сборок, принимать пару хирургическими ножницами и вырезать оба конца распорки выключен, как можно ближе к стеклу, как это возможно.

8. Окрашивание и расширение

1. Убедитесь, что проточный камера стойки достигла 44 ° C в нескольких позициях с датчиком температуры. Если температура от более чем на половину градуса, регулировать температуру водяной бане.
2. Поставьте проточный сборку чип шарик на камерной стойки посредством перемещения сборку вниз и зацепив скобки на самом верху. На оборотной стороне чипа борта должны касаться камерный стойку. Гдевушка слайд должен быть обращен наружу, с пазом в верхней, чтобы сформировать резервуар реагента. Повторите эти действия для каждой сборки чипов шарик.
3. Использование 200 мкл пипетки внести 150 мкл RA1to проточные сборок на дозирования жидкости в стеклянной водохранилища. Инкубировать в течение 30 сек. Повторите 5x.
4. Использование 1000 мкл пипетки внести 450 мкл XC1to проточные сборок на дозирования жидкости в стеклянной водохранилища. Инкубировать в течение 10 мин.
5. Добавить 450 мкл xc2 к проточных сборок на дозирования жидкости в стеклянной водохранилища. Инкубировать в течение 10 мин.
6. Добавить 200 мкл ТЕА на проточных сборок на дозирования жидкости в стеклянной водохранилища. Инкубировать в течение 15 мин.
7. Добавить 450 мкл 95% формамид / ЭДТА смесь на проточных сборок на дозирования жидкости в стеклянной водохранилища. Выдержите в течение 1 мин. Повторите 1x.
8. Инкубируйте проточный сборок для 5 мин.
9. Установите нагревайте на водяной бане в до температуры лisted на трубках STM (или 37 ° С, если ни один не показан). Убедитесь, что каждый СТМ трубка имеет ту же температуру в списке.
10. Добавить 450 мкл xc3 к проточных сборок. Выдержите в течение 1 мин. Повторите 1x.
11. Когда температура горячей водяной бане достигла желаемой температуры, добавьте 250 μLSTM к проточных сборок на дозирования жидкости в стеклянной водохранилища. Инкубировать в течение 10 мин.
12. Добавить 450 мкл xc3 к проточных сборок на дозирования жидкости в стеклянной водохранилища. Выдержите в течение 1 мин. Повторите 1x.
13. Инкубируйте проточный сборок для 5 мин.
14. Добавить 250 мкл банкомат в проточных сборок на дозирования жидкости в стеклянной водохранилища. Инкубировать в течение 10 мин.
15. Добавить 450 мкл xc3 к проточных сборок на дозирования жидкости в стеклянной водохранилища. Выдержите в течение 1 мин. Повторите 1x.
16. Инкубируйте проточный сборок для 5 мин.
17. Добавить 250 мкл СТМ в проточныхСборки по дозирования жидкости в стеклянной резервуара. Инкубировать в течение 10 мин.
18. Add4 50 мкл XC3 к проточных сборок на дозирования жидкости в стеклянной водохранилища. Выдержите в течение 1 мин. Повторите 1x.
19. Инкубируйте проточный сборок для 5 мин.
20. Повторите шаги 8.14 до 8.19 1x.
21. Удалите проточный сборки из камеры стойку и выключите водяной бане.

9. Стиральная и запечатывания

1. Заполните окрашивание шарик чип мытья блюдо с PB1 (примерно 315 мл). Две вертикальные мытья посуды и один вертикальный лоток чип шарик будет необходимо, вместе с по меньшей мере одним вакуумным коллектором.
2. Разберите узел проточный, вставив тонкий металлический стержень между зажимами и скобки, а затем поворота. Отложите предметное стекло и снимите чип шарик. Сразу же место чип шарик в лоток вертикальной чип шарик и погрузите в PB1. Повторите эти действия для каждого проточного сборки, заботясь, чтобы столкнуться с EACч чип шарик в том же направлении и минимизации их воздействия воздуха.
3. Аккуратно агитировать лоток чип шарик для удаления пузырьков. Выдержите подводные шарик фишки в PB1 в течение 5 мин. Заполните вторую вертикальную мытья блюдо с xc4 подготовлен в предыдущий день. Перемешайте лоток чип шарик снова.
4. Перемещение лоток чип шарик для стирки блюдо, наполненный xc4. Аккуратно агитировать лоток для удаления пузырьков. Инкубировать в течение 5 мин и перемешивают еще раз.
5. В одном движении, выдвиньте лоток чип шарик от мытья блюдо и установить на стойке пробирки, так что бусы на каждом чипе шарик лицом вверх. С самоконтрящимися пинцетом, сдвиньте чип шарик из лотка и разместить на стойке пробирки. Повторите эти действия для каждого чипа борта.
6. Тщательно передачи пробирок фишек в вакуумном эксикаторе. Закройте и включите вакууме, что обеспечивает надлежащее уплотнение. Выдержите в течение 50-55 мин. При необходимости разогреть сканер во время инкубации.

