JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает оптигетную стратегию модуляции активности митоген-активированной протеинкиназы (MAPK) во время клеточной дифференцировки и эмбрионального развития Xenopus . Этот метод позволяет обратимую активацию сигнального пути MAPK в культуре клеток млекопитающих и в многоклеточных живых организмах, таких как эмбрионы Xenopus , с высоким пространственным и временным разрешением.

Аннотация

Киназная активность имеет решающее значение для множества клеточных функций, включая пролиферацию клеток, дифференцировку, миграцию и апоптоз. Во время раннего эмбрионального развития киназная активность очень динамична и широко распространена у эмбрионов. Фармакологические и генетические подходы обычно используются для исследования киназной активности. К сожалению, с помощью этих стратегий сложно достичь превосходного пространственного и временного разрешения. Кроме того, невозможно контролировать активность киназы обратимым образом в живых клетках и многоклеточных организмах. Такое ограничение остается узким местом для достижения количественного понимания активности киназы во время развития и дифференциации. В этой работе представлена ​​оптогенетическая стратегия, в которой используется бицистронная система, содержащая фотоактивируемые белки Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) и N-концевой домен взаимодействующей с криптохром базовой спиральной спиральной спирали (CIBN). Реверси(MAPK) сигнальный путь достигается через посредство световой опосредованной транслокации белка в живых клетках. Такой подход может быть применен к культурам клеток млекопитающих и эмбрионам живых позвоночных. Эта бицистронная система может быть обобщена для контроля активности других киназ с аналогичными механизмами активации и может быть применена к другим модельным системам.

Введение

Факторы роста участвуют в широком спектре клеточных функций, включая пролиферацию, дифференцировку, миграцию и апоптоз, играют ключевую роль во многих биологических событиях, включая эмбриональное развитие, старение и регуляцию психического статуса 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Многие факторы роста сигнализируют через сложные внутриклеточные сигнальные каскады. Эти сигнальные события часто управляются обратимым фосфорилированием белка точно регулируемым способом 6 , 7 . Таким образом, понимание сигнальных исходов протеинкиназ, ответственных за фосфорилирование белка, принципиально важно.

Различные факторы роста действуют через довольно распространенную внутриклеточную сигнальную сеть, хотя они стимулируют distInct сотовые ответы 8 , 9 . Обычные внутриклеточные медиаторы рецепторных тирозинкиназ включают Ras, Raf, внеклеточную сигнально-регулируемую киназу (ERK), митоген-активированную протеинкиназу (MAPK) / ERK-киназу (MEK), фосфоинозитид-3-киназу (PI3K), Akt и фосфолипазу C гамма (PLCγ) 10 , 11 . Накопление данных свидетельствует о том, что различение сигналов и их специфичность зависят от пространственного и временного регулирования сигнальной активности 12 . Например, в клетках феохромоцитомы крысы (PC12) стимуляция эпидермального фактора роста (EGF), которая приводит к пролиферации клеток, временно активирует путь ERK 9 . С другой стороны, стимуляция фактором роста нервов (NGF), который приводит к дифференциации клеток, активирует ERK-путь устойчивым образом 9 , 13 . В культуре rУ нейронов гиппокампа переходная сигнализация с помощью нейротрофического фактора мозга (BDNF) способствует первичному вырождению нейритов, в то время как устойчивая сигнализация приводит к увеличению разветвления нейритов 14 . Во время раннего эмбрионального развития фосфорилированная активность ERK является временной динамикой и широко распространена у эмбриона 6 . Недавний генетический экран во время раннего эмбриогенеза Xenopus показал, что каскады сигнализации ERK и Akt, два пучка первичных факторов роста ниже по течению, отображают специфические профили активации 7 . Таким образом, понимание результатов передачи киназы требует инструментов, которые могут определять пространственные и временные особенности киназной активности с достаточным разрешением.

Обычные экспериментальные подходы к исследованию динамического характера передачи сигнала во время развития не имеют желаемого пространственного и временного разрешения. Например, в фармакологических подходах используется небольшая химияИли биологические молекулы для стимуляции или подавления трансдукции сигнала в клетках и тканях. Диффузионный характер этих малых молекул затрудняет ограничение их действия на конкретный интересующий регион 15 . Генетические подходы ( например, трансгенезис, система Cre-Lox или мутагенез) часто приводят к необратимой активации или подавлению экспрессии гена-мишени или активности белка 16 , 17 , 18 . Система 19 Tet-On / Tet-Off предлагает улучшенный временный контроль транскрипции генов, но не имеет строгого пространственного контроля, поскольку она основана на диффузии тетрациклина. Недавние разработки в области химически индуцированной димеризации белка 20 или фотосъемки 21 , 22 , 23 , 24 значительно усиливаютВременного управления сигнальными сетями. Однако пространственный контроль остается сложным из-за диффузионного характера химикатов в клетке.

