Одновременное исследование вербовки Моноцит субпопуляций под поток в пробирке

Резюме

Здесь мы представляем Интегрированный протокол, который измеряет Моноцит субпопуляция людьми под потока в пробирке путем использования конкретных поверхностных маркеров и конфокальный флуоресцентной микроскопии. Этот протокол может использоваться для изучения последовательного набора мер, а также относительно профиль другие подтипы лейкоцитов, используя другие конкретные поверхностных маркеров.

Аннотация

Набор моноцитов в крови для целевых периферических тканях имеет решающее значение для воспалительного процесса во время повреждения тканей, развитие опухоли и аутоиммунных заболеваний. Этому способствует через процесс захвата от свободного потока на поверхность Люминал активированного эндотелиальных клеток, следуют их адгезии и трансэндотелиальной миграции (переселение) в базовом пораженной ткани. Однако механизмы, которые поддерживают преференциальных и контекстно зависимые вербовки Моноцит субпопуляций понимаются еще не полностью. Таким образом мы разработали метод, который позволяет набора различных Моноцит субпопуляций одновременно визуализировать и измеряется в поток. Этот метод, основанный на покадровой конфокальная томография, позволяет недвусмысленное различие между приверженцами и переселенных моноцитов. Здесь мы описываем, как этот метод может использоваться одновременно изучить набор Каскад pro ангиогенных и не ангиогенных моноцитов в пробирке. Кроме того этот метод может быть продлен изучить различные этапы найма до трех Моноцит населения.

Введение

Моноциты являются фагоцитирующих компонентом врожденного иммунитета, которая необходима для борьбы с патогенами, очистка поврежденных тканей, ангиогенез и патофизиологии многих заболеваний, включая рак^1,2,3 . Моноциты являются клетки костного мозга, полученных состоит из гетерогенных субпопуляций, которые циркулируют в крови, но могут быть набраны на месте воспаления в периферических тканях через конкретные молекулярные механизмы. Набор каскадов моноцитов, а лейкоцитов в целом подразумевает различные шаги, включая захват, прокатки, ползать, арест, трансэндотелиальной миграции (переселение) и миграции через стенку сосуда (базальной мембраны и росписи ⁴клетки). Эти шаги включают главным образом воспаления индуцированной молекул на поверхности эндотелиальных Люминал селектинов, гликопротеин лигандов, chemokines, молекулы адгезии межклеточных и соединительной и их рецепторов на лейкоциты например селектина лигандами и интегринов. Торговли людьми пути через либо развязок эндотелиальных клеток (параклеточный) или через эндотелиальные клетки тела (transcellular) может использоваться лейкоциты пересечь эндотелиальный барьер⁵. Хотя исторически были задокументированы моноцитов к высыпками через маршрут transcellular, потенциальные расхождения в их миграционных пути были предложены моноциты больше не считаются популяции однородных клеток. В настоящее время становится ясно, что разнообразие Моноцит могут быть определены каждым из их различий и общности, в отношении их отличительные кровоподтек каскады^3,6. Таким образом чтобы однозначно различать Моноцит субпопуляций, крайне важно для визуализации и фенотип поведение каждого из этих различных субпопуляций в ходе набора процесса.

Моноциты от человека, свинки, крысы и мыши были подразделены фенотипического субпопуляции с некоторыми объясняется социальными функциями и конкретных миграционных поведения^7,8,9. Например в организме человека, моноциты можно подразделить три подгруппы, основанный на их поверхности выражение CD14, coreceptor для бактериальных липополисахарида и CD16, Fc-гамма-рецептор III. Человека Моноцит субпопуляций включают в себя классические CD14 окрашенных CD16 +^+-, промежуточные CD14 окрашенных CD16 +⁺⁺ и неклассические CD14^{тусклом}CD16⁺ клетки^6,9. Классическая CD14 окрашенных CD16 +^+– моноцитов были показаны в основном воспалительных тогда как бассейн CD16⁺ моноцитов коллективно были найдены представить TIE2 выражения и proangiogenic функции¹⁰. Последовательно, стимуляции эндотелиальных клеток с воспалительных цитокинов, таких как некроза опухолей человека фактор (ФНО) α или интерлейкина (IL-1) бета (обычные воспаление) достаточно, чтобы вызвать полный набор классических CD14 окрашенных CD16 +^{+ –} моноцитов. Тем не менее, одновременных действий Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) и TNFα (ангиогенных факторов driven воспаление) требуются спровоцировать трансмиграции CD16⁺ proangiogenic бассейн моноциты³. Исторически традиционная система Transwell при статических условиях, Камера потока параллельной пластине и µ слайд потока камеры были использованы для количественного анализа набора одного лейкоцита населения на время в пробирке^{11 ,12,13}. Хотя эти протоколы были подтверждены, более надежный метод, который позволяет одновременный анализ нескольких Моноцит субпопуляций будет считаться более глубокий. Такие методологии должны учитывать различные частоты каждого соответствующего населения и несколько взаимодействий и также предусматривают набор каскадов, которые определяют каждый Моноцит механистического понимания сходства и особенностей подмножество.

Здесь мы представляем метод, основанный на промежуток времени изображений набора Моноцит под поток, который позволяет мигрирующих каскады Моноцит различных субпопуляций одновременно быть изучены с помощью конфокальной микроскопии. Этот метод объединяет некоторых критических функций, которые имитируют эндотелиальных клеток воспаления, а также гемодинамики циркулирующих моноцитов в пост капиллярного венулы, основное место лейкоцита вербовки в естественных условиях. Предложенный метод использует эндотелиальных клеток человека пупочную вену (HUVEC), которые генерируются с помощью устоявшихся Протокол изоляции от человека пуповины. Этот клинический ресурс имеет преимущество легко доступны как побочный продукт биологического, также одновременно обеспечивая разумной доходности эндотелиальных клеток, которые могут быть изолированы от пупочную вену. Мы также использовали флуоресцентных красителей и иммунофлюоресценции для различения различных клеточных компонентов и confocal микроскопии однозначно определить Моноцит позиционирования (люминал против abluminal) с течением времени. Протокол, представленные здесь был разработан одновременно измерить уровни трансмиграции Моноцит субпопуляций. Кроме того следует отметить, что эта методология может быть расширен для изучения других субпопуляций лейкоцитов и процессы набора персонала путем использования различных биомаркеров и маркировки.

протокол

С осознанного согласия добровольцев доноров и в соответствии со швейцарской комитетов по этике клинических исследований были использованы материалы человека.

1. изоляция и замораживание человека пупочной вены эндотелиальных клеток (HUVEC)

1. Добавьте 5 мл раствора покрытие в колбе T75 (0,1 мг/мл коллаген G и 0,2% желатина в солевой PBS фосфатного буфера при рН 7,4) для 30 минут при 37 ° C до начала HUVEC изоляции.
2. Очистить шнур с PBS, протрите его стерильные компрессы и поместите его в стерильных 20 см Петри. Отрежьте концы шнура с стерильными ножницами.
3. Определите один большой вен и два малых артерий. Аккуратно вставьте канюлю с трехходовой кран, прикрепленных к нему в Вену конечностях на концах кабеля.
4. Затяните шнур и канюли связи прочно с длиной провода.
5. Perfuse шнур дважды с 20 мл RPMI носитель, содержащий 100 ед/мл пенициллин, стрептомицин 100 ед/мл и 250 нг/мл амфотерицин B мыть шнур вен. Этот процесс делает внешний вид шнур белее и яснее. Пустые Вены перед добавлением коллагеназы, собирая RPMI с помощью шприца на одном конце.
6. Perfuse вен с 12 мл 1 мг/мл коллагеназы типа I (0,22 мкм фильтрация).
7. Закрыть кран на шнур заканчивается и инкубировать шнур при 37 ° C 12 мин.
8. Нежно массируйте за шнур для отсоединения эндотелиальных клеток от просвета вены.
9. Возьмите 30 мл RPMI, содержащие 10% плода телячьей сыворотки с 50 мл шприц и подключить его к одному концу пуповины.
10. Подключите пустой 50 мл шприц в другой конец пуповины
11. Откройте кран и perfuse вен с одного конца, хотя взаимно сбор с другого конца.
    Примечание: Собранные суспензии содержит эндотелиальных клеток.
12. Центрифуга этот суспензию клеток на 200 x g за 5 мин.
13. Отменить супернатант и Ресуспензируйте клетки лепешка с 10 мл полного среднего M199 (M199 добавки, содержащие 20% FCS, рост эндотелиальных клеток 15 мкг/мл, 100 мкг/мл гепарина натрия, 0,5 мкм гидрокортизон, 10 мкг/мл L-Аскорбиновая кислота, 100 ед/мл пенициллин, 100 ед/мл Стрептомицина и 250 нг/мл амфотерицин B).
14. Удалить раствор для нанесения покрытия из T75 колбу и один раз промыть PBS.
15. Семя клетки собраны из шага 1,13 в колбу T75 и поместите его в инкубаторе при 37 ° C с 5% CO₂.
16. Следующий день, промойте колба 3 раза с полного среднего M199 удалить остаточные красных кровяных клеток, а затем изменить носитель каждые 2 дня до слияния.
17. При впадении в 80 – 90% промойте HUVEC монослоя раз с 5 мл PBS и отсоединение клетки с 5 мл 0,05% трипсина в 1 мм ЭДТА при 37 ° C за 5 минут добавить 4 мл M199 и 1 мл FCS прекратить действие трипсина. Промойте Фляга для отсоединения всех HUVEC.
18. Собирайте Алиготе 50 мкл использоваться для окрашивания VE-Кадгерины, PECAM-1 и gp38, и анализировать подачей cytometry проверить чистоту HUVEC.
19. Сбор на оставшуюся часть HUVEC от шага 1.18 в 15 мл трубки и центрифуги на 200 x g 5 мин при комнатной температуре.
20. Отменить супернатант из шага 1.19, Ресуспензируйте Пелле клеток в замораживания раствора (FCS, содержащие 10% ДМСО) на плотности тарелок 5 x 10⁵ клеток/мл в cryotubes и заморозить при температуре-80 ° C или в жидком азоте до использования.
21. Чтобы проверить HUVEC чистоты:
    1. Добавьте 1 мкл антител против человека VE-Кадгерины FITC, 1 мкл антител против человека PECAM1-PE и 1 мкл антител против человека Podoplanin-APC Алиготе 50 мкл HUVEC, собранных на этапе 1.18.
    2. Инкубации при комнатной температуре в течение 10 мин.
    3. Добавить 100 мкл PBS и центрифуги 400 x g 30 s.
    4. Отменить супернатант и Ресуспензируйте в 100 мкл PBS. Данные теперь могут быть приобретены потока цитометрии методами.
       Примечание: HUVEC позитивные для VE-Кадгерины и PECAM-1 и негативные для Podoplanin.

2. HUVEC размораживания

Примечание: Использование HUVEC на низкий проход для экспериментов (максимум 5 ходов).

1. Герб T75 флакон с 1 мл раствора покрытие при 37 ° C за 30 мин.
2. Быстро разморозить HUVEC при 37 ° C на 2 мин и Ресуспензируйте клетки в 10 мл полной M199.
3. Центрифуга клетки на 200 x g при комнатной температуре в течение 5 мин и удалить супернатант.
4. Ресуспензируйте Пелле клеток в 10 мл полной M199.
5. Передача суспензию клеток в предварительно покрытых колбу. Место колбу в инкубаторе при 37 ° C с 5% CO₂. Измените ячейки питательной среды каждые 2 дня.

3. HUVEC культура в камере 0.4 мкг слайд

1. Пять дней до начала эксперимента потока, предварительно покройте палат 0.4 мкг слайд с 30 мкл PBS, содержащие 0,1 мг/мл коллаген G, 0,2% желатина при 37 ° C за 30 мин.
2. Вымойте камер с 100 мкл PBS.
3. Отсоедините клетки от 80 – 90% вырожденная HUVEC T75 колбы.
4. Промойте HUVEC 5 мл PBS и отсоединить их с 5 мл 0,05% трипсина при 37 ° C за 5 мин.
5. Потолочные и собирать суспензию клеток в полной M199 и подсчитать количество ячеек по наиболее удобным способом. Центрифуга на 200 x g 5 мин при комнатной температуре.
6. Ресуспензируйте Пелле клеток на 10⁶ клеток/мл и распространять 30 мкл (30000 клеток) на камеру.
7. Инкубируйте клетки в инкубаторе при 37 ° C с 5% CO₂ на 1 ч.
8. 150 мкл полного M199 для каждой камеры и культура клетки на 5 дней в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO₂. Измените носитель каждые 2 дня.

4. HUVEC пятная для Assay Моноцит набора под поток

1. Подготовить маркировки среднего M199 и 1 мкм CMFDA (5-chloromethylfluorescein диацетата) и тепло при 37 ° C за 5 мин до клеток маркировки.
2. Вымойте HUVEC дважды с M199 среднего нагревается при 37 ° C.
3. Замените 30 мкл утепленные маркировки среды, содержащие 1 мкм CMFDA среды и поместите в инкубатор при 37 ° C и 5% CO₂ за 10 мин.
4. Мыть раз с полным M199 и инкубировать клетки с полным M199 в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO₂ на 30 мин.
   Примечание: Важно удалить все следы сыворотки перед добавлением раствора маркировки, в противном случае она может изменить HUVEC пятнать.
5. Заменить в среду с полным M199 содержащие либо человека TNFα (500 ед/мл) или смесь человека TNFα (500 ед/мл) с человеческой VEGFA (1 мкг/мл) за 6 ч в инкубаторе при 37 ° C и 5% CO₂.

5. изоляция человека Пан моноцитов и пятнать субпопуляций

1. Используйте Баффи слой концентрированного человеческой крови, или 20 мл свежевыделенных человеческой крови, собранные в день эксперимента в ЭДТА vacutainer трубы.
2. Разбавить кровь в PBS-1 мм ЭДТА (1:1) и аккуратно Пипетка 20 мл разбавленной крови поверх 20 мл градиента плотности средств массовой информации. Центрифуга на 400 x г за 30 мин при комнатной температуре с медленным ускорение и без тормозов.
3. Собирать мононуклеарных клеток периферической крови (КСДОР)-уровень тромбоцитов (между СМИ градиента плотности и плазмы слои) в новый Тюбик 50 мл, содержащие 40 мл PBS - 1 мм ЭДТА. Топ 50 мл с ЭДТА PBS - 1 мм.
4. Центрифуга на 200 x g при комнатной температуре на 5 мин отбросить супернатант.
5. Ресуспензируйте клетки лепешка с 10 мл окрашивание буфера (PBS - 1 мм ЭДТА содержащих 0,5% альбумина bovine сыворотки BSA).
6. Центрифуга на 200 x g при комнатной температуре на 5 мин отбросить супернатант.
7. Повторите шаги 5.5 и 5.6.
8. Ресуспензируйте клетки лепешка с 10 мл окрашивания буфера. Возьмите Алиготе 10 мкл для подсчета клеток.
9. Проверьте КСДОР населения и подсчитать ячейки быстро с проточный цитометр.
   Примечание: Характеристика лимфоцитов и моноцитов населения может наблюдаться (рис. 1A). От 50 мл свежей крови человека ожидать о 50-100 х 10⁶ КСДОР.
10. Для найма CD14 + против CD14-КСДОР под поток:
    1. Помыть лепешка три раза с буфера потока (M199 содержащих 0,5% BSA) и Ресуспензируйте мононуклеарных клеток в буфере потока на 6 x 10⁶ клеток / мл.
    2. Сделайте аликвоты 200 мкл калибровочных. Инкубируйте при 37 ° C до 20 мин до assay.
    3. Мкл 5 анти CD14-PE и Hoechst 33342 в конечной концентрации 2 мкм для каждого Алиготе. Смешать и инкубировать при 37 ° C за 10 мин.
    4. Центрифуга Алиготе на 400 x g 30 s.
    5. Отменить супернатант и Ресуспензируйте лепешка с 200 мкл буфера потока.
11. Для найма Моноцит субпопуляций в поток:
    1. Изолируйте моноциты с комплектом Пан Моноцит изоляции согласно инструкциям производителя.
       Примечание: Следующий протокол изоляции предназначен для 50 x 10⁶ клеток. Он может масштабироваться вверх или вниз, пока он находится в пределах рекомендациям изготовителя.
    2. Центрифуга КСДОР подвеска на 200 x g при комнатной температуре в течение 5 мин.
    3. Отменить супернатант и Ресуспензируйте лепешка с 400 мкл окрашивания буфера.
    4. Добавьте 50 мкл Реагента Fc рецептор блокировки и 50 мкл антител Пан Моноцит коктейль.
    5. Инкубации при комнатной температуре в течение 10 мин.
    6. Окрашивание буфера и 100 мкл магнитной бусины конъюгированных антител анти биотина 400 мкл. Инкубации при комнатной температуре в течение 15 мин.
    7. Добавить 2 мл окрашивание буфера и использовать столбец MACS LS, в сочетании с магнитом.
    8. Разместите LS столбца на магните и добавьте 1 mL окрашивания буфера. Отказаться от потока через.
    9. Передайте КСДОР подвеска в столбце и собирать четкий поток хотя содержащие Пан моноцитов в новой трубки 15 мл.
    10. Добавьте окрашивание буфера к началу до 5 мл.
    11. Возьмите Алиготе и проверить качество изоляции Моноцит с проточный цитометр.
    12. Определите количество Моноцит Пан.
        Примечание: Только Моноцит население может наблюдаться (рис. 1B).
    13. Центрифуга оставшуюся часть моноциты из шага 5.11.11 при 200 x g за 5 мин.
    14. Выбросите супернатант.
    15. Ресуспензируйте Пелле клеток в 5 мл буфера потока (M199 содержащих 0,5% BSA).
    16. Повторите 5.11.13 для 5.11.14 дважды для устранения следов ЭДТА.
12. Сделать Моноцит приостановления потока буфера (M199 с 0,5% BSA) в 6 х 10⁶ клеток/мл.
13. Сделайте аликвоты 200 мкл моноцитов для каждого набора assay.
14. Держите Алиготе при 37 ° C в инкубаторе до 20 мин перед инъекцией.
15. Добавьте 5 мкл антител анти CD16-PE и Hoechst 33342 (окончательный 2 мкм) для каждого Алиготе.
16. Смешать и инкубировать при 37 ° C за 10 мин.
17. Центрифуга Алиготе на 400 x g 30 s.
18. Отменить супернатант и Ресуспензируйте лепешка с 250 мкл буфера потока.
19. Мкл 30 взвеси Моноцит в одной палате слайд, чтобы служить для настройки параметров получения конфокального микроскопа.
20. Держите аликвоты Моноцит подвеска из шага 5.18 при 37 ° C.
    Примечание: Эта подвеска готова быть введен в системе потока.

6. Подготовка оптимизированных системы

1. Убедитесь, что ячейка инкубатора для изображений на 37 ° C.
   Примечание: Схема потока системы показан на рисунке 2.
2. Соберите трубки часть I: вставьте люэровский коннектор папа один конец кусок силиконовые трубки (8 см длиной и 3 мм толщиной) и подключите другой конец к набору инъекции Luer в линии. Подключите второй Luer к кусок силиконовые трубки (40 см и 3 мм толщиной) на одном конце.
   Примечание: При необходимости 3-ходовой кран, подключенных к шприц 5 мл может быть вставлен между инъекции Luer в линии и силиконовые трубки для возможного воздушного пузыря удаления.
3. Соберите трубки часть II: подключение 20 мл шприц один конец длиной силиконовые трубки (длиной 1 м и толщиной 3 мм). Вставьте люэровский коннектор папа в другой конец трубки.
4. Подключите часть I и часть II труб, вставив разъем мужчины Luer для женского Luer замок автосцепки (рисунок 2A).
5. Положите свободный конец трубки силиконовые в водохранилище, содержащий буфер потока (M199 + 0,5% BSA) нагревают при 37 ° C.
6. Потяните поршень шприца 20 мл для заполнения трубки с потока буфера.
7. Поместите шприц на насос и закрепите его.
8. Установите насос в отказаться режим (в отличие от на настаиваться) и укажите скорость потока.
9. Определите скорость потока согласно IBIDI слайд, используемый с помощью следующей формулы:
   
   Примечание: Слайд фактор зависит от IBIDI слайд, используемый для эксперимента. Для µ слайд я^0,4 люэровского, используемые в этом примере, слайд фактор – 131,6. Для конкретных слайд факторов смотрите веб-сайт компании¹⁴. Вязкость буфера потока является 0,0072 dyn.s/cm². Касательное напряжение на пост капиллярного венулы составляет около 0,5 дин/см².
10. Подключите слайд (рис. 2B):
    1. Зажим силиконовые трубки вокруг женского Luer Lock муфта и отсоедините два самца Luer разъем от стяжку.
    2. Подключите их к водоемам слайд, содержащий стимулировали HUVEC и заполнить с среднего. Избегайте воздушных пузырей во время этого шага.
    3. Снимите зажимы и убедитесь, что подключение не протекает.
11. Поместите слайд под микроскопом для покадровой воображения и запуска насоса.

7. промежуток времени визуализации Моноцит вербовки под потока конфокальная микроскопия

1. Использовать цель 40 x (см. Таблицу материалы) для изображений.
2. Активировать 405 нм (синий Моноцит ядер), 488 нм (зеленый эндотелиальных клеток) и 561 Нм (красный CD16 + подмножество) лазеры.
3. Использование камеры, содержащий моноциты установить параметры приобретения.
   Примечание: Чтобы обнаружить-переселено и переселенных моноцитов, обскуры и интенсивности лазера 405 нм устанавливаются высокие. Таким образом моноциты переселено слегка видны в плане базальной. Однако только переселенных моноциты представляют безупречный район вокруг ядра, соответствующее новое пространство под эндотелиальных клеток.
4. Место камеры, чтобы быть приобретены под микроскопом.
5. Выберите 3 поля представлений в радиусе 1 см для многопозиционных конфокальная томография.
6. Определение базальной и апикального стороны эндотелиальных клеток
7. Установка z стека в диапазоне 10-12 мкм (шаг 0,5 мкм). Запуск промежуток времени приобретения каждые 1 мин.
8. После 3 минут изображений придать 200 мкл суспензии Моноцит (6 x 10⁶ клеток/мл) через порт впрыска Luer в линии.
   Примечание: Быстро моноцитов появляются в апикальной фокальной плоскости, присоединиться и начать трансмиграции (транзит из апикального базальной план).
9. Изображение для по крайней мере 30 минут. После завершения, остановить изображений и остановить поток. Зажим трубы, чтобы отсоединить их от слайда.
10. Исправьте слайд с параформальдегида 4% на 4 ° C на 10 мин.
11. Вымойте слайд с PBS и сохранять слайд на 4 ° C для дальнейшего анализа, если это необходимо.

8. анализ данных с ImageJ

1. Подсчитать количество всего адэрентных моноцитов в каждом поле. Определите количество клеток в мм².
2. Граф переселенных моноцитов, которые присутствуют в плане базальной под эндотелиальных клеток и выявленных наличием черной дыры (в зелёном канале) вокруг ядра.
3. Разделите количество переселенных лейкоцитов на общее количество адэрентных лейкоцитов. Трансмиграции курс представлен в процентном отношении адэрентных моноцитов.
4. Для иллюстрации верхушечный и базальной стороны могут отображаться одновременно чтобы проиллюстрировать событий, происходящих в каждой из этих эндотелиальной отсеков.

Результаты

Определение состояния активации HUVEC индуцированных TNFα

Био активности воспалительных цитокинов TNFα может зависимости пакета и пресыщения цикла замораживания оттаивания. Важно проверить состояние активации HUVEC TNFα лечения. Это может быт...

Обсуждение

Здесь мы приводим метод подробно исследование как Моноцит субпопуляций высыпками через воспаление эндотелия монослоя. Обсудили метод используется confocal микроскопии вместо фазово контрастной микроскопии, который также используется для изучения набора Моноцит под поток³

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tissue Culture Flasks 75 cm2	TPP	90076	Routine culture of isolated HUVEC
µ-Slide VI 0.4	IBIDI	80606
Centrifuge Tubes 15 mL	TPP	191015
Centrifuge Tubes 50 mL	TPP	191050
Collagen G	Biochrom	L 7213	For coating of cell culture flasks
Gelatin	Sigma-Aldrich	1393	For coating of cell culture flasks
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (without MgCl2 and CaCl2)	Sigma-Aldrich	D8537
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (with MgCl2 and CaCl2)	Sigma-Aldrich	D8662
RPMI-1640 Medium	Sigma-Aldrich	R8758
3-Way Stopcocks	BIO-RAD	7328103
penicillin 10,000 μ/mL streptomycine 10,000 μg/mL fungizone 25 μ/mL	AMIMED	4-02F00-H
Collagenase type 1	Worthington	LS004216
Medium 199 1x avec Earle's salts, L-Glutamine, 25 mM Hepes	GIBCO	22340020
Bovine Albumin Fraction V	ThermoFisher	15260037
Endothelial Cell Growth Supplement, 150 mg	Millipore	02-102
Heparin Sodium	Sigma-Aldrich	H3149RT
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H6909
L-Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A 4544
EDTA disodium salt dihydrate C10H14N2Na2O8 · 2H2O	APPLICHEM	A2937.0500
CD144 (VE-Cadherin), human recombinant clone: REA199, FITC	Miltenyi Biotech	130-100-713	AB_2655150
CD31-PE antibody, human recombinant clone: REA730, PE	Miltenyi Biotech	130-110-807	AB_2657280
Anti-Podoplanin-APC, human recombinantclone: REA446, APC	Miltenyi Biotech	130-107-016	AB_2653263
BD Accuri C6 Plus	BD Bioscience
µ-Slide I Luer	IBIDI	80176
CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)	ThermoFisher	C2925
Recombinant human TNFα	Peprotech	300-01A
Recombinant human VEGFA	Peprotech	100-20
NE-1000 Programmable Syringe Pump	KF Technology	NE-1000
Ficoll Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-02
Anti-human CD14-PE, human recombinant clone: REA599, PE	Miltenyi Biotech	130-110-519	AB_2655051
Pan Monocyte Isolation Kit, human	Miltenyi Biotech	130-096-537
Anti-human CD16-PE, human recombinant clone: REA423, PE	Miltenyi Biotech	130-106-762	AB_2655403
LS columns	Miltenyi Biotech	130-042-401
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotech	130-090-976
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	ThermoFisher	H1399
Silicone tubing	IBIDI	10841
Elbow Luer Connector	IBIDI	10802
Female Luer Lock Coupler	IBIDI	10823
Luer Lock Connector Female	IBIDI	10825
In-line Luer Injection Port	IBIDI	10820
Ar1 confocal microscope	Nikon
40x objective	Nikon	40x 0.6 CFI ELWD S Plane Fluor WD:3.6-2.8mm correction 0-2mm
ImageJ Software	NIH