10. Сканирование

1. Тур-н от вакуума и медленно вернуться давление до атмосферного. Убедитесь, что шарик чипы сухой. При необходимости протрите края и дно чипа с бумажным полотенцем, чтобы удалить жидкость и мусор.
2. Активация программного обеспечения сканирования и перейти шарик фишки сканирования лоток. Скачать декодирования файлов чипа (dmaps) путем активации Клиентского декодирования файла и ввода желаемых штрих-кодов чип шарик, наряду с их соответствующими идентификаторами коробки. Неотсканированные чипы шарик может безопасно храниться в сухом, темном месте на срок до 72 часов.
3. После того, как чипы правильно помещен в лоток и декодировать файлы признаны программного обеспечения, запустите сканирование.

Результаты

Правильно обработанные чип шарик должен отображать яркие и четкие красные и зеленые лазерные света интенсивности при сканировании. На рисунке 6, ISCAN программа сканирования отображает стандартную геномной образец ДНК гибриды с пользовательской панели массива SNP генотипирования. Меченые нуклеотидов, что в ходе расширения и окрашивания шагов были прикреплены светиться под огни двух лазеров. Поскольку эти нуклеотиды выборочно расширить олигонуклеотидной цепи шарик в гибридизуют с фрагментированной ДНК цепи, и как олигонуклеотидные цепи разработаны, чтобы прекратить на месте варианте, цвет и интенсивность результирующего сигнала может быть использован для определения аллелей, присутствующих на сайт SNP.

Образец листа пользователями, который соответствует образцы идентификаторы и клиническую информацию chipID и положения, а также целый конкретных SNP проявляется, получены непосредственно от компании, являются необходимыми для того, чтобы импортировать SCAnner выходные файлы в программное обеспечение для анализа GenomeStudio. Пример выборки листов можно найти на веб-сайте компании. После того как проект GenomeStudio построен, генотипы могут быть получены из полученных кластеров интенсивности автоматически сгенерированных программным обеспечением. Хотя существует несколько вариантов отображения, вид по умолчанию, Норма-R (нормированное значение интенсивности) против Норма-Theta (отношение аллельный интенсивность), зачастую является самым простым участок дифференцировать три различных кластеров. Большинство ОНП должен показать один, два или три кластера, в зависимости от незначительных частот аллелей.

Три кластеры представляют примеров, демонстрирующих АА, АВ, или BB аллели (см. рисунок 7). Эти кластеры могут быть назначены генотипы либо путем импорта стандартный шаблон позиции кластеризации непосредственно от компании, выбрав "Cluster все ОНП" от анализа панели инструментов программного обеспечения, или, перетаскивая цветные круги на участках интенсивности вручную изданиями т называет. Цвет образца на участке интенсивности (красный, фиолетовый или синий) указывает на вызов (AA, AB или BB, соответственно); черный указывает на отсутствие вызова. По прокрутки ОНП, перечисленных в панели Полный данных программного обеспечения, кластеризация для каждого SNP можно просмотреть или отозван. После того, как кластеры назначены удовлетворительные звонки, Full области данных программного обеспечения перечислены генотипов для каждого отдельного образца на каждом конкретном SNP. Опция выбора столбцов над столом можно переключаться форматы данных.

Данные могут быть экспортированы либо через панель инструментов анализа, либо непосредственно с полным столом данных для углубленного анализа.

Рисунок 1. Обзор - Infinium Протокол анализа.683/50683fig1highres.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 2. Полный Hyb палата база и мат, плюс крышка. ^[12] Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 3 Загрузка Beadchip -.. Внесите образца на впускных портов ^[12] Нажмите здесь, чтобы увеличить изображения.

Рисунок 4 Снятие Beadchip Coverseal -.. Возьмитесь за печать на углу и аккуратно чистить диагонали ^[12] Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 5. Полное собрание Beadchip Проточный - BeadChip отделена от предметное стекло с прокладкой и связан с застежками.> Нажмите сюда, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 6. Успешное BeadChip сканирования -) BeadChip сканируется и с красным и зеленым лазером; сканирование программа отображает оба одновременно. Разделы попутный интенсивности QC будут освещены зеленый на BeadChip дисплее слева. Разделы противном случае интенсивность QC будут освещены на дисплее красным цветом BeadChip. B) После завершения сканирования, программа будет накладывать красные и зеленые дисплеи. Увеличено в изображение показано на рисунке. Цвет и яркость каждого отдельного борта указывает аллель подарок. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Рисунок 7. SNP НОРМА-R против NORM-Theta кассетных профилей -) действует SNP с трех различных кластеров, представляющих AA, AB и BB генотипов, цветной красный, фиолетовый и синий б) SNP, требующий редактирования.. Средний кластер, который должен быть гомозиготным А.Б., остается не-называется. BB кластер ошибочно называют AB. C) низкого выполнения SNP. Нет генотипы не могут быть получены из этого интенсивности участке, так как не существует отдельных кластеров. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Обсуждение

Крупномасштабные генотипирования приложения были использованы, чтобы лучше понять генетический механизм, лежащий в основе многих заболеваний человека. Открытие любого значительного варианта путем анализа ассоциации генома может махнуть кандидатскую область для дальнейшего изучения. Кроме того, генотип данных является хорошим инструментом для контроля качества на секвенирования проектов.

Чтобы максимизировать пропускную, несколько образцы стекол может быть усилен и хранить в своих фрагментированных, ресуспендировали государств. Восемь пластины могут быть усилены в течение одного дня, сочетая первый 24 ч протокола для нескольких партий и обеспечение достаточно материала для ~ 2-8 дней чип-обработки. Если усиленные пластины находятся на складах заранее, и если новые образцы гибридизации с чипов сразу после сканирования начинается в предыдущем запуске, обработка может работать непрерывно без необходимости сделать паузу для дополнительной подготовки образца. Таким образом, хотя образцы займет три дня, чтобы пройти полноеанализ, данные могут быть получены в день. Assuming24 чипы производятся ежедневно, 5 дней рабочей недели позволяет более 1000 образцов ДНК, которые будут выполняться на шарик чип 12-образца. Если какой-либо этап или реагент не удалось, однако, несколько партий может оказаться под угрозой за плохую работу до того, как коррекция может быть применен. Ошибки могут бежать уведомления до массивы не будут отсканированы или проанализированы, поэтому если пропускная развернуто, сотни образцов в различных стадиях протокола, возможно, уже получили одинаковое неполноценное лечение при обнаружении. Как потеряли реактивы и данные не могут быть восстановлены, пользователь должен взвесить эти риски и необходимостью ускоренного процесса.

Программное обеспечение для анализа GenomeStudio является первый шанс по-настоящему оценить успех процесса генотипирования. Если Норма-R против Норма-тета интенсивности участков должным образом сгруппированы, средняя ставка по телефону (процентов от полной ОНП успешно ввели) образцов должны подходить 99%, при том, что это значение варьируется SLIghtly в зависимости от типа массива. Данные из любого образца со скоростью вызова ниже 85-90% не заслуживает доверия и должен быть уничтожен. Для целей контроля качества, результаты должны быть по сравнению с любыми ранее известных генотипов по мере возможности. Если такой данных не существует, умышленное дублирование образец является полезным инструментом при проверке пластины или массива размещения. Эти повторяющиеся пары должны быть размещены на отдельных чипов, тарелки, партий, или проектов, их генотипы проверены на поколения. Хотя конкретные QC ограничения варьируются в зависимости от предпочтений исследователя, общие ограничения SNP основаны на успех образец вызова, Харди-Вайнберга, или missingness между исследуемой и контрольной, в то время как общие ограничения выборки основаны на скорости соединения, Менделя несоответствий или перекрестных ссылок из Х-хромосомы гетерозиготности к клиническим гендерных данных ^[13].