Недавние новые оптикогенные подходы, которые используют силу света для контроля белково-белковых взаимодействий, позволяют модулировать сигнальные пути с высокой пространственно-временной точностью, а также обратимостью. Вскоре после его первоначального успеха в борьбе с нейрональным обжигом 25 , 26 , 27 была расширена оптогенетика для контроля других клеточных процессов, таких как транскрипция генов, трансляция, миграция клеток, дифференцировка и апоптоз 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 . Стратегия, использующая pНедавно была разработана реакционноспособная гетероактивирующая белковая пара Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2) и N-концевой домен взаимодействующей с криптохром базовой спиральной спиральной спирали (CIBN) для управления активностью Raf1-киназы в клетках млекопитающих и эмбрионах Xenopus 35 . CRY2 связывается с CIBN при стимуляции синим светом, а белковый комплекс CRY2 / CIBN спонтанно диссоциирует в темноте 34 . Синий свет возбуждает кофактор CRY2, флавин адениндинуклеотид (FAD), что приводит к конформационному изменению CRY2 и его последующему связыванию с CIBN. Устойчивые активные (W374A) и флавин-дефицитные (D387A) мутанты CRY2 могут быть получены посредством мутаций в FAD-связывающем кармане: мутант CRY2 W374A связывается с CIBN независимо от света, тогда как CRY2 D387A- мутант не связывается с CIBN под синим Стимуляция света 36 , 37 . Оптогенетическая система, описанная iВ этом протоколе используются CRY2 дикого типа и CIBN для индуцирования транслокации, опосредованной транслокацией активации Raf1 в живых клетках. Известно, что мембранный набор Raf1 усиливает его активность 38 . В этой системе тандемный модуль CIBN привязан к плазматической мембране, а CRY2-mCherry слит с N-концом Raf1 35 . В отсутствие синего света CRY2-mCherry-Raf1 остается в цитоплазме, а Raf1 неактивен. Синяя стимуляция индуцирует связывание CRY2-CIBN и рекрутирует Raf1 в плазматическую мембрану, где активируется Raf1. Активация Raf стимулирует каскад сигнализации Raf / MEK / ERK. Оба белка CRY2- и CIBN-гибрида кодируются в бицистронной генетической системе. Эта стратегия может быть обобщена для контроля других киназ, таких как Akt, состояние активации которых также может быть включено путем транслокации белка в клетках 39 . В этой работе представлены подробные протоколы для реализации этой оптигенетической стратегии в культуре клеток млекопитающихRes и многоклеточных организмов.

протокол

Исследования животных проводились в соответствии с руководящими принципами, установленными Институтом по уходу и использованию животных в Иллинойсе (IACUC) и Департаментом животноводства Университета штата Иллинойс (DAR).

1. Оптогенетическая индукция локализации белка в культуре клеток млекопитающих BHK21

ПРИМЕЧАНИЕ. Шаги 1.1-1.3 обеспечивают способ сборки камеры для культивирования клеток для изображений с объектами с высоким увеличением ( например, 63X или 100X), которые обычно имеют короткие рабочие расстояния. Эти цели требуют тонкого покровного стекла ( например, # 1,5, толщина 170 мкм) в качестве подложки для формирования изображения. В качестве альтернативы можно использовать блюдо / слайд для культивирования клеток со стеклянным основанием. В этом случае шаги 1.1-1.3 могут быть пропущены.

  1. Покровные стекла для посуды
    1. Поместите 30 стеклянных покровных в держатель для покровного стекла.
    2. В пластиковый стакан емкостью 600 мл добавьте 20 г моющего средства и 400 мл теплой водопроводной воды. ПлацВ стакан на магнитной мешалке и перемешать до полного растворения моющего средства. Удалите пенопласт с помощью салфетки.
    3. Используйте нижнюю часть чашки Петри 100 мм х 15 мм в качестве проставки из мешалки и в качестве поверхности для держателя покровного стекла. Чтобы поддерживать адекватный поток во время процесса очистки, сделайте 3-4 отверстия для слива в чашке Петри.
    4. Чтобы сделать отверстия для слива, нагреть паяльник и прожечь пластик в вентилируемом вытяжном шкафу.
      ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Не касайтесь горячего паяльника голыми руками.
    5. Поместите держатель покровного стекла на чашку Петри в стакан. Перемешать в течение 2 часов до ночи при комнатной температуре.
    6. Промыть три раза 500 мл DI воды в 1000 мл стакане. Моющее средство можно повторно использовать.
    7. Возьмите отдельные покровные стекла с помощью щипцов. Погрузите покровные стекла в 190-образный (95%) этанол в течение 1 мин.
    8. Высушите покровные стекла внутри стерильного капюшона. Храните покровные стекла в стерильном пластиковом контейнере до использования.
  2. Изготовление покрытий из поли-L-лизина (PLL)
    1. Сделайте 0,1 М боратный буфер, растворяя 1,24 г борной кислоты и 1,9 г тетранабората натрия в 400 мл воды. Отрегулируйте pH до 8,5 с помощью 10 М NaOH.
    2. Растворить PLL в боратном буфере до конечной концентрации 1 мг / мл. Аликвот раствора PLL в 50 мл стерильных центрифужных пробирках.
    3. Добавить 50 мл раствора для покрытия PLL в 10-сантиметровую чашку для культивирования ткани. Поместите блюдо в инкубатор на 37 ° C, чтобы разогреть раствор PLL.
    4. Откройте контейнер для покровного стекла (шаг 1.1.8) в стерильном колпаке.
    5. Погружайте покровные покровные по одному в предварительно подогретый PLL-раствор в чашку для культивирования тканей. Избегайте образования пузырьков, чтобы погружать все поверхности.
    6. Поместите блюдо с покровным стеклом в инкубаторе CO 2 на 37 ° C в течение ночи. Выньте покровное и поместите его в стерильный держатель для покровного стекла. Промывайте три раза автоклавированной сверхчистой водой (18,2 MΩ & #183 см) в 1000 мл стакане в стерильном капюшоне.
    7. Высушите покровные стекла в держателе покровного стекла в стерильном колпаке. Храните покровные стекла в стерильном пластиковом контейнере до использования.
  3. Сборка камер культивирования клеток полидиметилсилоксана (PDMS)
    1. В пластиковом контейнере весить 40 г основы PDMS и добавить 4 г отвердителя для достижения 10: 1 вес. / Вес. Отношения PDMS и отвердителя. Смешайте PDMS / отверждающий агент, помешивая кончиком пипетки в течение 2 мин. Альтернативно, используйте центробежный смеситель.
    2. Используйте стакан с диаметром 4 дюйма в качестве шаблона для изготовления держателя с алюминиевой фольгой. Поместите держатель алюминиевой фольги в чашку Петри 15 см. Поместите кремниевую пластину размером 4 дюйма внутри держателя алюминиевой фольги.
    3. Вылейте смешанный раствор PDMS в держатель. Используйте тонкий стеклянный стержень, чтобы осторожно прикоснуться к краю пластины. Удалите все пузырьки воздуха, захваченные под пластиной.
    4. Вставьте 15-сантиметровую чашку Петри в вакуумную камеруR для дегазации решения PDMS. Продолжайте дегазацию в течение примерно 20 минут, пока не образуются пузырьки. Тем временем предварительно разогрейте конвекционную печь до 65 ° C.
    5. Осторожно положите чашку Петри 15 см в духовку. Инкубируйте в течение 2 часов.
    6. Извлеките пластину из духовки. Используйте стеклянный стержень, чтобы осторожно прикоснуться к краю PDMS и обеспечить полное сшивание. Если нет, инкубируйте дольше, пока PDMS не станет твердым и нелипким.
    7. Снимите алюминиевую фольгу с пластины и очистите ее от кремниевой пластины. Начиная с края, тщательно очистите отвержденный PDMS от кремниевой пластины.
      ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ. Избегайте применения слишком большого усилия, так как оно может сломать пластину.
    8. Обрежьте PDMS на прямоугольные части размером 20 мм x 30 мм, чтобы поместить 24 мм x 40 мм покровное стекло с помощью бритвенного лезвия.
    9. Используйте лезвие в форме долота, чтобы разрезать прямоугольное отверстие размером 10 мм x 20 мм от центра каждой части PDMS.
    10. Очистите камеры PDMS, используя протокол моющего средства, описанный в шаге 1.1.
    11. Высушите камеры PDMS в чистом капоте. Поместите сухие камеры в автоклавируемый контейнер, покрытый алюминиевой фольгой.
    12. Автоклавируйте контейнер с использованием силы тяжести (121 ° C, 15 фунтов на квадратный дюйм) в течение 30 минут и храните контейнер при комнатной температуре.
  4. BHK21 клеточное культивирование и трансфекция
    1. Получают 500 мл среды для культивирования клеток BHK21 путем смешивания 445 мл DMEM с 50 мл FBS и 5 мл 100 × Penn-Strep-Glutamine (10000 U / мл пенициллина, 10 мг / мл стрептомицина и 29,2 мг / мл L -glutamine). Убедитесь, что конечная концентрация FBS составляет 10%.
    2. Аликвоту 10 мл не-HEPES CO 2 -независимой среды для визуализации живых клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: CO 2 -независимая среда поддерживает рост клеток без инкубатора CO 2 и идеально подходит для визуализации клеток в атмосферных условиях. Подробную информацию см. В списке материалов. В дополнение к клеточной линии BHK21, другие типы клеток млекопитающих также должны даватьАналогичные результаты.
    3. Соберите устройство для культивирования клеток, поместив одну стерильную стерильную камеру PDMS (этап 1.3) на стерильное покровное покрытие с покрытием с PLL (шаг 1.2) в стерильном капюшоне.
    4. Поместите каждое устройство в стерильную чашку Петри 60 мм.
    5. Используйте 0,5 мл 0,25% трипсина для отделения клеток от одной лунки 12-луночного планшета для культуры тканей. Подсчитайте плотность клеток гемоцитометром. Пластина 20 000 клеток BHK21 в камере (около 10000 клеток / см 2 ) с 200 мкл клеточной культуральной среды.
    6. Подготовьте ДНК-плазмиду с помощью набора для приготовления плазмид (см. Список материалов).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Конструкция и функциональность CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX показаны на рисунке 1A - 1B .
    7. Двадцать четыре (24) ч после клеточного покрытия трансфицируют клетки 50-100 нг плазмиды CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX в соответствии с протоколом производителя.
    8. Через три (3) часа после трансфекции измените mEdium до 200 мкл свежей культуральной среды (этап 1.4.1) и позволяют клеткам восстанавливаться в течение ночи путем инкубации культуры в 37 ° C, 5% CO 2 -инкубаторе.
  5. Флуоресцентная визуализация живых клеток
    1. Включите компьютер, источник света, микроскоп и камеру. Для остальной части протокола используйте конфокальный флуоресцентный микроскоп (оснащенный объективом для герметизации 100X).
      ПРИМЕЧАНИЕ. Также может использоваться инвертированный эпифлуоресцентный микроскоп.
    2. Замените среду для культивирования клеток 200 мкл независимой от CO 2 среды.
    3. Настройте протокол сбора данных, прежде чем размещать ячейки на микроскопе. Используйте 488-нм возбуждающий канал FITC для оптико-электронной стимуляции. Используйте 561 нм возбуждающий канал TRITC, чтобы найти трансфицированные клетки и отслеживать клеточную локализацию меченного мерином белка.
    4. Установите коэффициент усиления каналов FITC и TRITC как 120 и 200 соответственно. Использовать время размещения пикселя 2,21; s и размер 512 x 512 пикселей.
    5. Измерьте мощность света 488 нм, поставив измеритель мощности близко к объективному окну. Суммарная мощность 2 мкВт (около 10000 Вт / см 2 в фокусе) достаточна для индуцирования ассоциации CIBN-CRY2PHR.
    6. Настройте получение метки времени с интервалом 5 с и общим временем сбора 2 мин.
    7. Приложите соответствующий подходящий материал (иммерсионное масло) к объективному окну. Используйте режим фазового контраста, чтобы сфокусироваться на ячейках на поверхности покровного стекла.
    8. Найдите трансфицированную клетку под светом 561 нм, перемещая ступень микроскопа.
      ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ. Избегайте использования синего света во время этого шага, так как он активирует связь между фотоактивируемыми белками.
    9. Как только трансфицированная клетка находится, инициируйте сбор данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Успешно трансфицированные клетки должны показывать флуоресценцию как в каналах FITC (из каналов 2CIBN-GFP-CaaX), так и TRITC (из CRY2-mCherry-Raf1) ( рисунок 1C-D ).
    10. Запишите серию изображений с отметкой времени в каналах FITC и TRITC ( рисунок 1D ).
    11. Чтобы исследовать спонтанную диссоциацию белкового комплекса CRY2-CIBN, запишите еще одну метку времени с каналом Txred в течение 20 минут с интервалом 30 с.
    12. Сохраните изображение с отметкой времени для анализа данных.
  6. Анализ изображений
    1. Откройте изображения с помощью программного обеспечения для анализа изображений, которое может извлечь интенсивность из изображения 40 .
    2. Выберите два репрезентативных моментальных снимка: один до экспозиции синего света и другую экспозицию после синего света.
    3. Нарисуйте линию через ячейку, охватывающую фон, плазматическую мембрану и цитоплазму. Проецируйте интенсивность вдоль этой линии. Сохраните значения и постройте их, чтобы сравнить разницу до и после экспозиции ( рисунок 1D ).
    4. Чтобы проанализировать кинетику ассоциации белка, selecТ. Е. Одна представляющая область интереса (ROI) в плазматической мембране, один ROI в цитоплазме и один ROI в фоновом режиме.
    5. Приобретите средние интенсивности плазматической мембраны (I PM ), цитоплазмы (I CYT ) и фона (I BKD ) для стека изображений.
    6. Рассчитайте соотношение интенсивности мембраны / цитозолей для каждого изображения, используя следующее уравнение:
      figure-protocol-11367
    7. Определите отношение по времени и определите кинетику связывания или диссоциации CRY2-CIBN ( рисунок 1E- F ).

2. Конструкция светодиодного массива для долговременной стимуляции света в инкубаторе CO 2

ПРИМЕЧАНИЕ. Общая схема экспериментальной установки показана на рисунке 2A .

  1. Сделайте светодиодную матрицу, вставив 12 синих светодиодов в два бункераDs и подключения токоограничивающих резисторов.
    ПРИМЕЧАНИЕ. При питании от 30 В можно подключить четыре светодиода последовательно, а их яркость можно контролировать с помощью токоограничивающего резистора.
  2. Поместите макеты в алюминиевую коробку.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Высота алюминиевой коробки должна составлять 2 дюйма. Эта высота оптимальна для освещения 12-луночного планшета для культуры тканей, поскольку размер расходящегося светового пятна такой же, как и у одной лунки.
  3. Для подключения к источнику питания используйте два металлических провода. Убедитесь, что длина провода достаточна, когда световая коробка находится внутри инкубатора CO 2 .
  4. Используйте прозрачный рассеиватель света в качестве крышки световой коробки ( рис. 2C ).
  5. Откалибруйте выходную мощность каждого светодиода в диапазоне входных напряжений. Используйте для использования в течение 24 часов анализа дифференцировки клеток PC12 мощностью 0,2 мВт / см 2 . Используйте энергию 5 мВт / см 2 для живых эмбрионов Xenopus или эксплантованализы.

3. Оптогенетическая индукция дифференцировки клеток PC12

  1. Культивирование и трансфекция клеток
    1. Получают 500 мл среды для культуры клеток крысы феохромоцитомы (PC12) путем смешивания 407,5 мл F12K с 75 мл сыворотки лошади + 12,5 мл FBS + 5 мл 100 × Penn-Strep-глутамина (конечные концентрации лошадиной сыворотки и FBS : 15% и 2,5% соответственно). Сделайте низкосернистую среду, смешав 1 объем полной среды в 99 объемах среды F12K.
    2. Plate PC12 в 12-луночном планшете с плотностью 300000 клеток / лунку или 75000 клеток / см 2 .
    3. Трансформируют клетки CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX через 24 часа после клеточного покрытия (аналогично шагу 1.4.7). Используйте 1,2 мкг ДНК для каждой лунки. Позвольте клеткам восстанавливаться в течение ночи в культуральной среде в инкубаторе с температурой 37 ° С, дополненном 5% СО 2 . Проверьте эффективность трансфекции через 16 ч после трансфекции.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Трансфекция 30-50% effНеобходимо достичь достаточности для обеспечения достаточного количества клеток.
    4. Измените среду на низкосернистую среду через 24 часа после трансфекции. Используйте 1 мл среды на лунку 12-луночного планшета.
  2. Светоиндуцированная дифференциация клеток PC12
    1. Поместите светодиодную матрицу в инкубатор CO 2 . Подключите его к источнику питания с помощью пары проводов. Установите мощность светодиода на 0,2 мВт / см 2 . Поместите 12-луночный планшет, содержащий трансфицированные клетки PC12 (шаг 3.1.3) в окне светодиодной матрицы. Применяйте непрерывную световую подсветку в течение 24 часов в инкубаторе с температурой 37 ° C с добавлением 5% CO 2 .
  3. Флуоресцентная визуализация живых клеток
    1. Выполните шаги 1.5.1-1.5.4 для микроскопа и подготовки образца.
    2. Настройте сбор данных с одним снимком. Используйте 200 мс для канала GFP и Txred.
    3. Захват изображений трансфицированных ячеек как в каналах GFP, так и в Txred. Запишите примерно 200 чел.Ls для каждого условия. Сохраните файлы для анализа данных.
  4. Анализ изображений
    1. Подсчитайте процент дифференцированных клеток по общему количеству трансфицированных клеток.
    2. Для подсчета ячеек используйте любой модуль подсчета ячеек в программном обеспечении для анализа изображений.
    3. Вручную рассчитывайте дифференцированные ячейки.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Дифференцированные клетки определяются как те, в которых по меньшей мере один нейрит заметно длиннее тела клетки ( рисунок 3А- 3В ).
    4. Повторите шаг 3.4.3 с недифференцированными клетками.
    5. Рассчитайте коэффициент дифференциации, используя следующее уравнение:
      figure-protocol-15991

4. Оптогенетический контроль активности киназы в эмбрионах Xenopus

  1. Подготовка буферов
    1. Подготовьте 1 L модифицированного рингера 1x Marc (MMR): 100 мМNaCl, 2 мМ KCl, 1 мМ MgCl 2 , 2 мМ CaCl 2 и 5 мМ HEPES; PH 7,5.
  2. Получение мРНК
    1. Дайте плазмидную ДНК CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX (2 мкг) с 1 мкл ApaI (50 единиц) при 37 ° C в течение 2 часов.
    2. Осаждающая линеаризованная ДНК в 60 мкл 100% этанола. Спин при 12000 × g в течение 5 мин при комнатной температуре для осаждения ДНК. Осторожно удалить супернатант и снова промыть осадок 60 мкл 70% этанола. Спин при 12000 × g в течение еще 5 мин при комнатной температуре. Тщательно удалите супернатант и ресуспендируйте ДНК-таблетку в 6 мкл ННК, свободной от РНКазы.
    3. Осуществлять транскрипцию in vitro путем инкубации 1 мкг линеаризованной ДНК с 2 мкл поставленной РНК-полимеразы SP6, рибонуклеотидной смеси (10 мМ АТФ, CTP и UTP, 2 мМ GTP и 8 мМ-аналогов колпачка) и 20 мкл нуклеазо- Свободной воды при комнатной температуре в течение 1 часа.
    4. Удалить DNA путем расщепления ДНКазой I при 37 ° C в течение по меньшей мере 15 минут и очистки синтезированной РНК с использованием спиновой колонки из кремнеземной мембраны.
    5. Остановите реакцию и осадите РНК, добавив 30 мкл свободной от нуклеазы воды и 30 мкл осаждающего раствора LiCl. Тщательно перемешать и охладить в течение 30 мин при -20 ° C.
    6. Центрифуга при 4 ° С в течение 15 мин при 12000 × g для осаждения РНК.
    7. Осторожно удалите супернатант. Промывают РНК один раз 1 мл 70% этанола и ресуспендируют в 40 мкл воды, свободной от нуклеазы.
    8. Загрузите 40 мкл РНК в спиновой колонке. Центрифуга при 4 ° С в течение 1 мин при 12000 × g для удаления неинкорпорированных нуклеотидов и колпачков.
  3. Урожай эмбрионов Xenopus
    1. Следуйте протоколу, описанному Sive et al. 41 для получения эмбрионов Xenopus .
  4. Микроинъекция мРНК
    1. фабриковатьИглы для микроинъекции, вытягивая стеклянные капилляры с помощью капиллярного съемника. Установите программу вытягивания на: heat = 355, сила тяги = 80, скорость = 50 и время = 100.
    2. Удалите желеобразное покрытие из эмбрионов, обработав их 3% цистеином (разбавленным в 0,2 раза MMR).
    3. Перенесите эмбрионы на 3% полисухарозу и 0,5x MMR раствор для микроинъекции. Внесите 500 мкг в 1 нг CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX РНК в каждый эмбрион.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Инъекция дозы выше 1 нг приводит к синей не зависящей от света активации сигнализации MAPK.
  5. Оптогенетическая стимуляция киназной активности
    1. Культурные микроинъективные эмбрионы в 3% полисухарозе, 0,5х MMR раствор при комнатной температуре до тех пор, пока они не достигнут стадии средней гаструлы (этап 12). Затем культивируйте эмбрионы в растворе 0,2x MMR.
    2. Перенесите эмбрионы или экспланты в 12-луночный планшет. Поместите 12-луночный планшет на встроенную светодиодную матрицу (шаг 2.5) для синего цветаT (475 нм).
    3. Поместите зеркало на верхнюю часть 12-луночного планшета, чтобы обеспечить полное синее освещение эмбрионов или эксплантов.
    4. Настройте мощность синего света на 5 мВт / см 2 .
      ПРИМЕЧАНИЕ. Обработка синим светом может быть выполнена в любой желаемый момент времени либо в 3% полисахарозе, 0,5х MMR-растворе, либо в 0,2 раза MMR-растворе.
    5. Урожай эмбрионов в любое нужное время. Используйте их для анализа гистологических, Вестерн-блоттингов или генов.

Результаты

Ратиометрическая экспрессия фотоактивируемых белковых пар: на фиг. 1А показана конструкция бицистронной оптикогенной конструкции CRY2-mCherry-Raf1-P2A-CIBN-CIBN-GFP-CaaX (называемая CRY2-2A-2CIBN) на основе свиного тешовирума- 1 2A (P2A), который показывает самую высокую эффект?...

Обсуждение

При построении световой коробки необходимо измерить мощность отдельных светодиодов. Основываясь на предыдущем опыте, выходная мощность может варьироваться между отдельными светодиодами из-за разницы в производстве. Выберите набор светодиодов, которые имеют выходную мощность в пред...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Университетом штата Иллинойс в Урбане-Шампейн (UIUC) и Национальными институтами здравоохранения (NIGMS R01GM111816).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Glass coverslip VWR48393 230Substrate for live cell imaging
Coverslip holder Newcomer Supply6817BHolder for coverslips
Detergent ThermoFisher16 000 104For cleaning coverslips
Boric acid Sigma-AldrichB6768-500GFor making PLL buffer
Disodium tetraborateSigma-Aldrich71996-250GFor making  PLL buffer
Plastic beakerNalgene1201-1000For cleaning coverslips
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich221465-2.5KGFor adjust pH
Poly-L-lysine hydrobromideSigma-AldrichP1274-500MGFor coating coverslip
Diethylpyrocarbonate (DEPC)-Treated WaterThermoFisher Scientific750024For DNA preparation
Cover Glass ForcepsTed Pella5645Cover glass handling
Tissue cutlure dishThermofisher12565321Cell culture dish
Sterile centrifuge tubesThermoFisher12-565-271Buffer storage
Transfection ReagentThermoFisherR0534Transfection
CO2-independent mediumThermoFisher18045088For live cell imaging
Polydimethylsiloxane (PDMS)Ellsworth Adhesives184 SIL ELAST KIT 0.5KGForm make cell chamber
Plasmid Maxiprep kitQiagen12965Plasmid preparation
DMEM mediumThermoFisher11965-084Cell culturing medium component
F12K mediumThermoFisher21127022Cell culturing medium component
Horse serumThermoFisher16050122Cell culturing medium component
Fetal Bovine SerumSigna-Aldrich12303C-500 mLCell culturing medium component
Penicillin-Streptomycin-GlutamineThermoFisher10378016Cell culturing medium component
Trypsin (0.25%), phenol redThermoFisher Scientific15050065 For mammalian cell dissociation
AgaroseFisher ScientificBP1356-100For DNA preparation
Ficoll PM400GE Heathcare Life Sciences17-5442-02For embryo buffer
L-Cysteine hydrochloride monohydrateSigma-Aldrich1.02839.0025Oocyte preparation
ApaIThermoFisherFD1414For linearization of plasmids
Dnase IThermoFisherAM2222For removing DNA template in the in vitro transcription assay
Index-match materials (immersion oil)ThorlabsMOIL-20LNFor matching the index between sample substrate and objective
Blue LEDAdafruit301Light source for optogenetic stimulation
Resistor kitAmazonEPC-103current-limiting resistor
Aluminum boxesBUD IndustriesAC-401light box 
BreadBoardJekewin837654333686For making LED array
Hook up WireElectronix Express27WK22SLD25For making LED array
Relay ModuleJbtekSRD-05VDC-SL-CFor intermittent light control
DC Power Supply TMSDCPowerSupply-LW-(PS-305D)Power supply for LED
Silicon Power HeadThorlabsS121CFor light intensity measurement
Power meterThorlabsPM100D For light intensity measurement
MicroscopeLeica BiosystemsDMI8For live cell imaging
BioSafety CabinetThermoFisher1300 Series A2For mammalian cell handling
CO2 incubatorThermoFisherIsotempFor mammalian cell culturing
Stereo microscopeLeicaM60For embryo micro-manipulation
MicroinjectorNarishigeIM300For embryo microinjection
Micropipette pullerSutter InstrumentsP87Needle puller
in vitro transcription kitThermoFisherAM1340For in vitro transcription. The kit includes nuclease-free water, SP6 RNA  Polymerase, ribonucleotide mixture, cap analog, lithium choride precipitation solution, and spin column  
RNA purfication kitQiagen74104Silica-membrane spin column for purification of synthesized RNA 
Convection ovenMTI corporation EQ-DHG-9015PDMS curing
Centrifugal mixer and teflon containerTHINKYAR310For mixing PDMS
Silicon waferUniversityWafer452Base for making PDMS  devices
BladeTechni Edge01-801For cutting PDMS
Capillary glassSutter InstrumentsBF100-58-10For fabrication of injecting needles. 

Ссылки

  1. Schlessinger, J., Ullrich, A. Growth factor signaling by receptor tyrosine kinases. Neuron. 9 (3), 383-391 (1992).
  2. Thisse, B., Thisse, C. Functions and regulations of fibroblast growth factor signaling during embryonic development. Dev Biol. 287 (2), 390-402 (2005).
  3. Perrimon, N., Pitsouli, C., Shilo, B. Z. Signaling mechanisms controlling cell fate and embryonic patterning. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a005975 (2012).
  4. Salles, F. H., et al. Mental disorders, functional impairment, and nerve growth factor. Psychol Res Behav Manag. 10, 9-15 (2017).
  5. Basson, M. A. Signaling in cell differentiation and morphogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (6), (2012).
  6. Schohl, A., Fagotto, F. beta-catenin, MAPK and Smad signaling during early Xenopus development. Development. 129 (1), 37-52 (2002).
  7. Zhang, S. W., Li, J. J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signalling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PloS one. 8 (11), e79469 (2013).
  8. Sweeney, C., et al. Growth factor-specific signaling pathway stimulation and gene expression mediated by ErbB receptors. J Biol Chem. 276 (25), 22685-22698 (2001).
  9. Marshall, C. J. Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation. Cell. 80 (2), 179-185 (1995).
  10. Vandergeer, P., Hunter, T., Lindberg, R. A. Receptor Protein-Tyrosine Kinases and Their Signal-Transduction Pathways. Annu Rev Cell Biol. 10, 251-337 (1994).
  11. Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
  12. Hunter, T. Signaling--2000 and beyond. Cell. 100 (1), 113-127 (2000).
  13. Qiu, M. S., Green, S. H. PC12 cell neuronal differentiation is associated with prolonged p21ras activity and consequent prolonged ERK activity. Neuron. 9 (4), 705-717 (1992).
  14. Ji, Y., et al. Acute and gradual increases in BDNF concentration elicit distinct signaling and functions in neurons. Nat Neurosci. 13 (3), 302-309 (2010).
  15. Luby-Phelps, K. Cytoarchitecture and physical properties of cytoplasm: volume, viscosity, diffusion, intracellular surface area. Int Rev Cytol. 192, 189-221 (2000).
  16. Sauer, B. Inducible gene targeting in mice using the Cre/lox system. Methods-a Companion to Methods in Enzymology. 14 (4), 381-392 (1998).
  17. Ling, M. M., Robinson, B. H. Approaches to DNA mutagenesis: an overview. Anal Biochem. 254 (2), 157-178 (1997).
  18. Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Animal transgenesis: an overview. Brain Struct Funct. 214 (2-3), 91-109 (2010).
  19. Wanka, F., et al. Tet-on, or Tet-off, that is the question: Advanced conditional gene expression in Aspergillus. Fungal Genet Biol. 89, 72-83 (2016).
  20. Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nat Biotechnol. 28 (7), 743-747 (2010).
  21. Liu, Q. Y., Deiters, A. Optochemical Control of Deoxyoligonucleotide Function via a Nucleobase-Caging Approach. Accounts of Chemical Research. 47 (1), 45-55 (2014).
  22. Arbely, E., Torres-Kolbus, J., Deiters, A., Chin, J. W. Photocontrol of tyrosine phosphorylation in mammalian cells via genetic encoding of photocaged tyrosine. J Am Chem Soc. 134 (29), 11912-11915 (2012).
  23. Gautier, A., Deiters, A., Chin, J. W. Light-activated kinases enable temporal dissection of signaling networks in living cells. J Am Chem Soc. 133 (7), 2124-2127 (2011).
  24. Nguyen, D. P., et al. Genetic Encoding of Photocaged Cysteine Allows Photoactivation of TEV Protease in Live Mammalian Cells. J Am Chem Soc. 136 (6), 2240-2243 (2014).
  25. Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  26. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  27. Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. Nat Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).
  28. Zhang, K., Cui, B. Optogenetic control of intracellular signaling pathways. Trends in Biotechnology. 33 (2), 92-100 (2015).
  29. Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (8), 551-558 (2014).
  30. Kim, B., Lin, M. Z. Optobiology: optical control of biological processes via protein engineering. Biochemical Society Transactions. 41 (5), 1183-1188 (2013).
  31. Tucker, C. L. Manipulating cellular processes using optical control of protein-protein interactions. Prog Brain Res. 196, 95-117 (2012).
  32. Toettcher, J. E., Gong, D. Q., Lim, W. A., Weiner, O. D. Light Control of Plasma Membrane Recruitment Using the Phy-Pif System. Method Enzymol. 497, 409-423 (2011).
  33. Zoltowski, B. D., Gardner, K. H. Tripping the light fantastic: blue-light photoreceptors as examples of environmentally modulated protein-protein interactions. Biochemistry. 50 (1), 4-16 (2011).
  34. Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  35. Krishnamurthy, V. V., et al. Reversible optogenetic control of kinase activity during differentiation and embryonic development. Development. 143 (21), 4085-4094 (2016).
  36. Liu, H., et al. Photoexcited CRY2 Interacts with CIB1 to Regulate Transcription and Floral Initiation in Arabidopsis. Science. 322 (5907), 1535-1539 (2008).
  37. Li, X., et al. Arabidopsis cryptochrome 2 (CRY2) functions by the photoactivation mechanism distinct from the tryptophan (trp) triad-dependent photoreduction. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20844-20849 (2011).
  38. Leevers, S. J., Paterson, H. F., Marshall, C. J. Requirement for Ras in Raf Activation Is Overcome by Targeting Raf to the Plasma-Membrane. Nature. 369 (6479), 411-414 (1994).
  39. Kohn, A. D., Takeuchi, F., Roth, R. A. Akt, a pleckstrin homology domain containing kinase, is activated primarily by phosphorylation. J Biol Chem. 271 (36), 21920-21926 (1996).
  40. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  41. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , (2000).
  42. Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6 (4), e18556 (2011).
  43. Ishimura, A., et al. Oncogenic Met receptor induces ectopic structures in Xenopus embryos. Oncogene. 25 (31), 4286-4299 (2006).
  44. Zhang, K., et al. Light-Mediated Kinetic Control Reveals the Temporal Effect of the Raf/MEK/ERK Pathway in PC12 Cell Neurite Outgrowth. PloS one. 9 (3), e92917 (2014).
  45. Mohanty, S. K., Lakshminarayananan, V. Optical Techniques in Optogenetics. J Mod Opt. 62 (12), 949-970 (2015).
  46. Taslimi, A., et al. Optimized second-generation CRY2-CIB dimerizers and photoactivatable Cre recombinase. Nature chemical biology. 12 (6), 425-430 (2016).
  47. Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A., Sato, M. Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins. Nat Commun. 6, 6256 (2015).
  48. Wang, H., et al. LOVTRAP: an optogenetic system for photoinduced protein dissociation. Nat Methods. 13 (9), 755-758 (2016).
  49. Chang, K. Y., et al. Light-inducible receptor tyrosine kinases that regulate neurotrophin signalling. Nat Commun. 5, 4057 (2014).
  50. Boulina, M., Samarajeewa, H., Baker, J. D., Kim, M. D., Chiba, A. Live imaging of multicolor-labeled cells in Drosophila. Development. 140 (7), 1605-1613 (2013).
  51. Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, C. Optogenetic control of transcription in zebrafish. PLoS One. 7 (11), e50738 (2012).
  52. Buckley, C. E., et al. Reversible Optogenetic Control of Subcellular Protein Localization in a Live Vertebrate Embryo. Dev Cell. 36 (1), 117-126 (2016).
  53. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature chemical biology. 10 (3), 196-202 (2014).
  54. Beyer, H. M., et al. Red Light-Regulated Reversible Nuclear Localization of Proteins in Mammalian Cells and Zebrafish. ACS Synth Biol. 4 (9), 951-958 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

124PC12XenopusCRY2 CIBNRaf MEK ERK

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены