V3 Без пятен рабочий процесс для практического, удобного и надежного тотального контроля загрузки белка в Западном Blotting

Резюме

Рабочий процесс V3 является западной процедурой помарки с использованием без пятен гелей. Технология без пятен позволяет исследователям визуализировать качество разделения белка, проверить эффективность переноса и, самое главное, проверить изменение белка, представляющий интерес, используя общую количественную оценку белка в качестве надежного контроля нагрузки.

Аннотация

Западная помарка очень полезная и широко принятая техника лаборатории, но своя исполнение challenging. Рабочий процесс часто характеризуется как "черный ящик", потому что экспериментатор не знает, если он был успешно выполнен до последнего из нескольких шагов. Кроме того, качество западных данных пятно иногда оспаривается из-за отсутствия эффективных инструментов контроля качества на месте на протяжении всего западного процесса blotting. Здесь мы описываем западный рабочий процесс V3, который применяет технологию без пятен для решения основных проблем, связанных с традиционным западным протоколом помарки. Этот рабочий процесс позволяет исследователям: 1) запустить гель примерно за 20-30 мин; 2) визуализировать качество разделения образца в течение 5 минут после запуска геля; 3) для передачи белков в 3-10 мин; 4) для количественной проверки эффективности передачи; и, самое главное 5) для проверки изменений в уровне белка интереса с использованием общего контроля загрузки белка. Этот новый подход устраняет необходимость зачистки и reprobing пятно для домашнего хозяйства белков, таких как β-актин, β-тубулин, GAPDH и т.д. V3 пятно свободных рабочий процесс делает западный процесс пятно быстрее, прозрачный, более количественным и надежным.

Введение

Западная помарка очень полезная техника^9,однако, 2 главных возможности с западным blotting: долгий и трудоемкий процесс и качество данных. Традиционный протокол требует около 2 дней. Она включает в себя множество шагов, включая подготовку образца, литье геля, электрофорез белка и передачи, мембраны блокирования следуют инкубации антител, визуализации, и довольно часто зачистки, reprobing, и, наконец, анализ данных. На протяжении всего этого процесса не существует надежных и гибких инструментов для управления процессами. Таким образом, ошибки могут быть введены на каждом шагу, и эти ошибки имеют потенциал для создания артефактов данных; поэтому контроль загрузки необходим в западном blotting для того чтобы определить и исправить для ошибок. Контроль нагрузки обычно делается путем проверки уровня белка эталонного белка в каждом образце, чтобы увидеть, если он в равной степени представлены. Люди часто используют белки домашнего хозяйства, такие как β-актин, β-тубулин,GAPDH, как контроль нагрузки.

Качество данных западных помарк зависит от надежного контроля загрузки. Но есть две законные проблемы при использовании белков домашнего хозяйства для контроля нагрузки: 1) иммунодетная выработка белковых полос на основе антител часто насыщена, и поэтому нельзя различать различия в загрузке между^{образцами 30;} 2) уровень экспрессии белка домашнего хозяйства может варьироваться в образцах при определенных экспериментальных условиях, например, лечение siRNA, гибель клеток, дифференциация клеток и^{т.д. 11,28,3,6,10,21}. Из-за этих опасений научные журналы в настоящее время требуют, чтобы "для количественных сравнений использовались соответствующие реагенты, методы управления и визуализации с линейными диапазонами сигналов" (Руководство по природе). Аналогичным образом, редакторы из журнала клинических исследований просят более надежные элементы управления^{погрузкой 24}. По этим причинам, белок домашнего хозяйства должен быть проверен для того, чтобы быть использованы в качестве контроля нагрузки. Во-первых, нужно убедиться, что он измеряется в линейном динамическом диапазоне метода^{иммунодетекции 14,29}. Во-вторых, нужно убедиться, что он выражается^{последовательно во всех образцах 26,31,25,19,20}.