Если возникает какая-либо проблема, Dashboard управления, найти в пакет анализа, может быть представленКомпания с целью определения причины. Эти элементы управления могут часто сузить этот вопрос наиболее вероятным шагом или неудачи реагента. Если какие-либо ОНП интересных найдены через генотипирования эксперимента Infinium, их интенсивность участки должны быть перепроверены в GenomeStudio за ошибки кластеризации до дальнейших исследований проводится.

Неудавшийся Infinium генотипирование эксперимент, скорее всего, в результате человеческой ошибки обработки или некачественного входного ДНК. Образец количественное должна быть точной и достоверной. Для достижения наилучших результатов, любые реагенты добавляются в любом образце или чип должен быть отпущены в объеме, установленном протокола. Пипетки должны быть правильно откалиброван. Реагенты не должны проходить по истечении и не должны замораживать После оттаивания, за исключением RA1 реагента. Чтобы свести к минимуму возможные окрашивания и расширения ошибки, формамид / ЭДТА смесь следует приготовить свежую каждый месяц. Все -20 ° C реагенты должны храниться только в ручной разморозки морозильных камер. Все лабораторное оборудование используется в стAining, расширения, и мыть части протокола следует тщательно промыть водой с мягким моющим средством сразу после употребления. Увлажняющий водохранилища в HYB камеры должны быть вымыты с помощью кисти пробирки с мягким моющим средством. Стеклянные слайды должны быть промывают 10% отбеливателя, в соответствии с инструкциями по их руководства пользователя, один раз в неделю.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumable or Equipment	Manufacturer	Part Number	Minimum Required for 96 Samples
0.8 ml Deep Well Plate	Thermo Scientific	AB-0765	1
Plate Mats	Thermo Scientific	AB-0674	2
Reagent Basin	Fisher Scientific	13-681-502	9
Heat-seal Sheets	Thermo Scientific	AB-0559	1
Flow-through Spacer	Fisher Scientific	NC9563984	6
Pipette tips - 200 μl	Rainin	GP-L200F	192
Pipette tips - 10 μl	Rainin	GP-L10F	16
Pipette tips - 1,000 μl	Rainin	GP-L1000F	16
DNA Suspension Buffer	Teknova	T0220	0.5 ml
0.1 N NaOH	Fisher Scientific	AC12419-0010	0.5 ml
Isopropanol (HPLC grade)	Fisher Scientific	A451	15 ml
Ethanol (200-proof)	Sigma-Aldrich	459836	330 ml
Formamide (100%)	Thomas Scientific	C001K38	15 ml
EDTA (0.5 M)	Amresco	E177	0.2 ml
10 μl 8-channel Pipette	Rainin	L8-10XLS	1
200 μl 8-channel Pipette	Rainin	L8-200XLS	2
1,000 μl Single-channel Pipette	Rainin	L-1000XLS	1
Microplate Shaker	VWR	13500-890	1
Refrigerated Microplate Centrifuge	VWR	BK369434	1
Hybridization Oven	Illumina	SE-901-1001	1
Hybex Microsample Incubator	SciGene	1057-30-0	1
Hybex MIDI Heat Block Insert	Illumina	BD-60-601	1
Heat Sealer	Thermo Scientific	AB-0384	1
Hyb Chamber w/ Insert and Mat	Illumina	BD-60-402	2
Surgical Scissors	Fisher Scientific	13-804-20	1
Flow Through Assembly Parts	Illumina	WG-10-202	8
Wash Rack and Dish	Illumina	BD-60-450	1
Genepaint Chamber Rack	Tecan	760-800	1
Temperature Probe	Illumina	A1-99-109	1
Staining Rack and Dish	Illumina	WG-10-207	1
Self-Closing Tweezers	Ted Pella, Inc	5374-NM	1
Vacuum Manifold	Ted Pella, Inc	2240	1
iScan or HiScan	Illumina	-	1