JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем поддерживаемый липидный бислой в контексте микрофлюидной платформы для изучения взаимодействия белок-фосфоинозитид с использованием метода без меток, основанного на модуляции рН.

Аннотация

Многочисленные клеточные белки взаимодействуют с поверхностями мембран, чтобы влиять на существенные клеточные процессы. Эти взаимодействия могут быть направлены на конкретный липидный компонент внутри мембраны, как в случае фосфоинозитидов (ПГИ), для обеспечения специфической субклеточной локализации и / или активации. PIPs и клеточные PIP-связывающие домены были широко изучены, чтобы лучше понять их роль в клеточной физиологии. Мы применили анализ модуляции рН на поддерживаемых липидных бислоях (SLB) в качестве инструмента для изучения взаимодействия белка с PIP. В этих исследованиях для определения белково-PIP-взаимодействий используется рН-чувствительный орто- сульфоподадим B-конъюгированный фосфатидилэтаноламин. При связывании белка с поверхностью, содержащей PIP-мембрану, межфазный потенциал модулируется ( т. Е. Изменяется локальный рН), изменяя состояние протонирования зонда. Пример успешного использования анализа модуляции рН представлен с использованием фосфолипазы C delta1 PleckstrВ гомологии (PLC-δ1 PH) и фосфатидилинозитол 4,5-бисфосфат (PI (4,5) P 2 ). Очевидная константа диссоциации ( K d, app ) для этого взаимодействия составляла 0,39 ± 0,05 мкМ, аналогично K d, значениям приложения, полученным другими. Как было отмечено ранее, ПЛК-δ1 домен РНА PI (4,5) P 2 специфический, показывает более слабое не связывание по отношению к фосфатидилинозитолам 4-фосфата, а не связывание с чистым фосфатидилхолином SLBS. Анализ PIP-на-чипе является преимуществом по сравнению с традиционными анализами связывания PIP, включая, но не ограничиваясь ими, низкий объем образца и отсутствие требований к маркировке лигандов / рецепторов, способность тестировать взаимодействия с высокой и низкой аффинностью мембран как с малыми, так и с малыми Больших молекул и улучшенного соотношения сигнал / шум. Соответственно, использование подхода PIP-на-чипе облегчит выяснение механизмов широкого спектра мембранных взаимодействий. Кроме того, этот метод потенциально может бытьSed при идентификации терапевтических средств, которые модулируют способность белка взаимодействовать с мембранами.

Введение

Мириады взаимодействий и биохимические процессы протекают на поверхности двумерных жидкостных мембран. Мембранные органеллы в эукариотических клетках уникальны не только в биохимических процессах и их ассоциированном протеоме, но также и в их составе липидов. Одним исключительным классом фосфолипидов является фосфоинозитиды (ПГИ). Несмотря на то, что они составляют лишь 1% клеточного липидома, они играют решающую роль в передаче сигналов, аутофагии и распространении мембран, среди прочих 1 , 2 , 3 , 4 . Динамическое фосфорилирование головной группы инозитола клеточными киназами PIP приводит к появлению семи головных групп PIP, моно-, бис- или трисфосфорилированных 5 . Кроме того, PIP определяют субклеточную идентичность мембран и служат специализированными местами для стыковки мембран для белков / ферментов, содержащих один или несколько фосфоиновНапример, гомологию Плекстрина (PH), гомологию Фокса (PX) и эпсиновую N-терминальную гомологию (ENTH) 6 , 7 . Одним из наиболее изученных PIP-связывающих доменов является домен фосфолипазы C (PLC) -δ1 PH, который специфически взаимодействует с 4,5-бисфосфатом фосфатидилинозитола (PI (4,5) P 2 ) в пределах сродства к высокому наномолярно-низкому микромолярному диапазону 8 , 9 , 10 , 11 .

Разработаны различные качественные и количественные методы in vitro и используются для изучения механизма, термодинамики и специфичности этих взаимодействий. Среди наиболее часто используемых анализов на PIP-связывание - поверхностный плазмонный резонанс (SPR), изотермическая калориметрия (ITC), спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР), липосомная флотация / седиментационный анализ и липид-блоты (Fat-blots / PIP-strip)12 , 13 . Несмотря на то, что они широко используются, все они имеют множество недостатков. Например, SPR, ITC и NMR требуют больших объемов выборки, дорогостоящих приборов и / или обученного персонала 12 , 13 . В некоторых форматах анализа, таких как липид-блоты на основе антител, используются водорастворимые формы ПГИ и представлены их нефизиологическим образом 12 , 14 , 15 , 16 . Кроме того, липидные пятна не могут быть надежно оценены количественно, и они часто приводили к ложным положительным / отрицательным наблюдениям 12 , 17 , 18 . Чтобы преодолеть эти проблемы и улучшить текущий набор инструментов, был создан новый метод без этикетки на основе поддерживаемого липидного бислоя (SLB) в контексте am icrofluidic платформы, который был успешно применен к изучению белок-ПУМ взаимодействий (Рисунок 1) 19.

Стратегия, используемая для обнаружения взаимодействий белок-PIP, основана на измерении модуляции pH. Это включает pH-чувствительный краситель, который имеет орто- сульфамодинамик B ( o SRB), непосредственно конъюгированный с группой 20 липидов липидов фосфатидилэтаноламина. Зонд o SRB-POPE ( рис. 2A ) сильно флуоресцентен при низком значении pH и гасит при высоком рН pKa около 6,7 в пределах 7,5 мол.% PI (4,5) P 2 -содержащих SLB ( рис. 5B ). PLC-δ1 домен PH широко используется для проверки методологий связывания белка с PIP из-за его высокой специфичности к PI (4,5) P 2 ( фиг.5A ) 21 , 22 ,"> 23 , 24 , 25. Мы полагали, что домен PLC-δ1 PH может быть использован для проверки его связывания с PI (4,5) P 2 с помощью анализа PIP-на-чипе. используемый в данном исследовании имеет суммарный положительный заряд (РI 8.4), и , следовательно , привлекает ОН -. ионы (рис 5с) После связывания с PI (4,5) P 2 отработанный SLBS, домен PH приносит ОН - ионов в Мембрана, которая, в свою очередь, модулирует межфазный потенциал и сдвигает состояние протонирования o SRB-POPE ( рис. 5C ) 26. В зависимости от концентрации домена PH флуоресценция гасится ( рис. 6A ). Наконец, нормированные данные Подходит для изотермы связывания для определения аффинности взаимодействия PH-домена-PI (4,5) P 2 ( рис. 6B , 6C ).

В этом исследовании представлен подробный протокол для связывания белка с PIP-содержащими SLB в микрофлюидной платформе. Этот протокол позволяет читателю собирать микрожидкостное устройство и препарат везикул для образования SLB и связывания с белком. Кроме того, предоставляются направления для анализа данных для извлечения информации о сродстве для взаимодействия PLC-δ1 PH-PI (4,5) P 2 .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Очистка стеклянных крышек

  1. Разбавьте 7-кратный очищающий раствор (см. Таблицу материалов ) в 7 раз с деионизированной водой в чашке из боросиликатного стекла толщиной 100 мм с плоским дном и нагрейте его до 95 ° C на ровной плите в течение 20 минут или до тех пор, пока не станет ясно, ,
    ПРИМЕЧАНИЕ. Решение будет горячим, соблюдайте осторожность, чтобы избежать телесных повреждений. 7x Чистящий раствор представляет собой запатентованную смесь гексанатрия [оксидо [оксидо (фосфонатоокси) фосфорил] оксифосфорил] фосфата, 2- (2-бутоксиэтокси) этанола, 1,4-бис (2-этилгексокси) -1,4-диоксобутана натрия -2-сульфонатные и неопасные добавки.
  2. Используя пинцет, расположите покровные стекла (длина 40 мм х 22 мм шириной х 0,16-0,19 мм) на алюминиевой окрасочной стойке в чередующихся направлениях. Держите пустое пятно между каждым покровным слоем, чтобы они не касались друг друга.
  3. Полностью погрузите окрашивающую стойку с помощью покровных в очищающий раствор. Держите покровные вРаствор в течение 1 часа.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Когда вода испаряется, продолжайте добавлять свежую деионизированную воду, чтобы поддерживать концентрацию раствора без изменений.
  4. Выньте окрашивающие стеллажи из очищающего раствора и промойте покровные стекла обильным количеством деионизированной воды, чтобы удалить моющее средство.
  5. Высушите покровные стекла газообразным азотом (приблизительно 5 минут на стойку для окрашивания), а затем поместите покровные стекла в печь на 6 часов при 550 ° C для отжига.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Это важный шаг, который сглаживает грубые свойства на поверхности стекла.
  6. Поместите покровные стекла в пластиковый контейнер и держите их подальше от пыли.

2. Изготовление блоков микрокомпилированных PDMS

  1. Смешать полидиметилсилоксановый (PDMS) форполимер и отвердитель при соотношении 10: 1 (мас. / Мас.) На большой пластиковой взвешенной лодке и дегазировать в вакууме в течение 1 часа с силой вакуума при 500 Торр или менее.
    ПРИМЕЧАНИЕ. PDMS представляет собой прозрачный и инертный силиконовый полимер. Чтобы получить желаемый блок PDMS t(0,5 см), смешайте 55 г форполимера с 5,5 г отвердителя.
  2. Поместите кремниевый мастер, который содержит несколько повторов одного и того же микротрубочки SU-8 в большой пластиковой весовой лодке диаметром 10 см и вылейте дегазированную PDMS. Затем вылечите его в сухом духовке при 60 ° C в течение ночи.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Микрокассеты достаточно большие, чтобы их можно было видеть невооруженным глазом. Каждый образец содержит 8 микроканалов (ширина 100 мкм x 40 мкм, высота х 1 см) с интервалом 40 мкм между ними ( рис. 1А , 1В ). Кремниевая пластинчатая форма, состоящая из твердого печеного фоторезиста SU-8, была изготовлена ​​в установке 27 нанообработки. Другие подходы к основному приготовлению включают плавление фтористоводородной кислоты (HF), высокотемпературное травление водой, кюрографию и трехмерную печать 28 , 29 , 30 , 31 . CommercТакже могут быть использованы источники для подготовки кремния. Образцы микрожидкостного устройства были разработаны с использованием программного обеспечения для составления чертежей (см. Таблицу материалов). Исходный файл, содержащий шаблон, предоставляется в виде дополнительного файла «Pattern Design.dwg», который может быть предоставлен непосредственно производителю.
  3. Нежно отделите PDMS от кремниевого мастера руками. Отметьте границы каждого микрошара в прямоугольниках с помощью хирургического скальпеля и линейки. Затем отрежьте PDMS на блоки.
  4. Перфорируйте 16 отверстий (8 входов и 8 выходов на блок) на обоих концах каждого микроканала с помощью биопсийного пуансона (диаметр отверстия 1,0 мм), как показано на рисунке 3B .
  5. Нанесите ленту поверх каждого блока PDMS, чтобы защитить микронапряжения от повреждений и пыли. Храните их в пластиковом контейнере.

3. Подготовка малых однослойных везикул (внедорожников)

ПРИМЕЧАНИЕ. Двухслойная композиция с отрицательным контролемсоставляет 99,5% мол 1-пальмитоил-2-oleoyl- зп глицеро-3-фосфохолин (POPC) и 0,5 моль% орто- сульфородамина В-1-пальмитоил-2-oleoyl- зп глицеро-3-фосфоэтаноламин (о SRB- ПАПА). Испытуемая двухслойная композиция составляет 92,0 мол.% POPC, 0,5 мол.% O SRB-POPE и 7,5 мол.% L-α-фосфатидилинозитол-4-фосфата (PI4P) или L-α-фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфата (PI ( 4,5) P 2 ). Ниже приведена методика получения 92,0 мол.% POPC, 0,5 мол.% O SRB-POPE и 7,5 мол.% PI (4,5) P 2 -содержащих внедорожников. Синтез o SRB-POPE, использованный в этом исследовании, был ранее описан 20 .

  1. Рассчитайте объем POPC, PI (4,5) P 2 и o SRB-POPE, которые необходимо смешивать, что составляет следующие общие количества: 2,22 мг POPC, 0,26 мг PI (4,5) P 2 , И 2,1 × 10 -5 мг o SRB-POPE.
  2. Пипеткой рассчитанный объем POPC, PI (4,5) P 2 , o SRB-POPE в один стеклянный сцинтилляционный флакон объемом 20 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: исходные растворы POPC и o SRB-POPE входят в раствор хлороформа, тогда как запас PI (4,5) P 2 (и других фосфоинозитидов) поступает в смесь растворителей хлороформ: метанол: вода (20: 9: 1). Для точности смажьте наконечник пипетки хлороформом перед его использованием. Для безопасности этот шаг должен проходить внутри химического вытяжного шкафа.
  3. Высушите смесь в потоке газообразного азота внутри химического вытяжного шкафа в течение 10 минут или до тех пор, пока растворитель не испарится и на нижней части флакона образуется тонкая липидная пленка.
  4. Высушить смесь под вакуумом в течение 3 ч при вакуумировании 10 мТорр для удаления остаточного органического растворителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Время высыхания 3 ч достаточно для шкалы подготовки SUV, описанной в этом протоколе, что подходит для 50 экспериментов. Если требуется более крупная шкала подготовки внедорожника, может быть выполнено высушивание в течение ночи.
  5. Восстановить(20 мМ HEPES, 100 мМ NaCl, при pH 7,0) и помещают его в ультразвуковую ванну при рабочей частоте 35 кГц в течение 30 мин при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Смешивание количеств липидов, указанных на этапе 3.1, и добавление 5 мл бегущего буфера на стадии 3.5 дает суспензию везикулы при 0,5 мг / мл. На этом этапе суспензия везикул представляет собой смесь однослойных и многослойных везикул ( фиг. 2В ). Решение будет выглядеть розово-фиолетовым цветом и относительно мутным.
  6. Замораживание-оттаивание суспензии пузырьков жидким азотом и водяной баней при 40 ° C для получения однослойных везикул. Повторите замораживание-оттепель 10 раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ. (Необязательно). Для обеспечения отсутствия неламеллярных везикул в суспензии можно применять операцию центрифугирования 32 , 33 .
  7. Экструдируйте суспензию везикул через 0,10 мкм трек-травленную поликарбонатную мембрану с использованием липидного экструдера (см.Таблица материалов) для обогащения внедорожников. Повторите экструзию 10 раз.
    ПРИМЕЧАНИЕ. 15-мл коническую трубку можно использовать для сбора экструдированных везикул. На этом этапе решение должно быть не мутным. Диаметр SUV можно подтвердить с помощью динамического рассеяния света (DLS) ( рис. 2C ). Внедорожники лучше всего подходят для формирования SLB 34 .
  8. Накройте коническую трубку алюминиевой фольгой и храните при температуре 4 ° C до готовности к использованию.

4. Сборка микрожидкостного устройства

  1. Протестируйте входы и выходы блока PDMS для блокировки, пропуская деионизированную воду через отверстия с помощью бутылки для промывки водой. Затем высушите блок PDMS газообразным азотом.
    ПРИМЕЧАНИЕ. На этом этапе также будут удалены любые частицы пыли, которые могли быть захвачены внутри и / или между каналами. Если необходимо, очистите очищенные покровные стекла газообразным азотом для удаления любых частиц пыли.
  2. Поместите блок PDMS и предварительно очищенную(См. Раздел 1) внутри кислородной плазменной системы (см. Таблицу материалов) камеру для экспонирования с кислородной плазмой в течение 45 с с установкой мощности при 75 Вт, скоростью потока кислорода при 10 см 3 / мин и силой вакуума при 200 мТорр ,
  3. Поместите узорную поверхность блока PDMS в контакт с покровным стеклом сразу же после обработки кислородной плазмой. Нажмите мягко, чтобы удалить пузырьки воздуха на местах контакта.
  4. Поместите устройство на ровную горячую плиту при 100 ° C в течение 3 минут, чтобы улучшить склеивание.
  5. Используйте влажную безворсовую салфетку ( например, кимвипе) со 100% этанолом для удаления пыли с верхней части (PDMS) и нижней части (стекла) устройства. Затем закрепите устройство на стекле на стекле.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Не используйте чрезмерное количество этанола и избегайте попадания этанола во входные и выходные каналы. Рекомендуется выполнить этот шаг, пока устройство остается горячим, чтобы гарантировать, что этанол немедленно испарится. Стеклянный микрофонOscopy slides можно хранить в 100% -ном растворе этанола для удаления пыли и других загрязнений.

5. Формирование поддерживаемых липидных бислоев (SLB)

  1. Передайте 100 мкл PI (4,5) P 2 -содержащих внедорожников с шага 3.8 в микроцентрифужную пробирку 0,65 мл. Отрегулируйте рН раствора до ~ 3,2 путем добавления 6,4 мкл 0,2 н. Соляной кислоты.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Подтвердите pH раствора с помощью рН-метра, снабженного зондом с микро-рН (см. Таблицу материалов).
  2. Внесите 10 мкл раствора SUV с регулируемым pH в каждый канал через вход и нанесите давление через пипетку до тех пор, пока раствор не достигнет выхода. Отсоедините наконечник от пипетки и оставьте его прикрепленным к устройству.
  3. Повторите вышеуказанный шаг для каждого канала, а затем инкубируйте устройство в течение 10 минут при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Впрыскивание везикул в микроканалы должно выполняться сразу после сборки устройства.
  4. Режущие наборы впускных и выпускных трубок eaХ 60 см (входная трубка) и 8 см (выпускная трубка), соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Резка трубки по диагонали и создание острой кромки облегчает установку трубки в отверстия и выпускные отверстия. Выпускная трубка должна иметь форму дуги. Длина впускной трубы может варьироваться в зависимости от установки микроскопа. Внутренний диаметр трубки составляет 0,05 см.
  5. Используя пинцет, подключите выпускную трубу, установленную к устройству, и затем заклейте устройство на ступень микроскопа.
  6. Погрузите один конец впускной трубки, установленный в 25 мл бегущего буфера, содержащегося в конической трубке, и закрепите его лентой, чтобы убедиться, что трубка закреплена.
  7. Поместите коническую трубку на более высокую поверхность (~ 20 см), чем устройство, чтобы проталкивать раствор через микроканалы через гравитационный поток; Для этого можно использовать лабораторный домкрат.
  8. Для каждой входной трубки используйте шприц для натягивания 1 мл бегущего буфера из свободного конца трубки. Удалите наконечник пипетки с впускного отверстия и вставьтеСвободный конец впускной трубы в устройство.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Внесите капельку буфера на вход, чтобы уменьшить вероятность появления пузырька воздуха в канале на этом этапе. После того, как впускная трубка присоединяется к устройству, используйте безворсовую салфетку для удаления избыточного буфера.
  9. Повторите описанный выше шаг, чтобы соединить все элементы впускного трубопровода с устройством.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Проточный буферный поток через каналы помогает удалять избыточные пузырьки и уравновешивать двухслойный слой до экспериментальных условий.
  10. Откройте программное обеспечение для управления микроскопом (см. Таблицу материалов). На левой панели щелкните вкладку «Микроскоп» и выберите цель «10X».
  11. Нажмите «Live», а затем «Alexa 568» значки изображений на панели инструментов. Используя тонкие ручки регулировки курса, сосредоточьтесь на микроканалах.
  12. Просканируйте устройство, чтобы проверить качество SLB и каналов ( рисунок 8 ). Затем,Щелкните значок «FL Shutter Closed» на панели инструментов.
  13. Перейдите на вкладку «Приобретение», а в разделе «Основные настройки» выберите «Время экспозиции». Установите время экспозиции равным «200 мс».
  14. На левой панели нажмите «Многомерное приобретение», а в меню «Фильтры» выберите красный канал (отмечен как «Alexa 568»). Затем нажмите «Время», установите интервал времени до 5 минут, продолжительность до 30 минут и нажмите «Пуск».
    ПРИМЕЧАНИЕ. В зависимости от продолжительности (30 мин) и скорости потока (~ 1,0 мкл / мин) для выравнивания SLB в канале используется 30 мкл рабочего буфера, т.е. для всех 8 каналов используется 240 мкл рабочего буфера.
  15. Выберите инструмент «Круг» на вкладке «Измерение» и нарисуйте круг в любом канале. Щелкните правой кнопкой мыши, когда выбран круг, и выберите «Свойства». На вкладке «Профиль» проверьте «все T», чтобы просмотретьИнтенсивность флуоресценции как функция времени.
    1. Убедитесь, что эта кривая достигает плато, которое указывает на равновесие, прежде чем перейти к следующему шагу.
  16. Опустите буферный раствор на равную поверхность как устройство, чтобы остановить поток.
  17. Сохраните файл временной задержки.

6. Тестирование взаимодействия доменов PLC-δ1 PH с PI (4,5) P 2 -содержащими SLB

  1. Подготовьте разведения домена PH, используя бегущий буфер в качестве разбавителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Поскольку в устройстве имеется восемь каналов, используйте для их пустых элементов как минимум два из них. Выбирайте дальние концы с каждой стороны и используйте оставшиеся каналы для разведения белка. Были испытаны следующие концентрации домена PH: 0,10, 0,25, 0,50, 1,00 и 2,50 мкМ. Приблизительно 200 мкл каждого разведения было достаточным для достижения равновесия в течение 30 мин.
  2. По одному, отсоедините каждую выпускную трубку и нанесите 200 мкл каждого разведения белка вВыходной канал с использованием пипетки. Не применяйте никакого давления, дайте гравитации выполнить работу. Отсоедините наконечник от пипетки и оставьте его прикрепленным к микрожидкостному устройству.
  3. Повторите вышеуказанный шаг для каждого канала и убедитесь, что воздушные пузырьки не введены в каналы во время этого процесса.
  4. Опустите входную трубу на землю под микрожидкостное устройство, чтобы начать протекать через микроканалы. Проденьте свободный конец трубки в контейнер для отходов. Поток белковых разведений в течение 30 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ. Это приведет к обратному потоку и позволяет вводить белок в каналы. Необходимое время для уравновешивания и объем необходимых разведений белка зависит от аффинности взаимодействия.
  5. На левой панели программного обеспечения на вкладке «Время ожидания» нажмите «Пуск», чтобы начать визуализацию снова.
  6. Повторите шаг 5.15, чтобы убедиться, что равновесие достигнуто. Когда эксперимент будет завершен, сэкономьте времяфайл.

7. Оценка мембранной текучести

ПРИМЕЧАНИЕ. Для каждой новой партии внедорожников и очищенных покровных покрытий для стекла должны выполняться эксперименты по флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP), чтобы гарантировать, что SLB являются текучими.

  1. Следуйте процедуре по очистке стеклянных покровных (1.1-1.6), изготовлению микропланктонных блоков PDMS (2.1-2.5), подготовке внедорожников (3.1-3.8), сборке микрожидкостного устройства (4.1-4.5) и формированию SLB (5.1-5.17), как ранее описано.
  2. Фокусируйте микроскоп на двухслойном слое, установите время экспозиции на 200 мс, а биннинг - на 1.
  3. Фото-отбеливать круговое пятно с использованием лазерного луча 532 нм, 2 мВт (радиус 13 мкМ). Сразу же после фотообесцвечивания начните захватывать серию изображений каждые 3 с в течение первых 45 с, за которым следует интервал 30 с в течение оставшегося времени (общая продолжительность 15 мин). После завершения сбора данных сохраните файл временной задержки.
  4. Выберите отбеленный aИспользуя инструмент рисования кругов для извлечения значений интенсивности флуоресценции в зависимости от времени. Кроме того, выберите еще две области рядом, одну из которых соответствует небеленой области, а другая соответствует области без каких-либо SLB.
  5. Рассчитайте восстановление флуоресценции ( y ), используя следующее уравнение:
    figure-protocol-17276
    ПРИМЕЧАНИЕ. Здесь F t представляет интенсивность отбеленной области как функцию времени, F i представляет интенсивность флуоресценции перед отбеливанием (используйте в этом случае «1» в качестве нормированной величины); F 0 - интенсивность фона.
  6. Восстановление флуоресценции участка (ось y) в зависимости от времени (по оси x) для генерации кривой FRAP. Затем подгоните данные к одной экспоненциальной функции следующим образом:
    figure-protocol-17854
    ПРИМЕЧАНИЕ. Здесь A представляет собой подвижную фракцию и k - кинетическая константа для подвижной фракции, которая используется для вычисления времени полувыведения до восстановления ( t 1/2 ):
    figure-protocol-18163
  7. Используйте t 1/2 для расчета константы диффузии ( D ):
    figure-protocol-18330
    ПРИМЕЧАНИЕ. Здесь R представляет радиус лазерного луча (13 мкм). Константа диффузии для жидкого бислоя должна быть ≥ 1,0 мкм 2 / с.

8. Обработка данных

ПРИМЕЧАНИЕ. Процедура анализа данных будет зависеть от микроскопа, программного обеспечения для обработки изображений и используемого программного обеспечения для подбора кривой.

  1. Откройте файлы с временной задержкой (начиная с шага 5.17) и после (с шага 6.6), титрируя домен PH. Перейдите к последнему кадру каждого временного файла и выполните сканирование линии по всем микроканалам для получения флуоресценцииВ зависимости от расстояния в пикселях ( рис. 6A ). Перенесите данные в программное обеспечение для работы с электронными таблицами.
  2. Для каждого микроканала (до и после добавления домена PH) проведите несколько данных в канале и по обе стороны канала, представляющего базовую линию ( рисунок 7A ).
    ПРИМЕЧАНИЕ. Интенсивность флуоресценции пустого канала должна оставаться неизменной. Все остальные каналы нормированы на пустой канал, поэтому важно иметь два пустых канала и следить за тем, чтобы их интенсивности флуоресценции оставались согласованными друг с другом.
  3. Примените приведенную ниже формулу, чтобы нормализовать данные на пустой канал; Расчет выборок представлен на рисунке 7B .
    figure-protocol-19875
    ПРИМЕЧАНИЕ. Здесь белок ΔF представляет фокусную вычитаемую интенсивность флуоресценции белкового канала, Δ; F blank представляет фокусную вычитаемую интенсивность флуоресценции пустого канала, pre и post относятся к стадиям титрования до и после белков, а α представляет собой поправочный коэффициент, который представляет собой отношение интенсивностей флуоресценции белкового канала и пустого канала ([ F белок / F бланк ] до ) на стадии предварительного белкового титрования. Поскольку интенсивность флуоресценции уменьшается в зависимости от концентрации домена PH, нормированные данные будут отрицательными по значению.
  4. Используя программное обеспечение для подгонки кривой (см. Таблицу материалов ), нарисуйте нормированную флуоресценцию в зависимости от концентрации домена PH и примените к изотерме Ленгмюра ( рис. 6C ):
    figure-protocol-20959
    ПРИМЕЧАНИЕ. Здесь ΔF представляет собой изменение интенсивности флуоресценции относительно максимального изменения флюоресценцииКогда концентрация насыщения белка присутствует ( ΔF max ), тогда как K d, приложение представляет собой кажущуюся константу диссоциации, которая равна концентрации объемного белка ( [PLC-δ1 PH] ), при которой 50% охвата ( Мембрано-связанный комплекс). Это измерение привязки на основе равновесия, поэтому нормированные данные пригодны для простой изотермы Ленгмюра для извлечения видимого экспериментального параметра K d, приложение . На основе программного обеспечения для установки K d, приложение для взаимодействия PLC-δ1 PH-PI (4,5) P 2 составляет 0,39 ± 0,05 мкМ ( рис. 6B ).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Мы использовали пробу рН модуляции для изучения ПЛК-б1 PH домен-PI (4,5) P 2 взаимодействие в рамках Микроприбор PIP-на-чипе (рисунок 1). По подробному протоколу мы продемонстрировали, как подготовить и собрать компоненты микрожидкостного устройства, изг...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Каждый вариант PIP, хотя и при низких концентрациях, присутствует на цитозольной поверхности конкретных органелл, где они способствуют установлению уникального физического состава и функциональной специфичности органелларной мембраны 1 . Одним из наиболее важных примене?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

DS и CEC были частично поддержаны грантом AI053531 (NIAID, NIH); SS и PSC поддерживались грантом N00014-14-1-0792 (ONR).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Coverslip
Glass Coverslips: RectanglesFisher Scientific12-544B22 x 40 x 0.16 - 0.19 mm, No. 1 1/2; Borosilicate Glass
7X Cleaning SolutionMP Biomedicals976670Detergent
PYREX Crystallizing DishCorning3140-190Borosilicate glass dish with a flat bottom; Diameter x Height (190 x 100 mm); Distributor: VWR (89090-700)
Sentry Xpress 2.0Paragon IndustriesSC-2Kiln
NameCompanyCatalog NumberComments
PDMS
Sylgard 184 Silicone Elastomer KitDow Corning4019862Polydimethylsiloxane (PDMS); Distributor: Ellsworth Adhesives
PYREX DesiccatorVWR89134-402Vacuum Rated
Biopsy punchHarris15110-10Harris Uni-Core; 1.0 mm diameter; Miltex Biopsy Punch with Plunger (Cat. No. 15110-10) can be used as an alternative
NameCompanyCatalog NumberComments
Device
Plasma Cleaning SystemPlasmaEtchPE25-JW2-stage Direct Drive Oil Vacuum Pump, O2 service (Krytox Charged)
Digital Hot PlateBenchmarkH3760-HPurchased through Denville Scientific (Cat. No. 1005640)
Frosted Micro SlidesVWR48312-003Frosted, Selected, and Precleaned; Made of Swiss Glass; Thickness: 1 mm; Dimensions: 75 x 25 mm; GR 144
NameCompanyCatalog NumberComments
Mold
AutoCADAutodeskv.2016Drafting software for the photomask design
PhotomaskCAD/Art ServicesN/ADesign with black background and clear features was printed at 20k dpi resolution on a transparent mask (5 x 7 in) by CAD/Art Services
Silicone WafersUniversity Wafer1575Prime Grade, Single Side Polished; 100 mm (4 inch) Diameter; 525 um Thickness
SU-8 50MicroChem Corp.N/ANegative Tone Photoresist; Penn State Nanofabrication Facility Property
SU-8 DeveloperMicroChem Corp.N/APenn State Nanofabrication Facility Property
NameCompanyCatalog NumberComments
SUV
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholineAvanti Polar Lipids850457CPOPC
L-α-phosphatidylinositol-4-phosphateAvanti Polar Lipids840045XPI4P
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphateAvanti Polar Lipids840046XPI(4,5)P2
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamineAvanti Polar Lipids850757CPOPE; Required for the synthesis of oSRB-POPE
Lissamine Rhodamine B Sulfonyl Chloride (mixed isomers)ThermoFisher ScientificL-20Required for the synthesis of oSRB-POPE
pH Sensitive Fluorescent Lipid Probe (oSRB-POPE)In-houseN/AIn-house Synthesis (Huang D. et al. 2013)
Glass Scintillation VialVWR66022-06520 mL volume capacity
Aquasonic 250DVWRN/AUltrasonic Water Bath
Nuclepore Track-Etched MembranesWhatman110605Polycarbonate Membrane; Diameter: 25 mm; Pore Size: 0.1 um; Distributor: Sigma-Aldrich
ChloroformVWRCX1054-6HPLC grade
LIPEX ExtruderTransferra NanosciencesT.001LIPEX 10 mL Thermobarrel Extruder
Viscotek 802 DLSMalvern InstrumentsN/ADynamic Light Scattering; Penn State X-Ray Crystallography Facility Property
NameCompanyCatalog NumberComments
Data Analysis
GraphPad PrismGraphPad Softwarev.6Curve-fitting software for data analysis
NameCompanyCatalog NumberComments
Microscope
Axiovert 200M Epifluorescence MicroscopeCarl Zeiss MicroscopyN/AMicroscope
AxioCam MRm CameraCarl Zeiss MicroscopyN/ACamera
X-Cite 120Excelitas TechnologiesN/ALight Source
Alexa 568 Filter SetCarl Zeiss MicroscopyN/AEx/Em 576/603 nm
AxioVision LE64 v.4.9.1.0 SoftwareCarl Zeiss MicroscopyN/AImage Processing Software
NameCompanyCatalog NumberComments
Other
TipsVWR10034-132200 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the protein solution into the microfluidic channel
TipsVWR53509-07010 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the vesicle solution into the microfluidic channel
Orion Star A321 pH meterThermo ScientificSTARA3210pH meter
Orion micro pH probeThermo Scientific8220BNWPmicro pH probe
N-(2-Hydroxyethyl)-Piperazine-N'-(2-Ethanesulfonic Acid)VWRVWRB30487HEPES, Free Acid
Sodium ChlorideVWRBDH8014-2.5KGRNaCl
TubingAllied Wire & CableTFT-200-24 NInternal Diameter: 0.020-0.026 inches (0.051-0.066 cm); Wall Thickness: 0.010 inches (0.025 cm); Flexible Polytetrafluoroethylene Thin-Wall Tubing; Natural Color
Nitrogen Gas - IndustrialPraxairN/ALocal Provider
Oxygen Gas - IndustrialPraxairN/ALocal Provider
Liquid NitrogenPraxairN/ALocal Provider

Ссылки

  1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
  2. Shewan, A., Eastburn, D. J., Mostov, K. Phosphoinositides in cell architecture. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (8), a004796(2011).
  3. Picas, L., Gaits-Iacovoni, F., Goud, B. The emerging role of phosphoinositide clustering in intracellular trafficking and signal transduction. F1000Res. 5, (2016).
  4. Lystad, A. H., Simonsen, A. Phosphoinositide-binding proteins in autophagy. FEBS Lett. 590 (15), 2454-2468 (2016).
  5. Balla, T. Phosphoinositides: Tiny lipids with giant impact on cell regulation. Physiol Rev. 93, 1019-1137 (2013).
  6. Lemmon, M. A. Membrane recognition by phospholipid-binding domains. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (2), 99-111 (2008).
  7. Kutateladze, T. G. Translation of the phosphoinositide code by PI effectors. Nat Chem Biol. 6 (7), 507-513 (2010).
  8. Harlan, J. E., Hajduk, P. J., Yoon, H. S., Fesik, S. W. Pleckstrin homology domains bind to phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate. Nature. 371 (6493), 168-170 (1994).
  9. Garcia, P., et al. The pleckstrin homology domain of phospholipase C-delta 1 binds with high affinity to phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in bilayer membranes. Biochemistry. 34 (49), 16228-16234 (1995).
  10. Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O'Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (23), 10472-10476 (1995).
  11. Flesch, F. M., Yu, J. W., Lemmon, M. A., Burger, K. N. Membrane activity of the phospholipase C-delta1 pleckstrin homology (PH) domain. Biochem J. 389, 435-441 (2005).
  12. Narayan, K., Lemmon, M. A. Determining selectivity of phosphoinositide-binding domains. Methods. 39 (2), 122-133 (2006).
  13. Scott, J. L., Musselman, C. A., Adu-Gyamfi, E., Kutateladze, T. G., Stahelin, R. V. Emerging methodologies to investigate lipid-protein interactions. Integr Biol (Camb). 4 (3), 247-258 (2012).
  14. Dowler, S., Currie, R. A., Downes, C. P., Alessi, D. R. DAPP1: A dual adaptor for phosphotyrosine and 3-phosphoinositides. Biochem J. 342, 7-12 (1999).
  15. He, J., et al. Molecular basis of phosphatidylinositol 4-phosphate and ARF1 GTPase recognition by the FAPP1 pleckstrin homology (PH) domain. J Biol Chem. 286 (21), 18650-18657 (2011).
  16. Ceccarelli, D. F., et al. Non-canonical interaction of phosphoinositides with pleckstrin homology domains of Tiam1 and ArhGAP9. J Biol Chem. 282 (18), 13864-13874 (2007).
  17. Huang, S., Gao, L., Blanchoin, L., Staiger, C. J. Heterodimeric capping protein from Arabidopsis is regulated by phosphatidic acid. Mol Biol Cell. 17 (4), 1946-1958 (2006).
  18. Yu, J. W., et al. Genome-eide analysis of membrane targeting by S. cerevisiae pleckstrin homology domains. Mol Cell. 13 (5), 677-688 (2004).
  19. Jung, H., Robison, A. D., Cremer, P. S. Detecting protein-ligand binding on supported bilayers by local pH modulation. J Am Chem Soc. 131 (3), 1006-1014 (2009).
  20. Huang, D., Zhao, T., Xu, W., Yang, T., Cremer, P. S. Sensing small molecule interactions with lipid membranes by local pH modulation. Anal Chem. 85 (21), 10240-10248 (2013).
  21. Saxena, A., et al. Phosphoinositide binding by the pleckstrin homology domains of Ipl and Tih1. J Biol Chem. 277 (51), 49935-49944 (2002).
  22. Knödler, A., Mayinger, P. Analysis of phosphoinositide-binding proteins using liposomes as an affinity matrix. Biotechniques. 38 (6), 858-862 (2005).
  23. Baumann, M. K., Swann, M. J., Textor, M., Reimhult, E. Pleckstrin homology-phospholipase C-delta1 interaction with phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate containing supported lipid bilayers monitored in situ with dual polarization interferometry. Anal Chem. 83 (16), 6267-6274 (2011).
  24. Saliba, A. E., et al. A quantitative liposome microarray to systematically characterize protein-lipid interactions. Nat Methods. 11 (1), 47-50 (2014).
  25. Arauz, E., Aggarwal, V., Jain, A., Ha, T., Chen, J. Single-molecule analysis of lipid-protein interactions in crude cell lysates. Anal Chem. 88 (8), 4269-4276 (2016).
  26. Best, Q. A., Xu, R., McCarroll, M. E., Wang, L., Dyer, D. J. Design and investigation of a series of rhodamine-based fluorescent probes for optical measurements of pH. Org Lett. 12 (14), 3219-3221 (2010).
  27. Lee, J., Choi, K. H., Yoo, K. Innovative SU-8 lithography techniques and their applications. Micromachines. 6 (1), 1-18 (2014).
  28. Poyton, M. F., Sendecki, A. M., Cong, X., Cremer, P. S. Cu(2+) binds to phosphatidylethanolamine and increases oxidation in lipid membranes. J Am Chem Soc. 138 (5), 1584-1590 (2016).
  29. Karasek, P., Grym, J., Roth, M., Planeta, J., Foret, F. Etching of glass microchips with supercritical water. Lab Chip. 15 (1), 311-318 (2015).
  30. Thomas, M. S., et al. Print-and-peel fabrication for microfluidics: what's in it for biomedical applications? Ann Biomed Eng. 38 (1), 21-32 (2010).
  31. Waheed, S., et al. 3D printed microfluidic devices: enablers and barriers. Lab Chip. 16 (11), 1993-2013 (2016).
  32. Axmann, M., Schutz, G. J., Huppa, J. B. Single molecule fluorescence microscopy on planar supported bilayers. J Vis Exp. (105), e53158(2015).
  33. Barenholz, Y., et al. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. Biochemistry. 16 (12), 2806-2810 (1977).
  34. Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surface Science Reports. 61 (10), 429-444 (2006).
  35. Hamai, C., Yang, T., Kataoka, S., Cremer, P. S., Musser, S. M. Effect of average phospholipid curvature on supported bilayer formation on glass by vesicle fusion. Biophys J. 90 (4), 1241-1248 (2006).
  36. Tero, R. Substrate effects on the formation process, structure and physicochemical properties of supported lipid bilayers. Materials. 5 (12), 2658-2680 (2012).
  37. Ferguson, K. M., Lemmon, M. A., Schlessinger, J., Sigler, P. B. Structure of the high affinity complex of inositol trisphosphate with a phospholipase C pleckstrin homology domain. Cell. 83 (6), 1037-1046 (1995).
  38. Simonsson, L., Hook, F. Formation and diffusivity characterization of supported lipid bilayers with complex lipid compositions. Langmuir. 28 (28), 10528-10533 (2012).
  39. Cong, X., Poyton, M. F., Baxter, A. J., Pullanchery, S., Cremer, P. S. Unquenchable surface potential dramatically enhances Cu(2+) binding to phosphatidylserine lipids. J Am Chem Soc. 137 (24), 7785-7792 (2015).
  40. Robison, A. D., et al. Polyarginine interacts more strongly and cooperatively than polylysine with phospholipid bilayers. J Phys Chem B. 120 (35), 9287-9296 (2016).
  41. Robison, A. D., Huang, D., Jung, H., Cremer, P. S. Fluorescence modulation sensing of positively and negatively charged proteins on lipid bilayers. Biointerphases. 8 (1), 1(2013).
  42. Tabaei, S. R., et al. Formation of cholesterol-rich supported membranes using solvent-assisted lipid self-assembly. Langmuir. 30 (44), 13345-13352 (2014).
  43. Johnson, S. J., et al. Structure of an adsorbed dimyristoylphosphatidylcholine bilayer measured with specular reflection of neutrons. Biophys J. 59 (2), 289-294 (1991).
  44. Koenig, B. W., et al. Neutron reflectivity and atomic force microscopy studies of a lipid bilayer in water adsorbed to the surface of a silicon single crystal. Langmuir. 12 (5), 1343-1350 (1996).
  45. Tanaka, M., Sackmann, E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface. Nature. 437 (7059), 656-663 (2005).
  46. Renner, L., et al. Supported lipid bilayers on spacious and pH-responsive polymer cushions with varied hydrophilicity. J Phys Chem B. 112 (20), 6373-6378 (2008).
  47. Wagner, M. L., Tamm, L. K. Tethered polymer-supported planar lipid bilayers for reconstitution of integral membrane proteins: Silane-polyethyleneglycol-lipid as a cushion and covalent linker. Biophys J. 79 (3), 1400-1414 (2000).
  48. Pace, H., et al. Preserved transmembrane protein mobility in polymer-supported lipid bilayers derived from cell membranes. Anal Chem. 87 (18), 9194-9203 (2015).
  49. Braunger, J. A., Kramer, C., Morick, D., Steinem, C. Solid supported membranes doped with PIP2: Influence of ionic strength and pH on bilayer formation and membrane organization. Langmuir. 29 (46), 14204-14213 (2013).
  50. Paridon, P. A., de Kruijff, B., Ouwerkerk, R., Wirtz, K. W. Polyphosphoinositides undergo charge neutralization in the physiological pH range: A 31P-NMR study. Biochim Biophys Acta. 877 (1), 216-219 (1986).
  51. Liu, C., Huang, D., Yang, T., Cremer, P. S. Monitoring phosphatidic acid formation in intact phosphatidylcholine bilayers upon phospholipase D catalysis. Anal Chem. 86 (3), 1753-1759 (2014).
  52. Saad, J. S., et al. Structural basis for targeting HIV-1 Gag proteins to the plasma membrane for virus assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11364-11369 (2006).
  53. Hsu, N. Y., et al. Viral reorganization of the secretory pathway generates distinct organelles for RNA replication. Cell. 141 (5), 799-811 (2010).
  54. Del Campo, C. M., et al. Structural basis for PI(4)P-specific membrane recruitment of the Legionella pneumophila effector DrrA/SidM. Structure. 22 (3), 397-408 (2014).
  55. Kolli, S., et al. Structure-function analysis of vaccinia virus H7 protein reveals a novel phosphoinositide binding fold essential for poxvirus replication. J Virol. 89 (4), 2209-2219 (2015).
  56. Cho, N. J., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate is an HCV NS5A ligand and mediates replication of the viral genome. Gastroenterology. 148 (3), 616-625 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

125PleckstrinPHpH45PI 45 P 2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены