Многофункциональный, Микропипетки основе метода для регистрации и стимуляции бактериального механочувствительных ионных каналов в капельной интерфейса Бислои

Резюме

Бактериальные механочувствительных каналы могут быть использованы в качестве mechanoelectrical преобразователей в молекулярно-биологических устройств. Воздушно-капельных интерфейс бислои (бабки), сотовые стиле строительные блоки в таких устройствах, представляют собой новые платформы для включения и стимулирования механочувствительных каналов. Здесь мы демонстрируем новый микропипетки на основе метода формирования DIBs, позволяя изучение механочувствительных каналов при механическом раздражении.

Аннотация

MSCL, А механочувствительных канал большой проводимости (MSC), является вездесущим осмолита выпускной клапан, который помогает бактерии выживают резких Hypo-осмотическое потрясений. Было обнаружено, и строго изучены с помощью метода патч-зажим в течение почти трех десятилетий. Свою основную роль перевода натяжение к клеточной мембране в ответ на проницаемость дает сильный кандидат для работы в качестве датчика mechanoelectrical в искусственных мембран на основе молекулярно-биологических устройств. Работа в качестве строительных блоков для таких устройств, интерфейс капель бислоев (бабки) может быть использован в качестве нового платформы для включения и стимулирования MSCL каналов. Здесь мы опишем метод микропипетки основе сформировать DIBs и измерения активности инкорпорированных каналов MSCL. Этот метод состоит из липидов, заключенная водных капель на якоре до кончиков двух противоположных (соосно) боросиликатного стекла микропипеток. При капли вводят в контакт, интерфейс липидный бислой являетсяформируется. Эта техника предлагает контролировать химического состава и размера каждой капли, а также размеры интерфейса двухслойной. Имея один из микропипеток прикрепленных к гармонической пьезоэлектрического привода обеспечивает возможность доставить желаемого колебательный стимул. Через анализ форм капель в процессе деформации, напряжение создается на границе могут быть оценены. Используя эту технику, сообщает первый активность MSCL каналов в системе DIB. Кроме того, MS каналов, деятельность других типов каналов могут быть изучены с помощью этого метода, доказывая, мульти-функциональность этой платформы. Метод, представленный здесь позволяет измерять свойства фундаментальной мембранных, обеспечивает больший контроль над формированием симметричных и асимметричных мембран, и альтернативный способ, чтобы стимулировать и изучить механочувствительных каналов.

Введение

В последнее десятилетие, сборка искусственных липидных бислоев была значительно расширенный за счет развития метода двухслойной интерфейса капли. Известный как стабильный и надежный, DIBs ввели себя в качестве альтернативных модельных систем в классической окрашены (Мюллер) и сложенными (Монтал-Мюллера) плоских двухслойных ^1. Хотя идея использования капель, чтобы создать бислоев восходит к 1960 ^2, он не приобрел популярность не до недавнего времени. Первый успешный попытка была сообщили в группе Takeushi ^3, а затем в ряде исследований, демонстрирующих формирование двухслойной используя сеть капель группой Бейли ^4-6. Совсем недавно, методы инкапсуляции были предложены группой Лео ^7-9, который впервые концепция использования DIBs в качестве строительных блоков новых стимулов проблематику материальных систем ^10. В предыдущих исследованиях, DIBs доказали свою способность реагировать на электрической ^9,11, химческих ^10,12, и оптический стимулы ^13. Различные биомолекулы с различными стимулами проблематику функциональных были эффективно стимулировали при восстановлении в DIB ^10,14. В свете этих успешных попыток важным вопрос, поднятых: может DIB Ответить на механический стимул, когда соответствующие биомолекулы включены? Межфазное силы, действующие на DIB отличаться от тех, в других двухслойной системы ^15,16. Таким образом, напряженность в бислой, проведенного капель можно контролировать путем регулирования напряжения на водно-липидный нефтяных интерфейсов; концепция не применяется с нарисованными или сложенными двухслойных системах.

MSCL каналы, широко известные как осмолита выпуска клапанов и основных элементов бактериальной цитоплазматической мембраны, реагируют с увеличением напряженности мембраны ^17,18. В случае гипо- осмотическое потрясений, несколько каналов, проживающих в мембране маленькой камере ^{19 может} генерировать масответ SIVE проницаемость быстро отпустите ионы и малые молекулы, экономя бактерий лизиса ^20. Биофизически, MSCL хорошо изучена и характеризуется, прежде всего, через технику зажим крупное патч ^21-23. Надежные структурные модели, объясняющие механизм стробирования ^24,25 MSCL являются предложил на основе кристаллической структуры своего гомолога в ^{26,27, 28,} моделирования и результатов широких экспериментов ^24,29-31. Под прикладной натяжения ~ 10 мН / м, закрытый канал, который состоит из жесткой связке трансмембранных спиралей, превращается в кольцо сильно наклоненными спиралями, образующих ~ 28 заполненной водой проводящий пору ^21,24,32. Кроме того, было установлено, что гидрофобность плотный ворот, расположенный на пересечении внутренней доменов TM1, определяет порог активации канала ^33. Соответственно, было обнаружено, что за счет уменьшения гидрофобности ворот, Tensioп порог может быть снижен ^22. Это свойство MSCL возможным проектирование различных управляемых клапанов ^34, в первую очередь для целей доставки лекарств. Для всех вышеупомянутых свойств и на основе своей фундаментальной роли перевод клеточной мембраны чрезмерных напряженности в электрофизиологических деятельности, MSCL делает отлично подходит в качестве mechanoelectrical преобразователя в бабки.

В этой статье мы представляем оригинальный микропипетки на основе метода для формирования DIBs и измерения активности инкорпорированных каналов MSCL при механическом раздражении. Мы сообщаем впервые, ответ бабки к механическим раздражением и функциональную восстановления в V23T низкопорогового мутанта MSCL в бабки ^35.

Экспериментальная система состоит из липидов, заключенная водных капель на якоре до кончиков двух противоположных боросиликатного стекла микропипеток. При капли вводят в контакт интерфейс липидный бислой является FOrmed. Эта техника предлагает контролировать химического состава и размера каждого капель (навалом), а также размеры интерфейса двухслойной. Кроме того, асимметричных мембран с различными липидными композициями в каждой створки может быть легко сформирован. Имея один из микропипеток прикрепленных к гармонической пьезоэлектрического привода, обеспечивает возможность применения запрограммированный одного цикла или колебательный стимул. Напряжение подается на искусственном мембраны через сжатие обеих капель, поддерживающих его. В результате капли деформации, области водно-липидный масла интерфейсов увеличения и одновременно угол между капель уменьшается, что приводит к увеличению мембранного напряжения и переходных активации MSCL. Через анализ форм капель в процессе деформации, напряжение создается на границе можно оценить. Даже если в центре внимания в этой статье на механо-трансдукции свойства DIB, мы также подчеркиваем, что другие типы биомолекулы, такие как аламетицина, могут быть активированы с помощью этой многофункциональной платформы. Мы представляем здесь, все технические аспекты подготовки, сборки и проведения измерений с этого нового метода в шаг за шагом образом.

протокол

1. Приготовление ПЭГ-ДМА гидрогелей

1. Выберите соответствующие измерительные / емкости для смешивания (колба, химический стакан, и т.д.). Для приложения. Очистите его тщательно с использованием моющего средства и воды, а затем протрите его безворсовой ткани стеклоочистителей.
2. Надевайте перчатки, чтобы избежать загрязнения посуду с маслами из пальцев. Промыть контейнер с достаточным количеством деионизированной воды, чтобы удалить остатки моющего средства.
3. Протрите контейнер с безворсовой ткани, чтобы избавиться от воды, затем спрей с изопропилового спирта (IPA, 99,5%) и протрите чистой, пока. Поместите его в вакуумную камеру, чтобы позволить всем МПА для полного испарения. Очистить остальную часть лабораторного оборудования, используемого в процессе формования гидрогеля с дистиллированной водой.
4. Чтобы приготовить 40% (вес / объем) ПЭГ-ДМА Гидрогель решение, взвесить 4 г поли (этилен-гликоль) диметакрилатной (ПЭГ-ДМА; ММ = 1000 г / моль) полимера с использованием лабораторного масштаба.
5. Поместите взвешенное PEG-DMA в колбу и тепла с использованием ультразвукового ванну на 45-55 ° С до твердого ПЭГ-ДМА имеет сжиженного. В процессе, закройте отверстие в колбе с Parafilm / вощеной бумагой, чтобы сохранить воду.
6. После того, как ПЭГ-ДМА имеет сжиженного добавить буферный раствор (500 мМ КСl, 10 мМ MOPS, рН 7,0) общий объем до ~ достигает 10 мл (достаточно для нескольких экспериментах в течение шести месяцев).
7. Добавить отвердитель в количестве 0,5% (вес / объем). В этом случае добавить 0,05 г отвердителя к смеси 10 мл. Поместите флягу обратно в ванну для обработки ультразвуком и позволяют компоненты растворяются в раствор (около 10 мин, 250 Вт).

Примечание: После того, как отвердитель был добавлен к раствору гидрогели будут лечить (затвердеть) при воздействии любого источника света в течение достаточного количества времени. Чтобы помочь бороться с этим, оберните флакон / контейнер с черной лентой и храните его в темном месте. Это решение может храниться в течение нескольких недель при комнатной температуре (22 ° C).

2. Подготовка LiposОмес

1. Подготовка 10 мл 2 мг / мл липида раствора путем добавления 10 мл буфера (500 мМ KCl, 10 мМ MOPS, рН 7,0) до 20 мг 1,2-diphytanoyl- SN глицеро-3-фосфохолин (DPhPC) Синтетическое липиды приобрести как лиофилизированного порошка. Убедитесь, что оба липидные пузырьки и буферный раствор тщательно перемешивают (смесь должна выглядеть однородной и туманно, когда все растворяется).
2. Замораживание (-20 ° С) и полностью разморозить новый липидной смеси в общей сложности шесть раз. Пусть смесь оттепели при комнатной температуре, ни разу в нагретой окружающей среде.
3. С использованием коммерчески доступного экструдера, прессовать липиды, заставляя всю липидную суспензию сначала через поликарбонатный мембранный фильтр 0,4 мкм, а затем шесть раз через 0,1 мкм мембранный фильтр. Этот процесс дает частицы диаметром 100 нм вблизи (равный размер пор фильтра).

Примечание: Другие липиды и липидные показатели могут быть получены с использованием этого меняТПК. Липосомы следует хранить при температуре 4 ° С в течение нескольких недель.

3. Выделение и MSCL Восстановление

1. Подряд из температуре агарозном пластины, содержащие 100 мкг / мл ампициллина, Е. палочка MJF465 клетки с плазмидой pB10b несущей ген V23T MSCL расширенный с 6-His меткой на 3'-конце (С-концевой). Разрешить пластины к культуре в течение ночи (12-16 ч) при 37 ° С в стационарном инкубаторе. Плазмида выбрано и сохраняется в клетках с 100 мкг / мл ампициллина в стандартной LB среде. На следующий день место 20 мл LB среде с 100 мкг / мл ампициллина в культивирования пузырька (колбу 50 мл или то, что доступно, чтобы держать культуру). Возьмем пластину, культивировали в течение ночи и выбрать колонию от пластины для передачи (инокуляции) на подготовленную 20 мл LB среды с стерильной прививки палки. Разрешить культура 20 мл расти в течение ночи (12-16 ч) при 37 ° С при 250 оборотах в минуту в качалке инкубаторе.
2. Слейте overn 20 млIGHT культура в 2-4 л LB среде. Не Ампициллин больше не требуется. Встряхнуть колбы в инкубаторе при встряхивании 250 оборотах в минуту при 37 ° С до тех пор, OD ₆₀₀ не достигнет 0,5. Добавить Изопропиловый бета-D-1-тиогалактопиранозида (IPTG) до конечной концентрации 0,6 мм, и пусть культура идут еще в течение часа (до ОД ₆₀₀ = 0,8-1,0).
3. Положите колбы на льду, чтобы охладить культур, а затем собирать бактерии путем центрифугирования. Используйте шесть 400 мл конические пробирки (или столько, сколько разрешено ротора используется) и центрифуги в течение 5-8 мин при 7,438 мкг, которая является достаточно для осаждения бактерий. Слейте супернатант и повторите процедуру, пока все клетки из СМИ не собирают. Количество требуемых спинов изменяется в зависимости от количества культуры, выращенного и ротором используется. Для 2 л культуры он нужен только для спином вниз клетки один раз. Перенос всех собранных клеток в единый центрифужную пробирку.
4. Ресуспендируют ячейки гранул в ~ 20 мл французской прессы буфера (100 мМ КПя и 5 мМ MgCl _2, рН 7,4). Подвеска должна быть плотной (как сливки или молоко). Непосредственно перед нажатием французском суспензию добавить ингибитор протеазы фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ) до конечной концентрации 2 мМ и смешать энергично.
5. Французский-пресс культура, в 35 мл французский давления клетки, при 10000 до 16000 фунтов на квадратный дюйм. Спин вниз подвеску, чтобы отделить Сплошная клетки в 7,438 мкг, 10 мин при 4 ° С.
6. Поместите супернатант в отдельную пробирку, и добавить к нему лизоцима и ДНКазы (0,2 мг / мл каждого). Пусть надосадочную падение на 10 мин при комнатной температуре.

ПРИМЕЧАНИЕ: ДНКазы является обязательным; он уменьшает вязкость для высокоскоростного центрифугирования. Лизоцим является критическим; переваривает остатки клеточной стенки и помогает увеличить выход мембранной экстракции сделано с мягким неденатурирующем моющего средства.

7. Распределить надосадочную смесь в двух Ультрацентрифуга труб и спина их в106,883-153,911 мкг (в зависимости от ротора) при 4 ° С в течение 40 мин. После центрифугирования супернатант декантируют, а осадок коричневато на дне (общая доля мембраны) могут быть заморожены в трубке для длительного хранения (- 80 ° С) или для немедленного очистки белков.
8. Подготовка 0,5-1 л Высокая имидазола буфера: 100 мм NaCl + 500 мМ имидазола, рН титрование до 7,2-7,4 концентрированной HCl. Следует отметить, что имидазола является хорошим буферного вещества сама по себе.
9. Готовят 0,5-1 л Низкая имидазола буфера: 100 мм NaCl, 15 мМ + имидазола, путем соответствующего разбавления выше 100 мМ NaCl буфера. Нет регулировки рН не требуется.
10. Возьмем 100-150 мл каждого буфера в отдельных бутылок, и добавляют 1% (вес / объем) B-октил глюкопиранозида (OG). Раствор перемешивают и фильтруют ее и через 0,22 мкм фильтр. Эти решения являются низким и высоким имидазола решения хроматографии.
11. Подготовьте экстракционном буфере, принять 50 мл недорогим имидазола буфере и добавить 3% (вес / объем)О. и фильтровать буфера.
12. Используйте мембранных гранул 0,5-2 г сырого веса для выделения белка. Добавить 5-7 мл экстракционного буфера, ресуспендируют осадок, и гомогенизации его в ручным приводом стекло-поршневой гомогенизатор 30 мл. С 5-10 мягкими ударами сделать однородной суспензии без комков. Будьте осторожны, напряжение сдвига, как известно, вызывают денатурации белка.
13. Спин вниз нерастворимых частиц (в середине диапазона центрифуг, с фиксированным углом ротора, 38,478-68,405 XG, при 4 ° С в течение 15 мин). Между тем, принимать 3 мл бусин Ni NTA (6 мл суспензии) и мыть их сразу с низким-имидазол буфера (без OG), встряхивая их в 15 мл завинчивающейся крышкой трубки. Пусть шарики оседают на дно (~ 5-7 мин) или спин их в 129-201 мкг в течение одной минуты при 4 ° С. После осадок образуется, осторожно декантируют супернатант вручную и повторить процедуру. Равновесие шарики с 2-3 мл 3% буфера для экстракции О.Г..
14. Смешайте гомогенизированной смеси (мембранный осадок и буфер для экстракции) от 3.12 с 3-3,5 мл бисером Ni NTA. Пусть падение Смешайте в завинчивающейся крышкой трубки в течение 60 мин (партия загрузкой). Спин шарики вниз на 201 мкг (30 сек), переливать супернатант стороны, и мыть шарики с 1% О.Г. низкой имидазола буфера один раз. Гранул бисером в 3.13 раз и ресуспендируют их в 20-30 мл свежего низкой имидазола буфера.
15. Возьмите с собой небольшую колонку (оборудованная с верхней адаптера потока) с бисером Ni NTA, и пусть шарики урегулировать путем открытия запорного крана, чтобы поток экстракта через (не позволяют шарики, чтобы высохнуть). Вымойте бисером с одной аликвоты 10 мл низким имидазола буферных (1%) О.Г. с запорным краном открытой.
16. Загрузите хроматографии машину с чистым с низким и высоким имидазола буферов около 25 мл каждая при скорости потока машины определяется (изменяется в зависимости от машины); это делается путем пропускания низкую-имидазол буфер через систему в первую очередь. Ноль оптический рекордер на OD ₂₆₀ (базовый). Обратите внимание, что буфер довольно сильно отличается от воды, так как низкосортные имидазола имеет Impurities, которые поглощают УФ. Вставьте адаптер потока в колонну и прикрепить ее к машине.
17. Промыть колонку снова с низким-имидазол буфера (при 1 мл / мин) до оптической плотности потока через приходит достигает базовой линии (это может занять 10-20 мл). Это устраняет несвязанных белков из колонки.
18. Применение линейного градиента имидазола от 20 до 500 мм, в течение 30 мин, при 1 мл / мин. Начните собирать 4 мл фракции, когда ОД ₆₀₀ показывает увеличение. Первые две фракции полны слабо связанных белков, в то время как MSCL-6His начинает элюирование при ~ 40% линейного градиента. Большинство белка появляется в фракций от 3 до 8.
    ПРИМЕЧАНИЕ: линейный рост ОД будет наблюдаться в связи с увеличением% имидазола.
19. Объединяют фракции 3-4, 5-6, 7-8 и вместе. При желании, концентрат фракции по отдельности. Концентрат фракций 6-10 раз, используя центробежные фильтры. После 20 мин при 804 спина мкг и при 4 ° С, тщательно ресуспендируют концентрированный белок,белок имеет тенденцию придерживаться фильтра.
20. Вывод 50 мкл аликвоты, смешать их с SDS буфера образца и проверить на чистоту белка с использованием СТР гель-электрофореза.
    Примечание: MSCL будут мигрировать в нечеткой полосы приблизительно 17 кДа до дна геля.
21. Используйте концентрированные фракции количественно белок, используя набор для анализа белка, после инструкцией изготовителя. Типичный выход из 0,8 г осадок мембран до 0,2 мг чистого белка в объединенных фракций.
22. Восстановить V23T MSCL в DPhPC липосом через диализа. В 10 мг / мл хлороформного раствора DPhPC и аликвоту 0,5 мл (т.е. 5 мг липида) в его на три располагаемых округлым дном (12 х 130 мм) стеклянных трубок. Сушат липидов под потоком азота и удалить остатки хлороформ в вакууме (4-6 ч).
23. Добавьте 15 20 мг порошкообразного OG в сухом липидов в каждую пробирку, растворить его в 2 мл буфера для диализа (100 мМ KCl, 5 мМ KPi, рН 7,2), вихревые, и М.И.ldly гомогенат. В OG-солюбилизированы липиды должны образовывать прозрачный раствор.
24. Добавить концентрированные растворы V23T MSCL в каждую пробирку для достижения 1: 100, 1: 300 и 1: 1000 белок-к-липидный соотношения и вихрь также. Вырезать и мыть три части (~ 12 см долго) на трубке для диализа (MWCO 8000, диаметр 7,5 мм, имеют три пары пронумерованных клипов готовых).
25. Поместите растворенные липидно-белковые смеси внутри трубки, тщательно закрыть концы с зажимами, и диализ против 2 л буфера (100 мМ KCl, 5 мМ KPi, pH 7,2) в течение 48 ч при 4 ° С с четырьмя изменениями буфер каждые 12 ч. После диализа протеобактерий липосомы готовы.

Примечание: Раствор липосом может быть дополнена 2 мМ NaN3 (азид натрия) и хранили при 4 ° С. Избегайте замораживания.

4. Производство нефти водохранилище

1. Дрель два противоположных отверстия (1.0 мм в диаметре) всю дорогу через стену диаметром 2 дюйма, 1,5 см длиной акриловая цилИндера в 1 см от дна (фиг.1А).
2. Просверлите два отверстия 4 мм концентрические в ранее пробуренных отверстий 1 мм. Глубины отверстия должны быть на 1 мм каждый (убедитесь, чтобы не просверлить всю дорогу). Эти отверстия, чтобы соответствовать резиновые прокладки.
3. Место и клей двух резиновые прокладки, имеющие внутренние диаметры 1 мм в больших отверстий для того, чтобы предотвратить утечку нефти из.
4. Клей обработанную цилиндр 10 см х 10 см тонкой акрилового листа с помощью любого многоцелевой эпоксидный (Рисунок 1).

В день эксперимента:

5. Подготовка электродов

1. Сокращение 7 см длины двух проводов 250 серебра мкм диаметра, а затем погрузить их советы в хлорной извести в течение двух часов, чтобы сформировать серебристо-хлорида (AgCl) покрытия. Серый цвет указывает, что покрытие AgCl была сформирована (рис 2E).
2. Использование стеклорез, разделить длиной 10 см, 1 / 0.58 / OD ID мм класса боросиликатного capilЛари в двух 5 см капилляров.
3. Использование 34 калибра иглы Microfil заполнить капилляры с гидрогеля ПЭГ-ДМА. Для предотвращения гашеной гидрогель от отеков из капилляра, держать 3 мм зазор на кончиках и убедитесь, что нет пузырьков воздуха в капилляры.
4. Вставьте электроды Ag / AgCl в гидрогель заполнено капилляров (рис 2E).
5. Лечение гидрогель ПЭГ-ДМА через свободно-радикальной фотополимеризации при воздействии ультрафиолетового света в течение 2 мин на 1 Вт с использованием УФ-точечной пушки.

6. Настройка эксперимента

ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент установки под клеткой Фарадея заземленной к заземления на усилителе патч.

1. Приложить один из микропипетки к прямой держатель микроэлектродов, который имеет охватываемый соединитель (рис 2E).
2. Подключите держатель микроэлектродного к headstage усилителя патч (рис 2А). Для подключения НЕАdstage на землю, припаять 18 калибра изолированной медной проволоки с соответствующим разъемом для headstage.
3. Установите headstage на 3-осевой механической микроманипулятора. Прикрепите монтажную пластину headstage (он должен быть куплен вместе с микроманипулятора или на заказ в механическом цехе) в микроманипулятора и затем подключите headstage к монтажной пластине, используя соответствующие винты.
4. Прикрепите второй микропипетку к линейным приводом через разъем лабораторного производства и затем смонтировать как на второй микроманипулятора (рис 2B). В микропипетки должны быть противоположными друг другу, выровнены и горизонтальность. Примечание: бренд и стиль манипуляторов не имеет значения.
5. В стеклянную пробирку, перемешивают 0,1 мл липосом DPhPC 0,01 мл раствора proteoliposome V23T MSCL.

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим, чтобы уменьшить соотношение белок-липидной к (~ 0,0002), что имеет решающее значение для формирования устойчивой липидной bilayeр.

6. Использование 34 калибра Microfil иглу, заполните кончики обоих микропипеток с proteoliposome раствора (рис 3а).
7. Поместите резервуар на вершине вертикального микроскопа, и кормить микропипетки через противоположных отверстий 1 мм (рис 2б). Примечание: любой микроскоп может быть использован до тех пор, по крайней капли может быть хорошо видно.
8. Заполните резервуар с поверхностью с гексадекан (99%). Гексадекана не нуждаются в дальнейшей очистки.
9. Для формирования сферических капелек на кончиках микропипетки, использовать третий 10 мкм диаметра боросиликатного стекла микропипетки, установленный на третьей микроманипулятором, чтобы распределить разбавленный V23T решение MSCL proteoliposome (~ 0,00052 мл) при кончиков микропипетки и образуют капли (рис 3).
10. Контроль размера капель (при уменьшении или увеличении объема) по желанию, и пусть они отдых в течение 10 мин для того, как слои, чтобы сформировать полностью (Figure 3).
11. Принесите капельки в контакт, формирование двухслойной будет происходить в течение от 1 до 2 мин.

7. Настройка программного обеспечения и оборудования

1. Подготовка программного обеспечения путем включения компьютеров, микроскопов, контроллер пьезоэлектрический генератор, Генераторы, усилитель патч, и низким уровнем шума системы сбора данных.
   ПРИМЕЧАНИЕ: любой усилитель патч может быть использован и следующие инструкции специально для одного мы использовали и который указан в материалах и перечень оборудования.
2. На передней панели усилителя патч, установить "режим" ручек VHOLD / IHOLD и V-зажим.
3. На передней панели установить "НЧ" Бесселя Фильтр для кГц и Output Gain 1 до 2.
4. Установите "Конфигурация" в целой клетки В = 1.
5. Убедитесь, что остальные ручки установлены на ноль или в нейтральном положении.
6. Пример все DIB измерения тока в 5 кГцс 1 кГц Бесселя фильтром сглаживания.
7. Запустите программу, дважды щелкнув по значку на рабочем столе.
8. Нажмите кнопку "Настройка> планшета", чтобы открыть диалоговое окно "дигитайзера", а затем нажмите кнопку "Изменить".
9. В диалоговом окне "Изменить дигитайзер" выберите "DIGIDATA 1440 Series" от "дигитайзер" список.
10. Нажмите кнопку Сканировать, чтобы обнаружить дигитайзер.
11. Нажмите "ОК", чтобы закрыть диалоговое окно "Изменить дигитайзера", а затем нажмите кнопку "ОК", чтобы закрыть диалоговое окно "дигитайзера".
12. Нажмите кнопку "Настройка> лабораторном столе".
13. На вкладке Входные сигналы лабораторном столе, выберите Analog В соответствии Digitizer каналов. Установите масштабный коэффициент 0,002.

8. Формирование липидного бислоя

1. Использование кабеля BNC, соедините выход AWaveform генератор с внешним ввода команд перед коммутацией (на задней панели системы сбора данных). Отправить рк-рк к-треугольной формы 10 Гц, 500 мВ до headstage.
2. Использование микроманипулятора, перемещать стеклянные микропипетки горизонтально, чтобы принести капельки в контакт, пока они слегка не трогать и ждать бислоя истончение происходит (как правило, около 1 до 2 мин) (рис 3C и 3D).

ПРИМЕЧАНИЕ: Прогрессирование процесса формирования двухслойной можно увидеть визуально через микроскоп и может контролироваться измерения тока (рис 4).

3. Настройка размера (~ двухслойной 250 мкм в диаметре), контролируя положение капли установлен на приводе, используя микроманипулятор. Примечание: размер бислой можно оценить визуально в микроскоп. Этот метод облегчает исследователю контролировать размер бислой, легкоперемещение капли, используя микроманипуляторами.

9. Динамический Возбуждение и MSCL Память

1. После того, как двухслойная сформировал и устойчива (т.е. бислоя не нарушая или проводящие), стимулируют капель, отправив синусоидальный сигнал с помощью генератора функции.
2. Чтобы стимулировать белок MSCL включены в бислой, отправить синусоидальной формы с амплитудой 175 мкм пик-пик, частота 0,2 Гц, и 50% рабочего цикла с пьезоэлектрическим сервоприводом контроллера. (Различные типы сигналов может быть отправлен с разными амплитудами, частотами, и рабочий цикл)

10. Обработка и интерпретация результатов

1. Сохранение текущих измерений, записанные с помощью системы сбора данных, в формате .ABF. Импорт данных (в формате .ABF) в Matlab, используя функцию "файл" abfload, а затем проанализировать и обработать данные. Файл "abfload" доступен для свободного онлайн.
2. Оценка тОн напряжение в бислой и поверхностной расширения капель, используя видео капле в течение полных циклов приведения в действие, которые записаны с использованием соответствующего камеру.
3. Технологические видео в Matlab, по обработке отдельных кадров с использованием методов обработки изображений, чтобы оценить площадь поверхности раздела вода / масло, а также угол между каплями. Примечание: с помощью 2D кадр взят из видео, обнаружить границу раздела вода-масло (т.е. краю капли), а затем оценить площадь поверхности при вращении.

Результаты

Цифры 1 и 2 отображения экспериментальную установку и оборудование, используемые для записи активности белка в процессе механической стимуляции двухслойной липидной мембраной,. Чтобы свести к минимуму электрический шум в наших измерениях, рабочая станция находится в пределах лабораторного производства клетки Фарадея, заземлен заземления на Axopatch 200 B усилителя.

Формирование стабильного изоляционного липидного бислоя является ключевым шагом в данном исследовании. В этом варианте липид монослой собирает на границе раздела масло / вода из водных капелек, погруженных в ванну с органическим растворителем. Когда капли размещены в контакте, избыток масла удаляют, и противостоящие монослоев липидные тонко двух молекул толщиной липидного бислоя. Наиболее общая методика используется в двухслойной характеристика напряжения зажим. С фиксации потенциала, напряжение поперек мембраны поддерживается на постоянном уровне, а ток измеряется. Фиг.4 изображает типичную в режиме реального времени текущую запись начального образования двухслойной. Зная удельную емкость (~ 0,6 мкФ / ^{см2) 5 из} липидный бислой DPhPC, площадь образованного бислой можно рассчитать. Область бислой можно контролировать, изменяя положение капель (фиг.4А). Использование пьезоэлектрический исполнительный различные типы сигналов (синусоидальные, квадратные, треугольные и т.д.). На разных частотах, амплитуд и циклов могут быть применены к капелькам по горизонтали и аксиально колебания их и таким образом, бислой напряжение и область может быть изменена (4В).

Когда DIB механически стимулируется, в то время как поддержание постоянной потенциал постоянного тока через мембрану, с низким порогом (получить-из-функции) V23T мутант MSCL генерирует надежные деятельности, включая, главным образом, к югу от проводящих состояний, а иногда и полное события открытия (Рисунок 5) , Эти EVЭнты идентичны тем, которые записаны с использованием метода патч-зажим с интактными внутренних E.coli, мембран и липосом восстанавливают очищенной V23T MSCL. Результаты на рисунке 5 доказать, что стробирования происходит в ответ на увеличение напряжения, так как все пики тока наблюдаются при пиковой сжатия. В пик сжатия, относительное расширение поверхностная капель максимальна и, следовательно, напряжение на границе максимальна.

Аламетицина, напряжение-ионный канал и один из наиболее изученных пептидов, увеличивает проницаемость мембран, когда напряжение постоянного тока прикладывается через мембрану ^36. Способность интерфейса липидной двухслойной для размещения трансмембранных белков и пептидов, также проходят проверку выполнения текущих записи вольт-стробирования с помощью аламетицина пептида. Аламетицина смешивают с фосфолипидной раствора до конечной концентрации 100 нг / мл. Рисунок 6 показывает текущие измерения в зажим напряжения (+115 мВ). Капли в этом эксперименте растаскивают, чтобы достичь небольшого интерфейс двухслойную и, таким образом, более высокую устойчивость и меньшую емкость. Поведение стробирования пептида аламетицина показано через дискретные шаги текущего (рис 6). Гистограмма на правой стороне участка показаны изменения проводимости от базового уровня (0.0962 NS), которая в основном первый уровень проводимость самого канала.

Рисунок 1:. Схематическое описание основных частей и размеры резервуара нефти Масляный резервуар изготовлен в механическом цехе Вирджинии. Он состоит из цилиндрического обработанной акриловой трубки приклеены к поверхности акрилового листа. Размеры и дизайн могут быть изменены, чтобы приспособить различные приложения или более двух микропипетки./53362/53362fig1large.jpg "Целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2:. Экспериментальная установка и микропипетки подготовка (А) Стандарт станция для формирования, механически стимулируя и характеризующие интерфейса бислои включает в себя микроскоп, 3-оси манипуляторов, цифровую камеру, пьезоэлектрический генератор, стол виброизоляции, и клетку Фарадея (не показано). (Б) Экспериментальная установка состоит из двух противоположных ПЭГ-ДМА гидрогелевых заполнено микропипетки горизонтально в ванне гексадекан масла. Каждый из микропипетки содержит электрод Ag / AgCl, чтобы обеспечить электрическое соединение. Третий микропипетки заполнены раствором proteoliposome используется для формирования капель на кончике других микропипетки. (С) В настоящее время отклика DIB может быть измеренаиспользуя комбинацию усилителя патч и низким уровнем шума системы сбора данных. (D) закрыл картину, показывающую водных капелек, образованных на кончике микропипетки. (Е) Ag / AgCl электроды изготовлены путем погружения кончик двух серебряных проводов 250 мкм отбеливателя. Электроды затем подается через два боросиликатного стекла капилляров, заполненных ПЭГ-ДМА гидрогеля, который отверждается ультрафиолетовым светом, чтобы затвердеть. Прямой держатель микроэлектрод с мужской разъем используется для подключения одной из микропипеток в headstage усилителя патч.

Рисунок 3:. Изображения, иллюстрирующие формирование интерфейса бислоев капель (A) 10 мкм микропипетки заполнены протеолипосом расположен под микроскопом в непосредственной близости от кончиков микропипетки. С помощью шприца, соединенный с микропипетки, обойтись небольшие объемыиз протеолипосом с образованием сферических капелек требуемого объема. Пусть форма монослоя, позволяя капли, чтобы сидеть на десять минут. Принесите капельки в контакт; бислой образует ведь масло на границе исключается. (Б) В то время как бислой формируется химический состав на обеих сторонах интерфейса можно контролировать путем введения нужных химических веществ с помощью микро-размера микропипетки. (С) Капли в момент первого контакта. (D), когда капли липидный бислой формируется.

Рисунок 4: в режиме реального времени измерения показывают, как первоначальный истончение и последующее расширение интерфейса (A) ток, измеренный в процессе формирования двухслойной путем применения треугольной электрического потенциала.. Величина измеряемого тока прямо пропорциональна Capaciстояние, и, следовательно, площадь поверхности раздела двухслойной. Чем ближе капельки собрал, тем больше площадь интерфейса и наоборот. (В) При применении механического возбуждения, площадь интерфейса увеличивается и уменьшается двухслойных на той же частоте, что и сигнал стимулирующего.

Рис. 5: Измерения в реальном времени показывает отклик бислой к механическим возбуждением, а также стробирования в V23T мутанта MSCL Форма отклик тока синусоидальной, который относится к синусоидальной изменения в двухслойной емкости в результате изменение двухслойная площадь. Текущие шипы, происходящие на пике каждого цикла, указывают суб-проводимости стробирования в V23T мутанта. Полярный сюжет далее указывает, что строб происходит на пике сжатия, которая отражает рост напряженности на границе двухслойной.

Рисунок 6:. Текущие измерения под зажим напряжения и соответствующей гистограммы уровней проводимости для стробирования деятельности объединенных каналов аламетицина Поведение стробирования пептида аламетицина проявляется через дискретного пошагового увеличения тока. Уровни проводимости соответствует очень хорошо с предыдущих измерений, выполненных нашей исследовательской группы в Вирджинии ^7.

Обсуждение

Mechanosensation означает один из первых сенсорных трансдукции, которые развились в живых организмах. Использование этого явления для изучения и понимания механико-электрические свойства DIB, является важным шагом в направлении функциональных стимулов проблематику материалов. Это предполагает включение и активацию механочувствительных канала, MSCL, в DIB в mechanoelectrical преобразователя и датчика деформации для обнаружения усилить напряженность в интерфейсе липидного бислоя. С другой стороны, функция MS каналов может регулироваться с помощью основных свойств материала липидных бислоев в том числе толщины, внутренней кривизны, и сжимаемости. В свете вышесказанного, методика микропипетки основе представляет собой ценный инструмент, позволяющий исследователю возможность изучать MS каналов в бабки и дает представление о структуре липидный бислой, а также липидно-белковые взаимодействия.

За последние три десятилетияс, патч-зажим был основным методом изучения MS каналов, так как она позволяет зажим напряжения и напряженности. Тем не менее, патч-зажим требует громоздкого оборудования и не подходит для миниатюризации, в собственности, необходимой для проектирования сенсорных и устройств преобразования. DIBs из-за своей простоте, стабильности и компактности представляют собой подходящую среду для изучения активности MSCL. Здесь мы расширим предыдущий прогресс в методах формирования DIB, предложив метод микропипетки основе, с возможностью регулировать размер капель и интерфейс двухслойной, химический состав каждой капли, и напряжение на границе через динамический стимуляции. Техника состоит из крепления водные капельки, содержащие Протеолипосомы, до кончиков соосно противоположные стеклянные капилляры. Капли помещают в ванну с органическим растворителем и при контакте липидный бислой формы на границе раздела.

В микропипетки прикреплены к рiezoelectric генераторы, позволяющие горизонтальное смещение капель. Динамически сжатия капель, приводит к увеличению поверхностного натяжения на границе раздела вода масла и, следовательно, к увеличению двухслойной напряжения. Две основные аспекты этого метода дифференцировать от аналогичных и недавно опубликовал контакт пузырь двухслойная (НБР) техники ^37. Используя методику, представленную в данном описании, размер бислой управляется с помощью микроманипуляторами и, таким образом объемы капель остается постоянным, в отличие от метода CBB. Кроме того, методика НБР призывает насосов высокого давления, которые не нужны в методе, представленном в этой статье, что делает его проще и легче построить.

Мы можем включить и стимулировать бактериальную MSCL впервые без использования патча пипетки или химических модификаций ^38. Поскольку система способствует образованию надежных асимметричных мембран липидный бислой, что более точно имитирует лIPID асимметрия нашли в биологических мембранах. Это позволяет нам изучать последствия контролируемым составом мембраны или асимметрии о деятельности MSCL. Кроме того, с помощью методов обработки изображений, этот метод позволяет оценить напряженность на границе двухслойной. Эта техника помогает в понимании принципов взаимного между объемной и поверхностной силы в DIB, облегчает измерения основных свойств мембраны, и улучшает понимание MSCL ответ на мембраны напряжение.

Хотя этот метод ведет нас на шаг ближе в сторону биомолекулярной стимулов проблематику материальной системы и в различного физиологического среды для изучения MSCL, существуют ограничения в системе. Напряжение в этой системе не могут быть зажаты в связи с наличием липидного резервуара в форме липосом в каждой капли, который имеет тенденцию уменьшить напряжение на границе раздела масло / вода. Таким образом, в настоящее время механочувствительных каналов может быть стимулированов бабки только в динамическом режиме. Наличие пузырьков воздуха в системе существенно влияет на точность и воспроизводимость экспериментов. Пузырьки воздуха, присутствующие в гидрогелей может привести потери, если электрическое соединение.

В то время как мы описали использование микро-пипетки на основе метода для стимуляции MSCL, технология может быть использована для изучения других типов MS каналов и имеет потенциал, который будет использоваться для изучения исследователей различные биомолекул. Например, аналогичные установки была использована в нашей лаборатории для изучения mechanoelectrical отклика канала свободной поверхности раздела капли двухслойной мембраны. Различные белки могут быть восстановлены и активировать с помощью этой весьма контролируемой установки, принимая во внимание, что воссоздание среды каждого биомолекулы изменяются. Метод, описанный в этой статье затрагивает значительно более широком потенциале приложений, который ограничивается только воображением исследователя.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm filter	Corning	430624
1,2-diphytanoy-sn-glycero-3-phosphocholine (DPhPC)	Avanti Polar Lipids	850356P	Purchased as lyophilized powder
34-gauge microfil	World Precision Instruments	MF24G-5
400 mL Centrifuge bottels	ThermoFisher	3141	Nalgene
Agilent Function/Arbitrary Waveform Generator, 20 MHz	Keysight Technologies	33220A
Ampicillian	ThermoFisher	BP1760	ACS Grade
Avanti® Mini-Extruder	Avanti Polar Lipids	610000
Axio Scope.A1	Carl Zeiss	-
AxioCam HSm	Carl Zeiss	-
Axopatch 200B Amplifier	Molecular Devices	-
BCA protein assay kit	Pierce	23225
BK Precision 4017B 10 MHz DDs Sweep/Function Generator	Digi-Key	BK4017B-ND
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	1B100F-4
Dialysis tubing	7 Spectra/Por	132113	MWCO 8000, 7.5 mm diameter
DigiData 1440A system	Molecular Devices	-
DNAse	Sigma-Aldrich	DN25
DPhPC	Avanti	850356C
E-625 PZT Servo-Controller	Physik Instrumente	E-526
FPLC System	Pharmacia Biotech	-
HCl	J.T. Baker	9535-33
Hexadecane, 99%	Sigma-Aldrich	544-76-3
Homoginizer	Wheaton	357426	15 mL
Imidazole	Sigma-Aldrich	I5513
IPTG	Affymetrix	17886
IRGACURE® 2959	IRGACURE®	555047962
Isopore Membrane Filters	EMD Millipore	VCTP02500
Isopropyl Alcohol	VWR International	BDH1133-4LP
KCl	Sigma-Aldrich	P3911	ACS Grade
KH2PO4	Mallinckrodt	7100	ACS Grade
Kimble-Chase	Kontes	420401-1515	Flex-Column
LED-100 UV Spot Curing System	Electro-Lite, corp.	81170
Lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876
Manual Patch-Clamp Micromanipulators	Thorlabs	PCS-520N
MgCl2	ThermoFisher	M33	ACS Grade
Microelectrode Holder	World Precision Instruments	MEH1S
Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-1000
MOPS, minimum 99.5% titration	Sigma-Aldrich	M1254-100G
N2 Gas	Airgas	UN1066
NaCl	EMD	SX0420-1	ACS Grade
Ni NTA agarose beads	Qiagen	1000632
Optically Clear Cast Acrylic Tube, 2-1/2" OD x 2" ID	McMaster-Carr	8486K545
P-601 PiezoMove Flexure-Guided Linear Actuator	Physik Instrumente	P-601
PAGE gel	Bio-Rad	456-9033
Parafilm M® All-Purpose Laboratory Film	Parafilm®	PM999
Phenylmethylsulfonyl fluoride	Sigma-Aldrich	P7626
Poly(ethylene glycol)1000 dimethacrylate	Polysciences, Inc.	15178-100
Polycarbonate (PCTE) Membrane Filters, Black, 0.4 Micron, 25mm, 100/Pk	Sterlitech Corporation	PCTB0425100
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P5405-500G
Powder Free Soft Nitrile Examination Gloves	VWR International	CA89-38-272
Replacement Gasket 1.0mm	World Precision Instruments	GO1-100
SDS	Sigma-Aldrich	L5750
Silver wire	GoodFellow	147-346-94	Different diameters could be used depending on the application
Sodium Azide	Affymetrix	21610
Test tubes	ThermoFisher	14-961-27	12 x 130 mm
Tryptone	ThermoFisher	BP1421
Ultracal 30K	Millipore	UFC803024	Amicore Ultra 30 MWCO
VWR Light-Duty Tissue Wipers	VWR International	82003-820
VWR Scientific 50D Ultrasonic Cleaner	VWR International	13089
Water Purifier	Barnstead	D11931
Yeast	ThermoFisher	BP1422
β-octylglucopyranoside	Anatrace	O311S