JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Метод определения проницаемости мембраны вставить системы для нескольких хорошо пластин и представлены в silico оптимизации параметра для расчета коэффициентов диффузии с помощью моделирования.

Аннотация

В vitro культивируемых кожи модели становятся все более актуальной для фармацевтических и косметических приложений и также используются в разработке лекарств, а также вещество тестирования. Эти модели основном культивируется в мембраны Вставка систем, их проницаемости к различных веществ, будучи важным фактором. Как правило применяются методы для определения этих параметров обычно требуют большой выборки (например, Франц диффузии клеток) или трудоемкий оборудования (например, восстановление флуоресценции после Фотообесцвечивание (FRAP)). Это исследование представляет метод определения коэффициентов проницаемости непосредственно в системах мембраны вставка с размерами диаметра 4.26 и 12,2 мм (зона культивирования). Метод был проверен с коллагеновые Гели агарозы и коллагена клеток модели, представляющие модели кожи. Процесс проникновения веществ с различных молекулярных размеров и проникновение через модели различных клеток (состоящие из коллагена гель, фибробластов и HaCaT) были точно описано.

Кроме того для поддержки выше экспериментальный метод, моделирования была создана. До моделирования вписывается экспериментальных данных хорошо для веществ с малого молекулярного размера, чтобы радиус Стокса м 14 x 10-10 (4000 МВт), и поэтому является многообещающим инструментом для описания системы. Кроме того моделирование может значительно снизить количество экспериментальных работ и достаточно прочным, чтобы быть продлен или адаптированы к более сложных установок.

Введение

Органо типичный 3D культур стали мощные инструменты для разработки лекарственных средств и тестирование1вещество. В этой связи модели кожи человека представляют особый интерес из-за нормативных требований, таких, как те в косметической промышленности. Впоследствии они привели к разработке многочисленных моделей 3D кожи, для использования либо на их собственных как сингл орган культур в нескольких хорошо пластины или multi organ-чипов в сочетании с дополнительного органа модели, например, в печени2.

Что касается культивирования эквивалента кожи жидкость воздуха интерфейс (Али) является важным элементом для надлежащего эпидермальный дифференциация3. Клетки культуры вставки состоит из сосуд с жидкостью проницаемой мембраны в нижней части обычно используются для создания Али. ALIs широко используются в коммерчески доступных кожи модели например ростковой4,5Phenion и Episkin6, для культуры кожи модели с размерами от 96-луночных (4.26 мм в диаметре) до 12-хорошо (12,2 мм в диаметре) пластин. Метод, описанный здесь определяет проникновение веществ в системе вставки мембраны.

Коэффициент проницаемости является значительным параметром для оценки качества любого искусственного кожи модели по сравнению с родной кожи5и используется для оценки как быстро активные вещества мигрируют через кожу. Особенно если наркотики или косметика продукты должны быть применены к коже, этот параметр необходимо понять, когда точно активные агенты проходят через него. Моделирование далее может помочь предсказать поведение системы и впоследствии уменьшить необходимые времени экспериментальных усилий, особенно когда большой набор веществ участвует.

Франц диффузии ячейка является состояние искусства для проникновения эксперименты с кожи и кожи модели5,6,,78,9. Это устройство состоит из двух отсеков с фиксированной выборки (диффузионным барьером) между ними. Вещества для проверки применяется непосредственно к верхней части образца (доноров отсека) и концентрация блестящее соединения могут быть обнаружены на противоположный отсек (акцептор). На акцепторной стороне постоянная температура и концентрация однородных веществ обеспечивается через температуры камеры и магнитной мешалкой. Образцы могут быть взяты из выборки руку на акцепторной стороне ячейки, Франц. Высота составляет 19 см и 179 см эта система является относительно большой10,11. Другой метод для определения коэффициентов диффузии в гель подобных веществ и тканях это FRAP. Этот метод использует принцип отбеливания дневно помечены частиц в гель и затем определения времени восстановления области отбеленной для расчета диффузии коэффициент12,,1314.

Кроме того преобразование Фурье ИК (FTIR) спектроскопия может использоваться для обнаружения движения частиц с инфракрасного света поглощения для того, чтобы определить процесс проникновения веществ в кожу15,16. Однако эти или другие тепловизионные методы (например, спектроскопии корреляции двух Фотон флуоресценции17) нужно стоимость интенсивных инструментов.

В этой статье представлен метод для прямого измерения проницаемости барьер в системе вставки мембраны, где модель кожи может культивироваться. Этот метод позволяет проницаемость экспериментов, чтобы работать с большим количеством малых выборок (ну размер до 4,26 мм) в компактной системе. Это в отличие от Франц диффузии ячейки, где отдельное устройство необходима для каждого зонда, который должен быть установлен на устройстве и трудно реализовать для малых выборок (размер 4.26 мм). Кроме того так как метод не требует крупных инструментария (например, multiphoton или конфокального микроскопа), достигается сокращение времени и стоимости.

Все эксперименты проводились в микропористая мембрана вставить систем с образцом (барьер), состоящий из геля агарозы или коллагена ячеечная модель создана на мембране. Флуоресцентные вещества (донор) с различной молекулярной размеры были применены к верхней части образца, и концентрация пронизаны вещества было обнаружено на дне (акцептор) с помощью читатель флуоресценции пластины (см. Рисунок 1). Чтобы проверить метод и проверить точность этого моделирования, Гели агарозы были произведены и используется как барьер. Гидрогели обычно используются для исследования процессов диффузии и проникновение в пористой среде в биологических наук13. Этот метод затем был испытан в клетки посеян система, состоящая из коллагеновой матрицы первичных фибробластов и взрослых низкой кальция высокой температуры кератиноциты (HaCaT) клеток человека (ячейка матричная модель), которая является упрощенной кожи модель18,19 .

Кроме того процесс проникновения был смоделирован с помощью моделирования потока с вычислительной гидродинамики. Было установлено, что, путем оптимизации параметров, может быть рассчитан коэффициент диффузии из экспериментальных данных. В общем это моделирование предлагает различные приложения; Например можно предсказать пропитывание процесс, основанный на коротких экспериментов и моделирование может значительно уменьшить количество экспериментов.

Экспериментальный метод и моделирования были разработаны для применения в орган на чипе системы1,20,21, специально 2-орган чип (2-OC) разработали коммерчески1,22, 23,24,25. В принципе можно описать процесс проникновения любой орган модели на основе мембранных систем Вставка таким образом.

протокол

1. Подготовка образца для исследования проницаемости

Примечание: Для того, чтобы проверить пропитывание измерений и моделирования, выборки, состоящей из геля агарозы или ячейки матрицы модели, основанной на выращивании кожи модели был использован.

  1. Гель агарозы
    1. Растворите 0,2 г порошка агарозы высоким разрешением в 10 мл H2O (двойной дистиллированной воды).
    2. Mix решение и нагреть ее до 80 ° C. Поддерживать температуру на 8 мин.
    3. Применение геля агарозы 28.6 мкл на мембраны мембраны 96-луночных вставка системы (4.26 мм в диаметре) или использование 226 мкл для 12 хорошо мембраны вставить системы (12 мм в диаметре) (например, Transwell системы).
    4. Подождите 10 минут, пока гель затвердевает.
  2. Коллаген гель
    Примечание: Все шаги выполняются в стерильных условиях и решения хранятся на льду замедлить полимеризации гель коллагена.
    1. Mix 125 µL из Hanks сбалансированный соли раствора (HBSS) с 1 мл раствора коллагена R 0,4% (крысиный хвост коллаген).
    2. Титруйте решение с 1 M NaOH (гидроксид натрия) (~ 6 мкл) до цвет фенола Красного изменяется от желтого до красного.
    3. Мкл 125 Дульбекко изменение средних орла (DMEM) + 10% плода телячьей сыворотки (FCS) гель коллагена и тщательно перемешать с кончиком пипетки.
    4. Применить 28.6 мкл гель коллагена мембраны мембраны 96-луночных вставка системы или 226 мкл для вставки системы 12-ну мембраны.
    5. Гель в инкубатор (37 ° C, 5% CO2) оставьте на 30 мин.
  3. Коллаген ячеечная модель с фибробластов
    Примечание: Все шаги выполняются в стерильных условиях.
    1. Подготовка первичного фибробластов 5-7 дней до эксперимента. Культивировать фибробластов с DMEM + 10% FCS в колбах, культуры клеток (275 см) и изменить носитель каждые 2-3 дня.
      Примечание: В зависимости от экспериментальной установки, может использоваться большее количество клеток.
    2. Удалите носитель из колбы культуры клеток (80% притока) и мыть дважды с 10 мл (культура флакон 75 см2)-фосфатный буфер (PBS). Добавить 3 мл 0,05% трипсина / Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) и Инкубируйте 3 мин при 37 ° C.
    3. Осторожно нажмите на культуру Фляга для отсоединения клетки с поверхности. Остановите реакции, добавив 3 мл DMEM + 10% FCS. Передача решения в пластиковых пробирок.
    4. Суспензию клеток на 120 x g центрифуги, удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки с 0,5 мл DMEM + 10% FCS.
    5. Подсчитать количество ячеек и приспособиться к концентрации 0,5 х 106 клеток/мл.
      Примечание: Следующие шаги выполняются на льду замедлить полимеризации гель коллагена.
    6. Mix 125 мкл HBSS с 1 мл раствора коллагена R 0,4%.
    7. Титруйте решение с 1 M NaOH (~ 6 мкл) до тех пор, пока цвет фенола Красного изменяется с желтого на красный.
    8. 125 мкл суспензии клеток (DMEM FCS 10% + 0,5 х 106 клеток/мл) в коллагена гель и тщательно перемешать с пипеткой.
    9. Примените 28.6 мкл гель коллагена на мембраны мембраны 96-луночных вставка системы или 226 мкл для вставки системы 12-ну мембраны.
    10. Гель в инкубатор (37 ° C, 5% CO2) оставьте на 30 мин.
    11. Применить 75 мкл DMEM + 10% FCS на поверхности геля и 300 мкл для приемника пластина мембраны 96-луночных вставить системы. Для 12-ну мембраны вставить системы, использовать объем 590 мкл для поверхности и 1846 мкл для приемника плиты.
    12. Удалите средство от поверхности клеток матрицы модели (эрлифта) и инкубации клеток матрицы модели далее для 7 дней. Использование 100 мкл среднего в нижней и средней каждый день.
  4. Коллаген ячеечная модель с HaCaT
    Примечание: Все шаги выполняются в стерильных условиях.
    1. Подготовка HaCaT 5-7 дней до следующие шаги. Культивировать HaCaT с DMEM + 5% FCS в колбе культуры клеток (75 мм2) и изменить носитель каждые 2-3 дня.
      Примечание: В зависимости от экспериментальной установки, может использоваться большее количество клеток.
    2. Удалите носитель из колбы и мыть дважды с 10 мл (культура флакон 75 см2) PBS. Добавить 3 мл 0,05% трипсина/ЭДТА и инкубировать в течение 10 минут при 37 ° C. Остановите реакции с 3 мл DMEM + 10% FCS. Передача решения в пластиковых пробирок.
    3. Суспензию клеток на 120 x g центрифуги, удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки с 0,5 мл DMEM + 10% FCS.
    4. Подсчитать количество ячеек и приспособиться к концентрации 0,5 х 106 клеток/мл.
      Примечание: Следующие шаги выполняются на льду замедлить полимеризации гель коллагена.
    5. Mix 125 мкл HBSS с 1 мл раствора коллагена R 0,4%.
    6. Титруйте решение с 1 M NaOH (~ 6 мкл) до тех пор, пока цвет фенола Красного изменяется с желтого на красный.
    7. Мкл 125 DMEM + 10% FCS гель коллагена и тщательно смешайте его с пипеткой.
    8. Примените 28.6 мкл суспензии клеток на мембраны мембраны 96-луночных вставка системы или 226 мкл для вставки системы 12-ну мембраны.
    9. Гель в инкубатор (37 ° C, 5% CO2) оставьте на 30 мин.
    10. Применить 75 мкл суспензии клеток на поверхности геля и добавить 300 мкл DMEM + 10% FCS для приемника пластина мембраны 96-луночных вставить системы. Для 12-ну мембраны вставить системы, использовать объем 590 мкл суспензии клеток для поверхности и 1846 мкл DMEM + 10% FCS для приемника плиты.
    11. Инкубации клеток матрицы модели для 3 дней; Обмен среды после 2 дней.
    12. Удалите средство от поверхности клеток матрицы модели и инкубации клеток матрицы модели для дальнейшего 7 дней. Использование 100 мкл среднего на нижней и средней каждый день.
  5. Коллаген ячеечная модель с фибробластов и HaCaT
    Примечание: Все шаги выполняются в стерильных условиях на льду замедлить полимеризации гель коллагена. Подготовьте фибробласты, как описано в шаге 1.3 до шага 1.3.5 и подготовить день, позже HaCaT, как описано в разделе Шаг 1.4 до шага 1.4.4.
    1. Mix 125 мкл HBSS в 1 мл раствора коллагена R 0,4%.
    2. Нейтрализовать решение с 1 M NaOH (~ 6 мкл) до тех пор, пока цвет фенола Красного изменяется от желтого до красно-фиолетовая.
    3. 125 мкл суспензии клеток первичных фибробластов, состоящий из DMEM + 10% FCS + 0,5 х 106 клеток/мл до коллаген гель и тщательно перемешать.
    4. Применить 28.6 мкл суспензии клеток к мембране 96-луночных мембраны вставка системы или 226 мкл для вставки системы 12-ну мембраны.
    5. Гель в инкубатор (37 ° C, 5% CO2) оставьте на 30 мин.
    6. Далее применяются 75 мкл DMEM + 10% FCS на поверхности геля и 300 мкл на пластину приемник системы Вставка 96-луночных мембраны. Для 12-ну мембраны вставить системы, объем 590 мкл используется для поверхности и 1846 мкл для приемника плиты.
    7. Инкубируйте 1 день при 37 ° C и 5% CO2.
    8. Удалите средство от поверхности и добавьте HaCaT суспензию клеток с 0,5 х 106 клеток/мл. Объем-так же, как описано ранее в разделе Шаг 1.5.6.
    9. Инкубации клеток матрицы модели для 3 дней; Обмен среды после 2 дней.
    10. Удалите средство от поверхности клеток матрицы модели и инкубации клеток матрицы модели для дальнейшего 7 дней. Использование 100 мкл среднего на нижней и средней каждый день.
      Примечание: Для этого расследования, 3 лари/клеток модель образцы были подготовлены для 12-ну мембраны вставка системы. Для 96-луночных мембраны вставить системы, мы использовали 6 образцов для гель/ячеечная модель. Для статистических средств 3 образцы являются общими. Но для экспериментов в системе Вставка 96-луночных мембраны с коллагеном матричная модель мы ожидали ошибки и отклонения для клеточной культуры. Поэтому мы выбрали большее количество образцов.

2. проницаемость исследования в мембране вставить системы

  1. Доноров вещество
    Примечание: Производятся два флуоресцеин натрия солей (НВСЛ).
    1. Растворяют НВСЛ в H2O в концентрации 0,1 мг/мл и 0,01 мг/мл. Различные флуоресцеин Изотиоцианаты декстранов (FD) с молекулярной массой 4000, 10 000, 20 000 и 40 000 г/моль растворяются в H2O концентрация 2 мг/мл. Эти решения можно используйте в качестве доноров вещество для экспериментов проницаемости (см. Рисунок 1) с геля агарозы.
    2. Для установки с моделью клеток коллагена Подготовьте все решения с DMEM + 10% FCS вместо воды.
      Примечание: Подготовка запасов решения (10 x высокой концентрации) доноров вещества. Небольшие вариации концентрации доноров могут повлиять на результаты эксперимента проницаемости.
  2. Экспериментальный метод
    Примечание: Проницаемость эксперимент выполняется при 37 ° C и влажности > 90%. Этот параметр обеспечивает жизнеспособность клеток. Температура влияет на процесс диффузии таким образом те же параметры используются для экспериментов с геля агарозы, гель коллагена и коллаген ячеечная модель. Объем информации в кронштейн относится к системе Вставка 12-ну мембраны.
    1. Подготовить хорошо мембраной 96 - (или 12-) вставка системы с барьером, состоящий из агарозы гель (см. Протокол 1.1) или ячейки модель (см. Протокол 1,2-1,5) и вещество доноров флуоресценции.
    2. Подготовить разведения 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1: 160 и 1:320 доноров вещества для создания стандартной кривой. Пипетка 300 мкл (1846 мкл) каждого разведения в трех скважин приемника пластины. Для 12-ну мембраны вставьте системы использования отдельного приемника тарелку. Серийных разведений используются для преобразования измеренных флуоресценции [РФС] в эквивалентные концентрации [мг/мл].
    3. Добавьте 75 мкл (590 мкл) доноров вещества поверх образца (агарозы гель или ячейки модель) и 300 мкл (1846 мкл) акцептора вещества (H2O или DMEM + 10% FCS) в приемник плиты (см. Рисунок 1).
      Примечание: Обеспечить поверхности жидкости в мембране вставить системы и в приемник пластины имеют тот же уровень, чтобы избежать гидростатического давления.
    4. Передача всей системы на шейкер в инкубаторе. Отрегулируйте пожимая добиться однородного смешивания (общий ход Орбита-1,5 мм, скорость регулируется на уровне 3.5, которая связана с вращение ~ 480 1/мин) чтобы избежать градиента концентрации, которая влияет на процесс диффузии.
    5. Определите флуоресценции периодически каждый час. Для измерения флуоресценции, передача системы вставки мембраны в пустую тарелку и измерения флуоресценции в приемник, с помощью пластины читателя. Длина волны возбуждения 485 Нм и выбросов 535 Нм для флюоресцеином.
    6. Запуск эксперимента для 5 h.
      Примечание: В ходе экспериментов, жидкость испаряется от всей системы. Испарение изменяет концентрацию на доноров и акцепторов и влияет на результаты. Этот эффект игнорируется в случае продолжительность 5 h, но больше времени он должен рассматриваться.
  3. Расчет коэффициента проницаемости
    1. Установить калибровочной кривой, участок флуоресценции серийных разведений по сравнению с концентрацией и рассчитать линейную регрессию по данным.
    2. Используйте наклон линейной регрессии для преобразования данных флуоресценции пропитывание эксперимента в концентрации. Для целей моделирования преобразуйте единицы в моль/м3.
    3. Участок концентрация как функция со временем и создать линейный сегмент данных (см. Рисунок 2).
    4. Определить наклон этой линейной части и рассчитать коэффициент проницаемости по следующему уравнению (см. пример на рис. 2):
      figure-protocol-11902
      где dcA/ dt-изменение концентрации вещества в акцепторной стороне со временем (склон); CD – концентрация со стороны доноров; P — это коэффициент проницаемости; A поверхности проникновения, и VA объем акцептор. Это уравнение является производным от Фика первый закон и может быть применен только когда CD » CA6,22.
    5. Примечание: Концентрации в доноров должны быть намного выше, чем концентрации, обнаруженные в акцепторной. Это было проверено в экспериментальной установки.

3. Моделирование

Примечание: Моделирование было сделано с COMSOL Multiphysics 5.1. Базовые знания этого предполагается. Для моделирования диффузии, сделаны следующие допущения: (a) коэффициент диффузии веществ в H2O намного выше по сравнению с объемом в геле. Чтобы компенсировать это различие, моделирование использует значение 1 x 10-9 m2/s, который выше ПДК от 10 до 100, по сравнению с коэффициент диффузии НВСЛ через 2% агарозном геле. (b) в эксперименте вещество диффундирует через барьер и затем через мембраны мембраны вставить системы. В отличие от экспериментальной установки виртуальный агарозы гель или ячейку матрицы и мембраны считаются однородных однофазные. (c) граничных эффектов на стенах установлены «без скольжения», все эффект скольжения на стенах (не между жидкостью и гель или жидкости и клетки модель) системы вставки мембраны игнорируются и не являются значимыми для процесса диффузии.

  1. Настройка моделирования диффузии
    Примечание: Эти шаги демонстрируют установки моделирования эксперимента проницаемости. Симуляторы для систем вставки мембраны 96 - и 12-ну были созданы отдельно. Модуль «Химических видов транспорта» использует основанный на второй закон Фика диффузии уравнение:
    figure-protocol-13914
    где c-концентрация вещества, t — время, u-скорость, D является коэффициент диффузии и R это скорость реакции. Скорость реакции не уделялось должного внимания потому, что химические реакции не произошло в процессе диффузии.
    1. Откройте программу и начать новую модель. Выбрал «Мастера моделей», выберите 3D модель, добавить «Транспорт разбавленный видов» физика интерфейса в раскрывающемся меню, нажмите на «Исследование», выберите «Время зависимых» исследования и щелкните на «Готово».
    2. Перейдите к «Глобальные определения» и добавить «Параметры» щелкните правой кнопкой мыши. Введите геометрических и физических параметров в сетке (см. таблицу 1, Таблица 2и Рисунок 3e).
      Примечание: Вогнутой поверхности геля агарозы в 96-луночных мембранной системы вставка была аппроксимировать с мячом погружения.
    3. Настройка геометрии системы вставки мембраны из экспериментов. В шаге 3.2 показан пример построения геометрии 96-луночных мембраны вставка системы. Единица длины устанавливается на метр.
      Примечание: Не построить весь геометрии, чтобы сэкономить время расчета. Вместо этого geometry может быть уменьшена с помощью центра линии четверти геометрии (см. рис. 3а и 3Б, рисунок).
    4. Добавьте два «домен зонды» в «Определения» (право щелкните дальше «Определения» и найдите «Зонд») и выберите один зонд в качестве акцептора домена и другой как доноров домена. Выберите для оба типа «Средняя» и выражение «c» с группой «3моль/м».
      Примечание: Этот шаг не является обязательным и показывает концентрация акцепторной и доноров во время симуляции.
    5. Задать коэффициент диффузии (Dc) в «Транспортные свойства 1» в «транспорт видов разбавленную «как «Dif_w».
      Примечание: «Транспортные свойства 1» используется для домена акцептора и доноров. На следующем шаге будут перезаписаны барьер домена.
    6. Добавьте второй щелчок «Транспортные свойства 2» с правом на «Транспорт разбавленный видов» и выберите барьера (2) в «Выбор домена». В зависимости от цели моделирования коэффициента диффузии можно задать как значение барьера или как фиктивный «D». Для первого тестового запуска установите значение22E-10 m/s.
      Примечание: «D» будут объявлены позднее в шаге 3.3.
    7. В «Транспорт разбавленный видов» для «первоначальные значения 1» определяют концентрацию как ноль.
      Примечание: «Первоначальные значения 1» используется для барьера и акцептор домена. На следующем шаге будут перезаписаны в домен доноров.
    8. Добавьте второй щелчок «Первоначальные значения 2» с правом на «Транспорт разбавленный видов» и выберите доноров (3) как домен. Установка концентрации как начальной концентрации доноров вещества (например, C_fl из таблицы 2).
    9. Добавить «Симметрия 1» с правой кнопкой мыши на «Транспорт разбавленный видов», добавить и выбрать все поверхности «Граница выделения», которые отражают весь геометрии (для примера геометрии в шаге 3.2, это граница номер 1, 2, 4, 5, 7, 8).
      Примечание: Этот пункт можно пренебречь, если вся геометрия была создана.
    10. С правой кнопкой мыши на «Сетка» добавьте два «свободный четырехгранный». Выберите барьера (2) в качестве домена (изменить уровень геометрическая сущность в «Домен»). Добавить «Размера» щелкните правой кнопкой мыши на «свободный Tetrahedral 1» и для предопределенных сетки «Тонкие» для 12-ну мембраны вставить системы или «дополнительный штраф» для 96-луночных мембраны вставить системы.
    11. В второй «свободный четырехгранный» выберите акцептора и доноров, как домен и предопределенные сетки «Нормальный» для 12-ну мембраны вставить системы или «Тонкие» для 96-луночных мембраны вставить системы (см. рис. 3 c и 3d рисунок).
      Примечание: Это также можно выбрать грубее сетки, чтобы сэкономить время вычислений. Это может уменьшить точность результатов. Нажмите кнопку «Построить все» в «Сетка» сетки geometry.
    12. Начало моделирования с «вычисления» «Исследование 1».
  2. Пример установки для геометрии
    Примечание: Здесь пример дается как настроить геометрии 96-луночных мембраны вставка системы (с вогнутой барьер). Все действия выполняются в геометрии модуль программы. Единица длины устанавливается на метр.
    1. Создайте цилиндр 1 (щелкните правой кнопкой мыши на «Геометрия 1») с радиусом высоту h_sp + h_b + h_a и d_w/2.
    2. Создайте 2 цилиндра с радиусом d_tran/2, высота h_b + h_a и z позиции h_sp.
    3. Используйте параметр «Разница» (щелкните правой кнопкой мыши на «геометрия 1», найдите «Логические и раздела») для вычитания цилиндров 2 из цилиндра 1. Выбрал «cyl1» в «Объекты для добавления», активируйте «Объект для вычитания» и выбрал «cyl2». Новый объем является геометрия акцептор.
    4. Создайте цилиндр 3 с радиусом d_a/2, высота h_b и z положение h_sp.
    5. Создание сферы 1 с радиусом r и z позиции r_z.
    6. Используйте параметр «Разница» для вычитания сфере 1 (sph1) от цилиндра 3 (cyl3). Новый том называется разница 2.
    7. Создание 4 цилиндра с радиусом d_a/2, высота h_b + h_a и положение z h_sp.
    8. Используйте параметр «Разница» для вычитания цилиндров 4 (cyl4) от разница 2. Новый объем является геометрия акцептор.
    9. Повторите шаги 3.2.4-3.2.6 построить барьер (агарозы гель или ячейки модели в эксперименте).
    10. Сделайте союз 1 всех элементов геометрии (справа нажмите на «Геометрия 1», найдите «Логические и раздела»).
    11. Генерировать блок 1 со всех краев, равным длине d_tran * 2, позицию x - y d_tran и d_tran * 2.
    12. Генерировать блок 2 длиной края d_tran * 2, позицию x - d_tran * 2 и y - d_tran.
    13. Используйте параметр «Разница» для вычитания союз 1 из блока 1 и блок 2.
  3. Добавление параметра оптимизации для моделирования
    Примечание: С помощью параметра оптимизации коэффициент диффузии могут быть установлены на ранее созданных экспериментальных данных. Следующие инструкции показывают, как интегрировать в части оптимизации в моделирования диффузии. Убедитесь, что моделирование распространения работает перед началом эти шаги.
    1. Физика-модуль «Оптимизация» с помощью «Добавить физика» (оптимизации можно найти в «Математика» в категории «Оптимизация и чувствительность») для моделирования. Нажмите на «Добавить в компонент».
    2. Добавьте «Переменные» с правой кнопкой мыши под «Определения» (локальный компонент) и введите в переменных из таблицы 3.
      Примечание: Параметр оптимизации использует действительных чисел, то есть, фактор 1-10 коэффициента диффузии должны быть определены отдельно.
    3. Добавьте «Среднем 1» с правой кнопкой мыши на «Определения» в разделе «Компонент соединения» и введите имя оператора «Акцептора».
    4. Создать отдельный текстовый документ, содержащий экспериментальных данных.
      Примечание: Точка с запятой отделяет столбцов; разрыв строки отделяет строки. Декларация время измеряется в секундах, концентрация в моль/м3. Удалите первый и второй данных точки в лаг-фазы (см. Рисунок 2) экспериментов, чтобы избежать возможной установку ошибок. Вот пример, как может выглядеть текст документа:
      3540;      0.00216
      7140;      0.00724
      12240;    0.01707
      15180;    0.02230
      18660;    0.02697
      21540;    0.02931
      Этот пример можно использовать для проверки моделирования.
    5. Добавить «Глобальных наименьших квадратов цель» правой кнопкой мыши на «Оптимизация», придают текстовый документ из шага 3.3.4 «экспериментальные данные» и определить первый столбец «время столбец 1» с правом нажмите на «Глобальная цель наименьших квадратов» и второй столбец как «Значение столбца 1» с правой кнопкой мыши на «Глобальная цель наименьших квадратов». В «выражение» «Значение столбца» тип переменной «C».
    6. Добавьте «Глобального управления переменные 1» с правой кнопкой мыши на «Оптимизация» и объявить «D_search» как переменная с начальным значением «1», Нижняя граница «0» и верхняя граница «1000».
    7. Добавить «Оптимизация» правой кнопкой мыши на «Исследование 1» и выбрал «SNOPT» как метод оптимизации Решатель. Задайте оптимальности допуск до 1E-9.
      Примечание: Если моделирования не сходится, увеличение толерантности оптимальности. Имейте в виду, что моделирование будет неточным, если оптимальности терпимости является слишком большим.
    8. Запустите оптимизацию параметра с «вычисления» в «исследование». Не забудьте установить коэффициент диффузии на барьера как «D».

Результаты

Проницаемость эксперименты в 96-луночных мембраны вставить системы с 2% агарозном геле как барьер были проведены с целью оценить точность моделирования. Флуоресцеин натриевой соли (НВСЛ) и флуоресцеин Изотиоцианаты декстранов (FD) были использованы для проверки воздействия молекулярного размера диффундирующего вещества из 5 x 10-10 m до 45 x 10-10 м радиус Стокса (376.27-40000 mol wt). Моделирование собственного параметра оптимизации была использована для моделирования для экспериментальных данных.

С этой целью склонах только линейной части имитируемых проницаемости были по сравнению с экспериментальных результатов. Для маленьких молекулярных размеров моделирование и экспериментальных данных были хорошо согласуется с 99,2% для НВСЛ и 80,2% для FD 4000 (см. рисунок 4a и 4b рисунок). Большего молекулярного размера генерируется выше отклонений показаны корреляции 50,5% за 10000 FD, 79,7% за 20000 FD и 53,6% за 40000 FD. Кривой прогрессии в расчеты показали задержку в начале и сильный рост на дальнейший ход графиков (см. рис. 4 c–4e).

Коэффициенты проницаемости и моделирования распространения Коэффициенты указаны в Таблица 4. Коэффициент проникновения уменьшается с увеличением молекулярного размера. Стандартное отклонение было между 0.08 x 10-8 м/с и 0,47 x 10-8 м/с (N = 7), который соответствует абсолютной ошибки между 4.18% и 46,15%. Эксперименты с больших молекул показали больше абсолютная ошибка. Моделирование распространения Коэффициенты очень подобно относились к коэффициенты экспериментальной проницаемости. Вещества с больших радиусов Стокса показал снижение коэффициентов диффузии и абсолютная погрешность колебалась между 9.09% и 18.46% (N = 3).

В дополнительных пропитывание экспериментов четыре разных коллагеновых клеток типы модели были использованы в качестве барьеров в 12-ну мембраны вставить системы. Эти модели включают ячейки бесплатно модель и модель клетки с различными комбинациями первичных фибробластов в гель коллагена и HaCaT на поверхности. Были использованы следующие комбинации: коллаген (полковник) как модель свободных клеток, коллаген + фибробластов (полковник + ф), HaCaT (полковник + H.) и коллаген + фибробластов, коллаген + HaCaT (полковник + ф + Ч.). Флуоресцеин натриевой соли с DMEM + 10% FCS использовался в качестве доноров вещество. Для изображения был использован анализ модели клеток коллагена, окрашивание с гематоксилином и эозином (он). Это окрашивание было сделано с использованием протокола производителя. На рисунке 5показано такое пятно с представителем полковник + ф + H. модель. Он слегка пятна структура ткани коллагеновой матрицы. Фибробласты расположены в матрице, и ядра HaCaT клеток и фибробластов окрашенные в темно-фиолетовый. На вершине коллагеновой матрицы есть слой, содержащий много ядер, которые должны быть ядра HaCaTs, строительство внешнего слоя на верхней части модели.

В таблице 5перечислены экспериментальной пропитывание коэффициенты и коэффициенты искусственной диффузии. Тенденция может рассматриваться для большинства моделей с HaCaT, которые имеют меньше проникновения/распространения коэффициенты по сравнению с моделями без HaCaT. Абсолютная погрешность коэффициентов проникновения — 10,9-24,4% и для распространения Коэффициенты 5,2% - 12,9%.

figure-results-3839
Рисунок 1: вид сбоку эксперимента проницаемости мембраны ‡акладные. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-4235
Рисунок 2: Образцовый график проницаемости эксперимента. Концентрация акцепторной строится со временем. Две пунктирные линии кронштейн почти линейной части графа. Наклон линейной части используется для определения коэффициента проницаемости. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-4805
Рисунок 3: геометрия и сетки мембраны вставить системы моделирования. () геометрии 96-луночных мембраны вставка системы. (b) геометрии 12-ну мембраны вставка системы. (c) сетка 96-луночных мембраны вставка системы. (d) сетка 12-ну мембраны вставка системы. (e) сечение и параметры мембраны вставить системы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-5526
Рисунок 4: сравнение экспериментальных данных от проникновения эксперимента для оптимизированного моделирования. () флуоресцеин натрия соли, массовая мол Изотиоцианаты декстран 4000 флюоресцеином (b), (c) 10000 mol массы, (d) 20000 mol массы и (e) 40000 mol массы пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-6203
Рисунок 5: представитель он окрашивание коллаген ячеечная модель (HaCaT, коллаген + фибробластов). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

figure-results-6630
Рисунок 6: коэффициент проницаемости как функция радиуса 1/Стокса, используя флуоресцеин натриевой соли и флуоресцеин Изотиоцианаты декстрана в 96-луночных мембраны ‡акладные. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

ИмяExperession для 96 системы в ммExperssion для 12-ну системы в ммОписание
d_tran5.65 [мм]14.7 [мм]Диаметр скважины
d_a4.26 [мм]12.1 [мм]Диаметр мембраны
d_w8.79 [мм]21,97 [мм]Диаметр акцептор
h_b2 [мм]2 [мм]Высота барьера
h_sp1 [мм]1 [мм]Расстояние между хорошо и снизу
h_a4.73 [мм]5.24 [мм]Высокая акцептор
bh_b/2-Глубина погружения
r((d_a)^2+4*b^2)/(8*b)-Радиус шара погружения+
r_zr + h_b-z положение мяча погружения+

Таблица 1: параметры геометрии для моделирования «Химических видов транспорта». + Могут быть использованы для моделирования агарозы только гель в 96 хорошо мембраны вставить системы.

ИмяВыражениеЗначениеОписание
C_fl0,1 [mg/ml]/376.28 [г/моль]0.26576 мол/m2 Концентрация Fl.So.
C_42 [мг/мл] / 4000 [г/моль]0,5 моль/м2Концентрация FD 4.000
C_102 [мг/мл] / 10000 [г/моль]0.2 моль/м2Концентрация FD 10.000
C_202 [мг/мл] / 20000 [г/моль]0,1 моль/м2Концентрация FD 20.000
C_402 [мг/мл] / 40000 [г/моль]0,05 моль/м2Концентрация FD 40.000
Dif_w1E-9 [m ^ 2/s]1E - 9m2/sКоэффициент диффузии воды затворения

Таблица 2: Физические параметры для моделирования «Химических видов транспорта».

ИмяВыражениеОписание
CAcceptor(c)Определение концентрации акцепторов
DD_search * 1e-10Коэффициент изменения для D

Таблица 3: Параметры для моделирования «Оптимизация».

ПронизываютКоэффициент проницаемости (m/s) x 10-8Коэффициент диффузии (2m/s) x 10-10Радиус Стокса растворенного вещества (m) x 10-10
Fl.So.4.79 ± 0,201.94 ± 0,345
FD 40002.37 ± 0.310,65 ± 0,1214
FD10, 0001,67 ± 0,470.22 ± 0,0223
FD 20 0000,65 ± 0.300,29 ± 0,0433
FD 400000.27 ± 0,080,14 ± 0,0245

Таблица 4: коэффициент проницаемости и диффузии веществ с различными радиус Стокса через мембрану в 96-луночных мембрана + 2% агарозном геле ‡акладные. (флуоресцеин натрия соль = Fl. так, fitc декстрана = FD).

МодельКоэффициент проницаемости (m/s) x 10-8Коэффициент диффузии (2m/s) x 10-10
Полковник2.18 ± 0.291.22 ± 0,06
Полковник + F.1.77 ± 0,380.93 ± 0,12
Полковник + H.1.64 ± 0.400.96 ± 0,05
Полковник + ф + H.1,65 ± 0,180,88 ± 0,11

Таблица 5: коэффициент проницаемости и диффузии флуоресцеин натриевой соли через модель клеток коллагена в 12-хорошо мембраны вставить системы (полковник = коллагена, ф = фибробластов, ч. = HaCaT).

Обсуждение

Это исследование документов метод, разработанный для количественного определения проникновение через конструкцию ткани, инженерии на мембрану. Проникновение веществ с различной молекулярной размеров через гель агарозы впервые была рассмотрена для тестирования и проверки метода и соответствующего моделирования. Хорошо известно, что небольшие молекулы быстрее проникать через сетку матрицы (за исключением эффекта в гель фильтрации хромотографией проницаемость). Аналогичные замечания были сделаны с размер исключение эксперименты веществ через склера26, человеческого эпидермиса мембраны27, кожи человека17и крыса кожи28. Обратная корреляция между коэффициенты проницаемости и соответствующего радиус Стокса (радиус сферы жесткий, что движется с той же скоростью диффузии молекул описано, обычно меньше, чем радиус молекулы) было показано, 26 , 28и подобные отношения было отмечено в экспериментах с веществами различных молекулярных размеров. Путем построения коэффициенты проницаемости над 1/Стокса радиус, был найден линейной корреляции над четырьмя группами с наименьшей молекулярного размера (R2 = 0,93) (рис. 6). Это означает, что коэффициенты проницаемости смоделированные с помощью метода предложил находятся в диапазоне, реалистичные.

Ошибка 46,15% в экспериментах немного больше, чем сообщалось на проницаемость экспериментов с Франц диффузии ячейки системы10. Одно из возможных объяснений может быть распределение по размерам флуоресцеин Изотиоцианаты декстрана, который рассматривается позже.

Метод, описанный имеет важные преимущества по сравнению с методами, с помощью системы клеток диффузии Франц. Во-первых установка является более компактным; эксперименты, выполняются непосредственно в систему вставки мембраны, которая имеет масштаб коммерческих хорошо пластины (∼ 13 x 8.5 см). Это позволяет несколько образцы выполнять одновременно, тогда как отдельную ячейку диффузии Франц необходима для каждого образца. Во-вторых проницаемость кожи модели может быть непосредственно измеряется в вставки мембраны, где происходит выращивание. С помощью Франц диффузии клетки, образцы должны быть вывезены и установлен на системе, которая является более громоздким для малых выборок и также является более трудоемким.

Пропитывание эксперименты с коллагена ячейки матрицы показали, что этот метод может применяться успешно к системам клеток семенами. Модель, представленная здесь было проверено для кожи модели; Однако этот метод может применяться для других типов органических клеточных культур, например, почек или печени.

В этом исследовании, коллаген ячеечная модель была использована, в котором HaCaT клетки полностью покрыты поверхности модели (см. Рисунок 5). Это привело к сокращению коэффициента проницаемости, демонстрируя, что метод является достаточно чувствительным, чтобы отличить коэффициент проницаемости между коллаген ячеечная модель с и без слоя HaCaT. В идеале модель кожи следует создать барьер, который приближается к эпидермис реальных кожи29, и поэтому важно проверить качество (например, строительство дермы, эпидермис) кожи модели до фактического использования. Разработка модели кожи можно изобразить с пятная методов и количественно от обнаружения кожи белков и коллагена30,,3132. Коэффициент проницаемости могут также быть важным фактором для оценки разработки модели кожи, но необходимы дальнейшие эксперименты подтверждают это. Как упоминалось ранее этот метод позволяет параллельно несколько образцов. Это также можно взять образцы во время выращивания для измерения проницаемости и таким образом наблюдать за развитием этого параметра в модели кожи.

Следует отметить, что проницаемость измеряется через гель/коллагена клеток модель и мембраны одновременно. Коэффициент обнаруженных проницаемости конкретной системы, согласно которой результаты моделей различных кожи можно сравнить, только при использовании же вставки мембраны. Кроме того модель кожи необходимо охватить весь посевные площади для того, чтобы обеспечить только через модель будет пронизывать испытываемого вещества и не рядом с ним, которая побуждала бы ошибки измерения проницаемости. Другой аспект, который следует рассматривать в будущем экспериментов является природной среды, окружающей кожи. Как правило температура поверхности кожи ниже по сравнению с внутренней региона, который может влиять на условия проникновения.

Для того чтобы выровнять лабораторных экспериментов с компьютерного моделирования, был представлен метод, который позволяет параметр оптимизации для прикладного моделирования. Моделирования были найдены совпадают также с экспериментальными данными для веществ с маленьких молекулярных размеров. Однако для веществ с больших молекулярных размеров наблюдались отклонения между моделирования и экспериментальных данных. Большие полисахаридные молекулы могут увеличивать трение и замедляют процесс диффузии в виде геля. Этот эффект заставляет аномальные диффузии, который является возможной причиной для отклонения между экспериментальной и моделирование значений33,34. Другое объяснение может быть наличие небольших или крупных частиц в флуоресцеин Изотиоцианаты декстрана. Производитель указывает молекулярная масса вещества, как средний размер с заданного диапазона, который позволяет меньшие и большие частицы присутствовать. Неясно также как дисперсной эти вещества являются, как мелкие частицы проникают быстрее через гель и жидкости канал. Это позволяет расширить моделирование рассмотреть эти диффузии и трения эффекты.

Проницаемость эксперимента и моделирования были разработаны для использования в 2 OC. С помощью моделирования этот экспериментальный метод могут быть непосредственно переданы более сложные экспериментальных установок. Например системы моделирования вставки мембраны легко могут быть переданы к геометрии 2-OC или других систем с аналогичных структурах. Этот параметр модуляции моделирование может использоваться для поддержки разработки дальнейших экспериментов. Кроме того побочные эффекты, такие как испарение, аномальной диффузии и мембраны эффекты могут быть интегрированы для расширения моделирования, тем самым улучшая точность. Программа моделирования дает возможность изменить или улучшить моделирование уравнения, а также о том, как интегрировать другие физические модули для изучения других аспектов кожи модели развития. Одним из примеров является моделирование глюкоза лактат и потребления производства в модели клеток коллагена.

Особенно интересным аспектом в испытаниях лекарственных веществ является, как вещества распределяются в систему органа на чипе. Моделирование и проницаемости параметр моя помощь ответить на вопросы, такие как быстро вещество проникает в систему а также которых концентрация будет доступна для других тканей в multi organ-чип. Этот метод может поддержать и расширить разработку и тестирование систем такого органа на чипе.

Раскрытие информации

Уве Маркс — Генеральный директор и акционер и Gerd Lindner является акционером компании TissUse GmbH, компании по производству и коммерциализации технологии МОЦ. Другие авторы заявляют никакого конфликта интересов относительно опубликования этого документа.

Благодарности

Эта работа была создана при финансовой поддержке от Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) под Грант нет PO413/12-1 и Ла 1028/7-1.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseCarl RothK297.2High Resolution Powder
CollagenServa47256.01Collagen R solution 0.4 %
DMEMLonza (Biozym Scientific GmbH)880010-12High Glucose with L-Glutamine
FCSBiochrom GmbHS0615 0114FFetal Calf Serum
Fluorescein Sodium SaltSigma-Aldrich46960-25G-F
Fluorescein Isothiocyanate-dextranSigma-Aldrich46944-500MG4000 g/mol
Fluorescein Isothiocyanate-dextranSigma-AldrichFD10S-250MG10 000 g/mol
Fluorescein Isothiocyanate-dextranSigma-AldrichFD20S-250MG20 000 g/mol
Fluorescein Isothiocyanate-dextranSigma-AldrichFD40S-250MG40 000 g/mol
HBSSThermoFisher Scientific14170120no calcium, no magnesium , with phenol red
NaOHMerck1.06467.9010granulated
PBSGibco18912-014tablets
Transwell Cell Culture InsertsCorning339196 well, 0.4 µm pore size
Transwell Cell Culture InsertsCorning (VWR)734-156312 well, 0.4 µm pore size
TrypsinBiochrom GmbHL2143with EDTA