Альтернативным решением надежного контроля нагрузки является использование общего измерения белка с помарки. Некоторые исследователи запятнали пятна с общими пятнами белка, таких как Кумасси, Фламинго Розовый, Sypro Ruby, Amido Черный, Ponceau S, и пятно свободной технологии, для измерения общего сигнала белка в каждой полосе, как контроль^{погрузки 16,20,13,27,1,4,12}. Общий контроль загрузки белка позволяет избежать ловушек, связанных с белками домашнего хозяйства. Во-первых, это истинное отражение количества белка, загруженного для каждого образца. Во-вторых, общее пятно белка демонстрирует отличный линейный динамический диапазон в общем диапазоне нагрузки для западного анализа помарки (10-50 мкг белка сложной клетки лизата) и точно дифференцирует разницу в загрузке^{между образцами 12}.

Технология без пятен является новым методом полного окрашивания белка, где уникальное соединение смешивается в растворе акриламида геля и равномерно распределяется в литом геле. После завершения электрофорез, гель подвергается воздействию уф-излучения в течение как минимум 1 мин, так что пятно соединение реагирует с остатками триптофана в белке. Белки становятся возбудимыми под ультрафиолетовым светом, чтобы дать сильный флуоресцентный сигнал, который может быть визуализированы и количественно в пятно-бесплатно включен imager, таких как ChemiDoc MP системы. Однако само соединение, свободное от пятен, не поглощает ультрафиолетовый свет, что приводит к низкому фону изображения геля. Модификация остатков триптофана необратима, и белки можно визуализировать не только в геле, но и на помарке в любое время после передачи белка.

Технология без пятен применяется в V3 Western Workflow(рисунок 1) для решения основных жалоб на традиционный рабочий процесс, особенно проблемы с использованием белков домашнего хозяйства в качестве контроля загрузки. Используя этот рабочий процесс, можно было бы: 1) запустить гель примерно в 20-30 мин, 2) проверить целостность образца и качество разделения белка в 5 минут после запуска геля; 3) передавать белки в 3-10 мин; 4) проверить эффективность передачи количественно; и 5) самое главное, проверить изменения в уровне белка интереса с помощью общего контроля загрузки белка.

протокол

1. Белковый образец Prep

(Описана типичная процедура извлечения белков из клеточной культуры)

1. Поместите блюдо культуры клеток HeLa во льду и промыть клетки с ледяной Трис-буферной солевой (TBS; 20 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 150 мМм NaCl).
2. Аспирировать TBS, затем добавить 1 мл на 100 мм блюдо ледяной БУФЕР RIPA (50 мМ Трис-HCl рН 8,0, 150 мМм NaCl, 1% NP-40, 0,5% дезоксихолата натрия, 0,1% SDS) дополнены фосфатаза и протеазы.
3. Очистить адепт клеток от блюдо с помощью холодного пластикового скребка клеток; аккуратно перенесите подвесную клетку в предварительно облеарелую трубку микроцентрифуга.
4. Поддерживайте постоянную агитацию в течение 30 мин при 4 градусах цельсия на ротаторе.
5. Спин при 16000 х г в течение 20 мин в 4 градусов предварительно заколол центрифугу.
6. Аккуратно снимите трубку с центрифуги и поместите на лед. Перенесите супернатант в свежую трубку, накоутую на льду, и выбросьте гранулы.
7. Удалите небольшой объем (10-20 мкл) лисата для выполнения анализа белка. Определите концентрацию белка для каждого образца с помощью набора анализа RC DC.
8. При необходимости, aliquot образцы белка для длительного хранения при -20 градусов по Цельсию. Повторные циклы замораживания и оттепели вызывают деградацию белка и следует избегать.
9. Возьмите около 20 мкг каждого образца, добавить равный объем 2x Laemmli Образец буфера (4% SDS, 10% 2-меркаптоэтанол, 20% глицерол, 0,004% бромофено-голубой, 125 мМ Трис-HCl, рН 6,8).
10. Нагрейте каждую ячейку лизайт в буфере образца при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 5 минут.
11. Центрифуга при 16 000 х г в микроцентрифуге в течение 1 мин.

2. Гель Электрофорез с гелями без пятен (30 мин)

1. Возьмите критерий TGX Любой KD пятно свободной precast гель (миди формат гель), удалить гребень и ленту из нижней части кассеты.
2. Поместите кассету в ячейку Criterion и заполните интегрированную верхнюю буферную камеру с 60 мл бегущего буфера (25 мМ Трис, 190 мМ глицин, 0,1% SDS, рН 8,3). Промыть скважины с помощью бегущего буфера.
3. Заполните каждую половину нижнего буферного бака 400 мл бегущего буфера к отмеченной линии заполнения.
4. Загрузите образцы белка и соответствующие маркеры белка.
5. Поместите крышку на бак, выравнивая цветные банановые пробки с соответствующими домкратами на крышке.
6. Вы запустите гель в течение 30 мин при 200 V или 20 мин при 300 В.

3. Без пятна гель изображения с помощью Chemidoc MP системы для проверки качества разделения белка (5 мин)

1. Удалите гель кассету из клетки. Используйте гель кассеты открытия инструмента в крышке критерия ячейки, чтобы взломать кассету и выпустить гель.
2. Нанесите пару миллилитров воды в центр лотка УФ образца изображения ChemiDoc MP. Аккуратно поднимите гель из кассеты и поместите его на поднос.
3. Запуск программного обеспечения Image Lab и захват без пятен гель изображение(рисунок 1A) со следующими настройками:
   Применение: гель без пятен
   Время активации геля: 1 мин
   Область изображения: гель критерия
   Время экспозиции изображения: автоматически оптимизировано для наиболее интенсивных полос
4. Удалите гель из лотка образца и немедленно перейти к передаче шаг.

4. Передача белка с транс-Blot Turbo системы (10 мин)

1. Открыть Транс-Blot Turbo Midi PVDF Трансфер Pack; поместите нижний стек (который включает мембрану) на основание кассеты передачи.
2. Поместите гель поверх мембраны, поместите верхний стек на гель и раскатайте пузырьки.
3. Поместите крышку на кассетную основу и поверните циферблат, чтобы заблокировать его.
4. Вставьте кассету в залив blotter.
5. Начните передачу, выбрав предустановленную программу Turbo и выбрав размер геля Criterion (миди), а затем нажмите RUN. Типичный пробег занимает всего 7 минут.
6. Когда передача закончена, разобрать сэндвич и поместить как пятно и гель в контейнер с деионизированной водой.

5. Без пятен гель и пятно изображения с помощью Chemidoc MP системы для проверки эффективности передачи белка и качества (5 мин)

1. Поместите гель после передачи на поднос образца изображения ChemiDoc MP.
2. Запуск программного обеспечения Image Lab и захват без пятен изображения после передачигеля (рисунок 1B) со следующими настройками:
   Применение: гель без пятен
   Время активации геля: нет
   Область изображения: гель критерия
   Время экспозиции изображения: то же самое время экспозиции для изображения претрансферного геля
3. Удалите гель из лотка образца, а затем изображение пятно(рисунок 1C) со следующими настройками. Держите пятно мокрым с несколькими каплями воды или TBST при визуализации.
   Применение: пятно-бесплатно пятно
   Область изображения: гель критерия
   Время экспозиции изображения: автоматически оптимизировано для наиболее интенсивных полос
4. Удалите мембрану с помощью образца лотка и поместите его в контейнер с TBST (0,1% Tween 20 в TBS).

6. Инкубация антител

1. Блок, поместив пятно в растворе 3% бычьего альбумин сыворотки (BSA) в TBST при комнатной температуре в течение 1 часа.
2. Инкубировать пятно на ночь при 4 градусов по Цельсию в растворе, содержащем мыши первичных антител, поднятых против первой цели белка и кролика первичного антитела, поднятые против второй целевой белка.
3. Вылейте раствор, содержащий первичное антитело. Затем промойте помарку, агитив в 20 мл TBST в течение 5 минут. Повторите 4x в общей сложности 5 моет.
4. Инкубация в течение 1 часа при комнатной температуре во вторичном растворе антитела, содержащем спряженное антитело Dylight 650 Goat-anti-mouse и спряженное антитело Dylight 549 Goat-anti-rabbit.
5. Вылейте раствор, содержащий первичное антитело. Затем промойте помарку, агитив в 20 мл TBST в течение 5 минут. Повторите 4x в общей сложности 5 моет.

7. Анализ изображений и данных с помощью программного обеспечения Лаборатории изображений - Полная нормализация белка (5 мин)

1. Приобретите мультиплексное флуоресцентное изображение помарки(рисунок 1E),открыв новый многоканальный протокол, настройте три флуоресцентных канала и запустите протокол.
   Канал 1:
   Применение: пятно Dylight 650
   Область изображения: гель критерия
   Время экспозиции изображения: автоматически оптимизировано для наиболее интенсивных полос
   Канал 2:
   Применение: пятно Dylight 549
   Область изображения: гель критерия
   Время экспозиции изображения: автоматически оптимизировано для наиболее интенсивных полос
   Канал 3:
   Применение: пятно-бесплатно пятно
   Область изображения: время экспозиции изображения критерия геля: автоматически оптимизировано для наиболее интенсивных полос
2. Нажмите значок нормализации из окна инструмента анализа и нажмите Да, чтобы обнаружить полосы движения и полосы.
3. Выберите и используйте "Lanes and Bands tools", чтобы внести коррективы в полосы движения и полосы, если это необходимо.
4. Выберите изображение без пятен в качестве канала нормализации.
5. Выберите инструменты анализа MW и назначьте стандартные полосы движения MW, проверяя коробки под ними.
6. Чтобы просмотреть нормализованные объемы, нажмите таблицу анализа на бар инструментов. Все расчеты будут выполняться автоматически программным обеспечением, включая фактор нормализации и нормализованные объемы. Значения интенсивности целевой белковой полосы теперь корректируются с изменением нагрузки белка. Это позволит точно сравнивать целевые белки между образцами.

Результаты

1. Оценка целостности выборки, качества разделения белка и эффективности переноса с изображениями геля без пятен.

Белковый экстракт из клеток HeLa был отделен при 300 V в течение 20 минут на 18-ну Критерий AnyKD TGX без пятен гель. Образцы белка были загружены в 3 раза в четырех различных количествах (Lanes 1-3, 40 мкг; Переулки 4-6, 30 мкг; Переулки 7-9, 20 мкг; Переулки 10-12, 10 мкг). Гель активировался под ультрафиолетовым светом в течение 1 мин. На рисунке 2А показано изображение геля, полученное сразу после разделения белка. Целостность образца протеина(например, деградация) и качество разделения(например, белковые осадки) можно визуально оценить с помощью этого гель-изображения. Белки затем были переданы в течение 7 минут в мембрану нитроцеллюлозы с помощью Транс-Blot Turbo. На рисунке 2B показано без пятен изображение гельа после передачи. Оба изображения были приобретены с одинаковым временем экспозиции (6,8 сек). Для оценки эффективности передачи были отобраны переулки 3 и 12. Используя инструмент громкости в программном обеспечении Image Lab, прямоугольная коробка (синий) была накожена для покрытия полосы 3 и 12 на обоих изображениях геля. Расчет, основанный на значениях объема из этих коробок, показал, что эффективность передачи обеих полос составила 80%(рисунок 2C). В этом эксперименте гель AnyKD TGX был выбран для изучения малых и средних целевых белков и не был оптимизирован для передачи крупных белков. Оптимизация эффективности передачи потребует использования более низкого процентного геля(например, 4-20%) и/или корректировка времени передачи для облегчения передачи крупных белков. 2. Без пятна полный контроль загрузки белка является надежной альтернативой управления погрузкой домашнего хозяйства в западной blotting количественно небольшое изменение уровня белка интереса.

MCM-7 является фактором репликации лицензирования ДНК, уровень которого снижается на 20-50% в лимфобластоидных клеточных линиях (LCL) после облучения. В этом эксперименте, лизаты (30 мкг каждый) из четырех контроля и облучения обработанных лимфобластоидных клеток линии (LCL) культуры были разделены на 12-ну Критерий AnyKD TGX пятно-бесплатный гель. Гель активировался в течение 1 мин под ультрафиолетовым светом и передавался Trans-Blot Turbo в мембрану PVDF для иммуноблоттинга. Белок домашнего хозяйства GAPDH (зеленый) был исследован с антителом кролика (Технология сигнализации клетки, США, 1:2,500) и Dylight 549 спряженное антитело Коза-анти-кролик (Rockland, США, 1:20,000). Белок интереса MCM-7 (красный) был исследован с помощью антитела мыши (Abcam, США, 1:1,000) и Dylight 649 спряженных Коза-анти-мышь антитела (Rockland, 1:10,000).

На рисунке 3A показано мультиплексное флуоресцентное изображение общего количества белков (синий), MCM-7 (красный) и GAPDH (зеленый), обнаруженных в четырех контрольных и облучающих обработанных образцах LCL. Рисунок 3B является пятно-бесплатное изображение той же пятно, показывающее общий шаблон белка в каждом образце (30 мкг). Программное обеспечение лаборатории изображений выбрало образцы полос (голубые коробки) для измерения MCM-7, GAPDH и общего объема белка в каждой полосе. Уровни MCM-7 были нормализовывались либо против без пятен общего измерения белка или против GAPDH. Статистически проанализированы нормализованные уровни белка MCM-7, а на графике представлены средний объем белковойполосы MCM-7 и стандартное отклонение (n'4). Оба метода нормализации выявили небольшое снижение (около 25%) в уровнях белка MCM-7 после облучения лечения. Данные с общей нормализацией протеина exhibited более малое стандартное отклонение чем то с GAPDH как управление нагрузки.

Рисунок 1. V3 Западный рабочий процесс. Рабочий процесс V3 изображен в левой колонке в 4 шага. Основные инструменты и реагенты, используемые в рабочем процессе, отображаются на каждом этапе. Предполагаемое время для каждого шага также включено. Правая колонка показывает, что в рабочем процессе V3 может быть получено не менее 4 изображений. Описано использование каждой части данных. Без пятен изображения претрансферного геля, гель после передачи, и пятно (A, B, C) не может быть легко генерируется с традиционными западными методами blotting; Эти изображения и данные обеспечивают важную информацию и контрольно-пропускные пункты вдоль процедуры для улучшения контроля ученого и воспроизводимости западного помарки рабочего процесса. Целевые сигналы белка могут быть захвачены либо на хемилюминесцентные пятно изображения ( D ),еслиHRP-спряженных вторичных антител было применено в обнаружении или на флуоресцентные пятно изображения (E ),еслимультиплексирование флуоресцентные западные blotting было выполнено для обнаружения более чем одной цели белка одновременно на той же пятно. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.

Рисунок 2. Без пятен изображения претрансферных и послепередачных гелей в западном рабочем процессе V3 для оценки целостности выборки, качества разделения и эффективности передачи. (A)Претрансфер гель пятно-бесплатное изображение. (B)После передачи гель без пятен изображения. (C)Измерение эффективности передачи белка. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.

Рисунок 3. Сравнение полного измерения белка без пятен с иммунодетекцией GAPDH в качестве контроля нагрузки для нормализации уровня интереса к белку. (A)Флуоресцентные западные пятно изображения. (B)Пятно-бесплатно пятно изображения. (C)Нормализованный уровень белка MCM-7. Нажмите здесь, чтобы просмотреть изображение большего размера.

Обсуждение

Протокол V3 без пятен, описанный выше, для мультиплексирования флуоресцентных западных blotting. Он также может быть применен в западной blotting с помощью хемилюминесцентного обнаружения. В мультиплексном флуоресцентном западном протоколе помарки, без пятен помарки изображения приобретены в двух точках времени: 1) сразу после передачи белка; 2) на мультиплексном этапе флуоресцентной визуализации после инкубации антител. Первое пятно свободное изображение используется для расчета эффективности передачи, а второе пятно-бесплатное изображение используется в качестве управления загрузкой. Когда метод хемилюминесцентных применяется, это не возможно принять мультиплексное изображение для пятен свободных и целевых сигналов белка, потому что химилюминесцентный сигнал будет появляться в пятно-свободный канал тоже. В этом случае мы рекомендуем использовать без пятен изображение, принятое сразу после шага передачи белка для контроля загрузки и анализа нормализации.

V3 западный рабочий процесс обеспечивает следующие уникальные преимущества по сравнению с традиционным западным помаркой рабочий процесс, который использует белки домашнего хозяйства в качестве контроля нагрузки:

Во-первых, рабочий процесс V3 обеспечивает практический, удобный и более надежный контроль погрузки для проверки изменений уровня белка интереса. Протокол V3 использует полный контроль загрузки белка для нормализации уровня белка интереса, измеренного в каждом образце. Это позволяет избежать двух подводных камней использования белков домашнего хозяйства в качестве контроля нагрузки: насыщенный иммунодетекция и несовместимые уровни экспрессии белка домашнего хозяйства среди образцов при определенных экспериментальных условиях. Зачистка и reprobing шаги с антителами, направленными против домашнего хозяйства больше не нужны. Используя технологию без пятен, нет необходимости окрашивать и де-пятно пятно с пятнами, такими как Кумасси или Sypro Ruby для общего измерения белка. Это займет всего несколько секунд, чтобы приобрести пятно изображения и около 5 минут, чтобы сделать полную нормализацию белка с помощью программного обеспечения Image Lab.

Во-вторых, рабочий процесс V3 позволяет ученым лучше контролировать западную процедуру, поскольку делает процедуру более прозрачной и вводит несколько контрольно-пропускных пунктов для контроля качества. С помощью технологии без пятен исследователи могут визуализировать свои образцы белка как на геле, так и на помарке. Ученые могут оценить целостность образца белка (деградированные или нет), качество разделения (ускорили или нет), эффективность передачи и качество передачи (даже передачи или нет). Эти контрольно-пропускные пункты помогают исследованиям прекратить эксперимент, видя большие недостатки в процессе и не тратить время на плохие образцы и помарки. Эта технология также помогает ученым оценить, есть ли значительное количество потери белка после зачистки мембраны и подходит ли пятно для reprobing другой цели ⁴.

Вот несколько советов, чтобы обеспечить хороший опыт и качество данных с помощью V3 западного рабочего процесса.

1. Изображение геля сразу после запуска геля. Не замочите гель в любом буфере до первого изображения в процедуре, как это может смыть пятно соединения.
2. Используйте ту же область изображения для получения всех изображений в протоколе. Это позволит программному обеспечению наложить изображения для анализа данных, таких как полная нормализация белка.
3. Держите время экспозиции в соответствии при визуализации предпереведенных и послепереходных гелей. Это позволит программному обеспечению количественно измерить эффективность передачи.
4. Держите мембрану влажной с несколькими каплями воды или TBST при приобретении пятно изображения. Это позволит избежать возможных проблем грязного фона для обнаружения целевого белка.
5. Используйте низкофлуоресцентную мембрану PVDF для мультиплексирования флуоресцентных западных пятен.

Важно отметить, что молекула, свободная от пятен после УФ-активации, необратимо связана с остатками триптофана. Эта необратимая модификация потенциально может повлиять на распознавание антигенов при использовании моноклональных антител, если эпитоп содержит триптофан. Поликлональные антитела вряд ли будут затронуты, потому что они признают несколько эпитопов на антигене. Несыханные молекулы, свободные от пятен, легко смываются с геля и мембраны и поэтому не будут вмешиваться в взаимодействие антител и антигенов.

В заключение, западный рабочий процесс V3 делает западный процесс помарки более быстрым, прозрачным, количественным и более надежным. Исследователи теперь могут легко применить полный контроль загрузки белка в западном эксперименте пятно, чтобы сделать свои данные более надежными. Рабочий процесс V3 без пятен был принят рядом лабораторий, и их публикации показали, что журналы принимают данные без пятен в качестве контроля загрузки^{в западной помарке 22,17,7,8,5,23,18,15}.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
4-20% Criterion TGX Stain-Free Precast Gel	Bio-Rad	567-8093	Choose a gel size and percentage that meet the specific need in a experiment
Trans-Blot Turbo Midi PVDF Transfer Packs	Bio-Rad	170-4157	Choose either PVDF or nitrocellulose and match the membrane size to the gel size
Clarity Western ECL Substrate, 500 ml	Bio-Rad	170-5061
EQUIPMENT
Criterion Cell	Bio-Rad	165-6100
Trans-Blot Turbo Transfer Starter System	Bio-Rad	170-4155
ChemiDoc MP System	Bio-Rad	170-8280