Десенсибилизация и восстановление фоторецепторов раков после доставки легкого стимула

Резюме

Представлен протокол для изучения десенсибилизации и восстановления чувствительности фоторецепторов раков в качестве функции циркадного времени.

Аннотация

Представлен метод изучения десенсибилизации и восстановления фоторецепторов раков. Мы провели внутриклеточные электрические записи фоторецепторных клеток в изолированных глазах с использованием прерывистой конфигурации с одноэлектрическим переключенным напряжением-зажимом. Во-первых, с лезвием бритвы мы сделали отверстие в донской роговицы, чтобы получить доступ к сетчатке. После этого мы вставили стеклянный электрод через отверстие, и проникли в клетку, как сообщается в записи отрицательного потенциала. Мембранный потенциал был зажат на потенциале отдыха фоторецептора и свет-пульс был применен для активации токов. Наконец, для измерения текущей десенсибилизации и восстановления использовался два протокола о вспышках света. Первая световая вспышка запускает после периода задержки трансдукционный ионный ток, который после достижения пика амплитуды распадается к десенсибилизированному состоянию; вторая вспышка, применяемая с разной временной интервалами, оценивает состояние свето-активированной проводимости. Для характеристики светосвязанного тока были измерены три параметра: 1) задержка (время, прошедшее между доставкой вспышки света и моментом, когда ток достигает 10% от его максимального значения); 2) пикового тока; и 3) константа времени десенсибилизации (экспоненциальная константа времени текущей фазы распада). На все параметры влияет первый импульс.

Для количественной оценки восстановления после десенсибилизации использовалось соотношение p2/p1 по сравнению со временем между импульсами. p1 — это пиковое ток, вызываемый первым световым импульсом, а p2 — пиковым током, вызванным вторым импульсом. Эти данные были приспособлены к сумме экспоненциальных функций. Наконец, эти измерения были проведены в качестве функции циркадного времени.

Введение

Для того, чтобы восприниматься как визуальный стимул, свет, достигающий глаз, должен быть преобразован в электрический сигнал. Следовательно, во всех зрительных организмах свет вызывает трансдукционный ионный ток, который, в свою очередь, производит изменение мембранного потенциала фоторецепторных клеток, так называемого рецепторного потенциала. Из-за этого светочувствительность глаза в первую очередь зависит от состояния светоактивированной проводимости, которая может быть либо доступна для активации, либо десенсибилизирована.

В фоторецепторах раков свет вызывает медленный, переходный, ионный ток¹. При освещении трансдукционный ток возникает после задержки или задержки до достижения своего максимума; после этого он распадается, так как каналы трансдукции попадают в десенсибилизированное состояние, в котором они не реагируют на дальнейший свет стимул². То есть, свет, в дополнение к активации трансдукционного тока, отвечающего за зрение, также вызывает переходное декременцию чувствительности фоторецепторных клеток. Десенсибилизация может представлять собой общий защитный механизм против чрезмерного воздействия адекватного стимула. Чувствительность глаза к свету восстанавливается по мере восстановления трансдукции после десенсибилизации.

Внутриклеточная запись является полезным методом измерения электрической активности возбудимых клеток^3,4,5,6,7. Хотя внутриклеточная запись стала менее частой с появлением патч-зажима техники^9,это все еще удобный подход, когда клетки либо трудно изолировать, или представить геометрию, что делает формирование патч-зажимных гига-уплотнений трудно(т.е.,уплотнения или плотные контакты между патч электрод и мембраны с электрическим сопротивлением порядка 10^ohms). Примерами последних являются сперматозоиды¹⁰ и изученные фоторецепторные клетки. По нашему опыту, фоторецепторы Procambarus clarkii трудно изолировать и сохранить в первичной культуре; кроме того, они являются тонкими стержнями, которые делают гига-печать формирования трудно достичь. Во внутриклеточных записях острый электрод превращается в клетку, которая удерживается на месте окружающими тканями. Электрод рубится высокоскоростной схемой переключения усилителя, поэтому ток пробирается между импульсами напряжения. Этот режим известен как прерывистый зажим одноэлектронного напряжения (режим dSEVC)¹¹. Высокое сопротивление (небольшое отверстие) электрода препятствует диффузионному обмену между клеткой и растворами пипетки, что дает минимальное нарушение внутриклеточной среды^3. Потенциальным недостатком этого метода является то, что вставка электрода может привести к неселективному току утечки; поэтому необходимо проявлять осторожность, чтобы избежать записи из клеток, где размер тока утечки может помешать предполагаемым измерениям^4,12.

В этом случае мы используем изолированные глаза раков для оценки десенсибилизации и восстановления светоактивной ионной проводимости путем выполнения внутриклеточных электрических записей фоторецепторных клеток в условиях зажима напряжения.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты соответствуют законам защиты животных Мексики.

1. Экспериментальная настройка

1. Общие соединения
   1. Подключите усилитель к подходящему компьютеру с помощью аналогового цифрового конвертера и используйте осциллоскоп для мониторинга эксперимента(рисунок 1).
   2. Подключите фототимилиатор к преобразованию A/D.
2. Камера звукозаписи
   1. Поместите камеру звукозаписи на столе против вибрации и найдите его в клетке Фарадея.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это предотвращает механическую вибрацию и электрический шум, который может повлиять на запись. Наша клетка Фарадея была сделана из затемненной проволочного сетки. Используется самодельная, 2 мл, акриловая камера записи(рисунок 2).
   2. Подготовьте решение ванны для того чтобы держать подготовку^{живой 13}: 205 mM NaCl; 5 мМ KCl; 2 мМ MgSO₄; 13 mM CaCl₂; 5 мМ Хепес-НаОХ, рН 7,3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Решение не включает декстрозу или любой пузырьков на 95% O₂, 5% CO₂ смеси, потому что экспериментальная процедура достаточно коротка, чтобы обнаружить повреждения электрической записи (см. шаг 4.2.3 для полноты).
3. Электроды
   1. Используйте электрод из серебристого провода с хлоридом в качестве эталонного электрода
      ПРИМЕЧАНИЕ: Серебряное хлоридовое покрытие необходимо для того, чтобы электродная реакция: AgCl (ы) и e^↔Ag (ы) и Cl^-.
   2. Песок серебряной проволоки (толстость 1 мм, длина 10 см) с тонкой бумагой эмери для очистки его поверхности.
   3. Промыть серебряную проволоку дистиллированной водой.
   4. Погрузите чистую серебряную проволоку в раствор гипохлорит натрия 4-6% (NaClO) до тех пор, пока он не окажется темным (примерно 20 мин).
   5. Используйте тонкие стеклянные пипетки, наполненные раствором электролита (2,7 М КЛ) в качестве внутриклеточного электрода.
   6. Потяните стеклянную капиллярную трубку (внутренний диаметр 1 мм) с помощью выдвиженца микропипетты, чтобы получить тонкий наконечник с небольшим отверстием (0,01-0,1 мкм)¹⁴.
   7. Заполните вытянутое капиллярное стекло раствором 2,7 м KCl. Сначала заполните его капиллярностью (погрузите кончик пипетки в раствор 2,7 М KCl), а затем заполните половину пипетки тонкой иглой для инъекций. При необходимости коснитесь электродной пипетки, чтобы устранить пузырьки воздуха.
   8. Подключите электрод к его держателю. Подключите держатель к головной укладу усилителя с усилителем. Расположите электрод-держатель-головной убор со стабильным 3-D микроманипулятором. Опустите электрод до тех пор, пока раствор ванны не покроет свой кончик.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Электрод должен иметь вертикальную ориентацию
4. Выберите режим усилителя моста (в разделе режима усилителя, нажмите кнопку Моста) и измерьте сопротивление электрода. Убедитесь, что сопротивление составляет около 50 МЗ¹¹.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот размер электрода позволяет хорошее качество электрической записи с ограниченным повреждением ячейки.
5. Снизовать офсетный ток и компенсировать емкостные переходные с помощью кнопки Удержания позиции в разделе Зажим напряжения усилителя и кнопки нейтрализации емкостя в микроэлектроде 1 секции усилителя.
6. Система суперфузии
   1. Налейте раствор ванны (шаг 1.2.2) в подходящий сосуд (бутылка сыворотки 250 мл) и соедините его с набором оросительных труб (3,2 мм внутреннего диаметра), тем самым соединяя камеру звукозаписи. Используйте гравитационную систему сверхфузива. Регулируйте скорость потока до 0,5 мл/с.
   2. Подключите камеру к всасывающему устройству. Регулируйте систему всасывания раствора таким образом, чтобы общий объем камеры звукозаписи не меняться. Используйте вакуумный насос для всасывания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Постоянный объем в камере записи имеет важное значение для поддержания конденсаций на протяжении всего эксперимента.

2. Биологический материал

Примечание: Используйте взрослых раков P. clarkii (7-10 см в длину) в стадии интермольты невнятного секса.

1. Circadian время
   1. За месяц до экспериментов, поддерживать 100 раков под 12-h свет / 12-h темный цикл¹⁵ (белый свет, 2,4 кВт /м²).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Один месяц достаточно времени, чтобы синхронизировать популяцию раков.
   2. Определить циркадное время популяции раков путем оценки амплитуды электроретинограмм пяти случайно выбранных животных^15.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 0 ч циркадного времени (CT 0) указывает на начало субъективного дня, т.е.время, в течение которого организм обычно активен^16,17,18,19 (Рисунок 3). Раки ночных животных, так что под 12-h свет / 12-h темный цикл, он активен во время темной фазы.
2. Процедура изоляции глаз
   1. В нужное циркадное время, анестезируйте выбранных раков путем погружения в водопроводную воду при 0-4 градусах по Цельсию, в течение 15 мин.
   2. С помощью тонкого ножница, отсоедините глазной стебель от основания.
   3. Доступ к сетчатке с помощью лезвия бритвы, чтобы сделать отверстие (1 мм²) в области роговицы.
   4. Поместите глазной стебель в центре камеры записи (отверстие, покрытое силиконом) с отверстием доступа к сетчатке в верхней части камеры.
3. Держите глазной talk в постоянной темноте в течение 20 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 20 мин достаточно времени для фоторецептора клетки, чтобы быть полностью темной адаптированы.

3. Фоторецептор Impaling

1. Поставьте микроэлектрод и продольную ось глаз нойся параллель таким образом, чтобы микроэлектрод был сосредоточен для доступа к сетчатке. Используйте стереоскопический микроскоп (10X) для размещения устройств в правильной конфигурации.
2. Отслеживайте разницу напряжения между эталонными и записывающими электродами, выбрав режим моста¹¹ усилителя.
3. Опустите электрод в ванну, а затем поместите его прямо над сетчаткой.
4. Отойдите от микроскопа и расположите лампу фототимулятора параллельно продольной оси глаза.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Расстояние между лампой и камерой излжания составляет около 15 см.
5. Медленно опустите микроэлектрод до тех пор, пока не будет обнаружено внезапное падение напряжения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Падение напряжения около 50 мВ указывает на прокол здоровой фоторецепторной клетки.
6. Для записи потенциала рецептора фоторецептора (белый свет, 7,2 кВт/м 2,00) выполнит тест-вспышку света.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Потенциал рецептора фоторецептора является деполяризующим потенциалом амплитуды 10-15 мВ и продолжительности 300 мс(рисунок 4).

4. Электрическая запись

1. Убедитесь, что фоторецепторные клетки полностью адаптированы к темным условиям (см. шаг 2.3).
   1. Доставьте вспышку тестового света каждые 2 минуты. Автоматите время между вспышками, выбрав адекватное значение (120 с) "времени между эпизодами" в программном обеспечении для сбора данных.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 2 мин является необходимым временем, чтобы обеспечить полное восстановление токов, лежащих в основе электрического ответа фоторецептора.
   2. Мониторинг потенциала покоя мембраны, а также амплитуды и продолжительности потенциала рецептора. Предположим, что фоторецептор полностью адаптируется после того, как мембранный потенциал, амплитуда, и продолжительность потенциала рецептора остаются неизменными. Eyestalks ранее держали в постоянной темноте в течение 20 минут (шаг 2.3) завершить их адаптации примерно в 5 минут.
   3. Прекратите стимулировать клетку 2 мин перед записью свето-илированного тока.
2. Текущая запись
   1. Зажим напряжения на измеренной мембраны отдыха потенциальной стоимости клетки, выбрав "Холдинг амплитуда" в программном обеспечении для сбора данных (в Waveform на разделе Analog Выходного канала).
   2. Выберите режим усилителя dSEVC. В разделе Режим усилителя выберите кнопку SEVC и переключите рычаг на позицию Discont SEVC.
   3. Установите скорость переключения до 500-1000 Гц (с помощью кнопки настройки скорости усилителя), определяемой скоростью электрода^11.
   4. Доставьте световую вспышку и наблюдайте за вызванным притоком ионов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это светосвязанный или трансдукционный ток(рисунок 5).
   5. Вернуться в режим моста на усилителе и записать потенциал рецептора, отправив световую вспышку (см. раздел 3). Убедитесь, что фоторецепторная клетка полностью адаптирована к темным условиям. Измерьте потенциальные характеристики рецепторов (амплитуду и продолжительность) и сравните с первыми измерениями. Предположим, что проколотная фоторецепторная клетка является здоровой клеткой, если они имеют те же характеристики.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После абляции глазной лакли, биологическая подготовка жизнеспособна в течение следующих 2 ч.
3. Два импульсных протокола: Измерьте восстановление после десенсибилизации с помощью протокола с двумя световыми вспышками.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол двух световых флэш-накопителей похож на стандартный двухимпульсный протокол напряжения, используемый для измерения восстановления после инактивации каналов напряжения^20. Первая световая вспышка вызывает временное изменение чувствительности фоторецепторной клетки, а вторая вспышка оценивает состояние свето-активированной проводимости.
   1. Доставьте пару световых импульсов. Нанесите вторую вспышку после желаемого интервала времени (от 300 мс до 2 мин).
   2. Оцифровка токов при выборке 10 КГц с помощью программного обеспечения для сбора данных и сохранение данных для автономного анализа¹¹.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Таблица со значениями конфигурации программного обеспечения включена в качестве дополнительного материала.

5. Анализ данных

1. Кинетика свето-вызываемого тока
   1. Измерьте три текущих параметра: задержка активации L, время, прошедшее от доставки световой вспышки, до достижения током 10% от его максимальной амплитуды(рисунок 5); пик овперная или максимальная амплитуда тока I_p; и десенсибилизации время постоянной T. Измерьте время десенсибилизации постоянной (я) путем установки текущей фазы распада на:
      
      где, А -I (t'0) является положительнойпостоянной (рисунок 5).
2. Десенсибилизация и восстановление
   Примечание: Восстановление от десенсибилизации оценивалось как соотношение p_2/p1, где p₁ является соответствующим параметром (или L, I_p,или T) элемента управления тока, а p₂ является соответствующим параметром второго тест-тока.
   1. Участок p₂/p₁ (или L, i_p,или T) как функция времени между импульсами.
   2. В зависимости от параметра, подходят точки каждого участка:
      
      или:
      
   3. Используйте соответствующий статистический тест для определения количества экспоненциальных терминов, необходимых для соответствия экспериментальным данным.

Результаты

Во-первых, получается представительный рецепторный потенциал фоторецепторных клеток раков(рисунок 4). После этого, испытание световой вспышки был применен для запуска светтрансатов тока(рисунок 5). Катионный трансдукционный ток

Обсуждение

Раки оказались отличной моделью из-за своей способности выживать в неестественных условиях. Существует легкий доступ к in vivo и in vitro электрофизиологических анализов. Кроме того, ракообразные являются благоприятной группой для нейробиологических исследований в области сравни...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axoclamp2A	Axon Instruments Inc		Amplifier
Digidata 1200 Interface	Axon Instruments Inc		Digitizer
Oscilloscope TDS430A	Tektronix		Analogic Oscilloscope
Photostimulator PS33 Plus	Grass		Lamp
Puller PC-100	Narishige		Micropipette Puller
Puller P-97	Sutter Instruments		Micropipette Puller
Glass Capillary Tube Kimax-51	Kimble Products	34502	0.8, 1.10, 100 mm
HS-2 Headstage	Axon Instruments Inc		Headstage
Micromanipulator MX-4	Narishige		Mechanical Micromanipulator
Stereoscopic Microscope	Zeiss		Microscope
pClamp	Axon Instruments Inc		Data acquisition software for digidata 1200 interface
Clampfit	Axon Instruments, Inc		Analysis software linked to pClamp
Origin	OriginLab Corp.		Data analysis and graphing software
Sodium Chloride	Sigma	S7653	>99.5%
Potassium Chloride	Sigma	P-9333	Minimum 99%
Magnesium Sulfate	Sigma	M7506	Minimum 99.5%
Calcium Chloride	Sigma	C5080	Minimum 99.0%
Hepes	Sigma	H7523	>99.5%
Sodium Hydroxide	Sigma	S8045	98.00%
Sodium hypochlorite solution	Sigma	425044	Available chlorine, 10-15%