Ссылки

  1. Marx, U., et al. Human-on-a-chip developments: a translational cutting-edge alternative to systemic safety assessment and efficiency evaluation of substances in laboratory animals and man?. ATLA. 40 (5), 235-257 (2012).
  2. Maschmeyer, I., et al. Chip-based human liver-intestine and liver-skin co-cultures - A first step toward systemic repeated dose substance testing in vitro. Eur J Pharm Biopharm. 95, 77-87 (2015).
  3. Prunieras, M., Regnier, M., Woodley, D. Methods for Cultivation of Keratinocytes with an Air-Liquid Interface. J Invest Dermatol. 81 (1), 28-33 (1983).
  4. Cannon, C. L., et al. New epidermal model for dermal irritancy testing. Toxicol In Vitro. 8 (4), 889-891 (1994).
  5. Ackermann, K., et al. The Phenion Full-Thickness Skin Model for Percutaneous Absorption Testing. Skin Pharmacol Physiol. 23 (2), 105-112 (2010).
  6. Netzlaff, F., et al. Permeability of the reconstructed human epidermis model Episkin in comparison to various human skin preparations. Eur J Pharm Biopharm. 66 (1), 127-134 (2007).
  7. Bran, B., et al. A New Discriminative Criterion for the Development of Franz Diffusion Tests for Transdermal Pharmaceuticals. J Pharm Sci. 13 (2), 218-230 (2010).
  8. Pineau, A., et al. In vitro study of percutaneous absorption of aluminum from antiperspirants through human skin in the Franz diffusion cell. J Inorg Biochem. 110, 21-26 (2012).
  9. Filon, F. L., et al. In vitro percutaneous absorption of cobalt. Int Arch Occup Environ Health. 77 (2), 85-89 (2004).
  10. Ng, S. -. F., et al. Validation of a Static Franz Diffusion Cell System for In Vitro Permeation Studies. AAPS PharmSciTech. 11 (3), 1432-1441 (2010).
  11. Bonferoni, M. C., et al. A Modified Franz Diffusion Cell for Simultaneous Assessment of Drug Release and Washability of Mucoadhesive Gels. Pharm Dev Tecnol. 4 (1), 45-53 (1999).
  12. Seiffer, S., Oppermann, W. Systematic evaluation of FRAP experiments performed in a confocal laser scanning microscope. J Microsc. 220 (1), 20-30 (2005).
  13. Pluen, A., et al. Diffusion of Macromolecules in Agarose Gels: Comparison of Linear and Globular Configurations. Biophys J. 77, 542-552 (1999).
  14. Cornelissen, L. H., et al. Diffusion measurements in epidermal tissues with fluorescent recovery after photobleaching. Skin Res Technol. 14 (4), 462-467 (2008).
  15. Pirot, F., et al. Characterization of the permeability barrier of human skin in vivo. PNAS. 94 (4), 1562-1567 (1997).
  16. Tetteh, J., et al. Local examination of skin diffusion using FTIR spectroscopic imaging and multivariate target factor analysis. Anal Chim Acta. 642 (1-2), 246-256 (2009).
  17. Guldbrand, S., et al. Two-photon fluorescence correlation spectroscopy as a tool for measuring molecular diffusion within human skin. Eur J Pharm Biopharm. 84 (2), 430-436 (2013).
  18. Kehe, K., et al. Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line. Arch Dermatol Rech. 291 (11), 600-605 (1999).
  19. Veronike, M., et al. Epidermal Organization and Differentiation of HaCaT Keratinocytes in Organotypic Coculture with Human Dermal Fibroblasts. J Invest Dermatol. 112 (3), 343-353 (1999).
  20. Moraes, C., et al. Organs-on-a-chip: a focus on compartmentalized microdevices. Ann Biomed Eng. 40 (6), 1211-1227 (2012).
  21. Huh, D., et al. From Three-Dimensional Cell Culture to Organs-on-Chips. Trends Cell Biol. 21 (12), 745-754 (2011).
  22. Schimek, K., et al. Integrating biological vasculature into a multi-organ-chip microsystem. Lab Chip. 13 (18), 3588 (2013).
  23. Materne, E. -. M., et al. The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture. J Vis Exp. (98), (2015).
  24. Materne, E. -. M., et al. A multi-organ chip co-culture of neurospheres and liver equivalents for long-term substance testing. J Biotechnology. 205, 36-46 (2015).
  25. Materne, E. -. M., Tonevitsky, A. G., Marx, U. Chip-based liver equivalents for toxicity testing - organotypicalness versus cost-efficient high throughput. Lab Chip. 13 (18), 3481 (2013).
  26. Jayakrishna, A., et al. Diffusion of High Molecular Weight Compounds through Sclera. IOVS. 41 (5), 1181-1185 (2000).
  27. Peck, K., et al. Hindered Diffusion of Polar Molecules Through and Effective Pore Radii Estimate of Intact and Ethanol. Pharm Res. 11 (9), 1309-1314 (1994).
  28. Ogiso, T., et al. Mechanism of the Enhancement Effect of n-Octyl-β-D-thioglucoside on the Transdermal Penetration of Fluorescein Isothiocyanate-Labeled Dextrans and the Molecular Weight Dependence of Water-Soluble Penetrants through Stripped Skin. J Pharm Sci. 83 (12), 1676-1681 (1994).
  29. Hadgraft, J. Skin, the final frontier. Int J Pharm. 224 (1-2), 1-18 (2001).
  30. Asselineau, D., et al. Human Epidermis Reconstructed by Culture: Is It "Normal"?. J Invest Dermatol. 86 (2), 181-186 (1986).
  31. Casasco, A., et al. Cell proliferation and differentiation in a model of human skin equivalent. Anat Rec. 264 (3), 261-272 (2001).
  32. Kehe, K., et al. Tissue engineering with HaCaT cells and a fibroblast cell line. Arch Dermatol Res. 291 (11), 600-605 (1999).
  33. Laurent, T. C., et al. Diffusion of Dextran in Concentrated Solutions. Eur J Biochem. 68, 95-102 (1976).
  34. Metzler, R., Klafter, J. The random walk's guide to anomalous diffusion: A fractional dynamics approach. Phys Rep. 339 (1), 1-77 (2000).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

132

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены