ТРИФОСФАТЫ опосредованной редактирование генома человека грибкового патогена Candida albicans

Резюме

Эффективное генома техники Candida albicans имеет решающее значение для понимания патогенеза и развитию терапевтических средств. Здесь мы описали протокол быстро и точно редактировать с помощью ТРИФОСФАТЫ генома C. albicans . Протокол позволяет следователям представить широкий спектр генетических модификаций, включая точечные мутации, вставок и удалений.

Аннотация

Этот метод описывает эффективного изменения генома ТРИФОСФАТЫ опосредованной диплоидных человека грибкового патогена Candida albicans. ТРИФОСФАТЫ опосредованной генома редактирования в C. albicans требует Cas9, руководство РНК и ремонт шаблон. Плазмиды, выражая дрожжи кодоном оптимизированный Cas9 (CaCas9) был создан. Руководство последовательности прямо вверх по течению от PAM сайта (НЭС) копируются в векторные выражения Cas9. Шаблон ремонт затем производится грунтовка расширение в пробирке. Cotransformation ремонт шаблон и вектора в C. albicans приводит к изменения генома. В зависимости от ремонта шаблон, используемый следователь может ввести нуклеотидов изменения, вставки или удаления. Как C. albicans диплоидные, мутации, сделанные в обе аллели гена, при том условии, что A и B аллелей не гавань SNPs, которые вмешиваться с гидом ориентации или восстановить шаблон включения. Источника гена семей могут редактироваться параллельно, если подходит сохранение последовательности существуют в всех членов семьи. C. albicans ТРИФОСФАТЫ системы, описываемой в окружении FRT мест и кодирует Флиппазы. После индукции Флиппазы антибиотик маркер (CaCas9) и руководство РНК, удаляются из генома. Это позволяет следователю для выполнения последующие изменения в геноме. C. albicans ТРИФОСФАТЫ инструмент мощный грибковых генной инженерии, и незначительных изменений описанные протоколы позволяют модификации других грибковых видов, включая C. glabrata, н. castellii и S. cerevisiae.

Введение

Candida albicans является наиболее распространенных человеческих грибкового патогена^1,2,3. Понимание различий между C. albicans и млекопитающих молекулярной биологии имеет решающее значение для разработки следующего поколения противогрибковой терапии. Это требует детективов, чтобы иметь возможность быстро и точно генетически манипулировать C. albicans.

Генетические манипуляции C. albicans исторически была сложной. C. albicans не поддерживать плазмид, таким образом все конструкции должны быть включены в геноме. Кроме того C. albicans диплоидных; Поэтому когда выбивания ген или введения мутации, важно обеспечить, чтобы обе копии были изменены⁴. Кроме того некоторые C. albicans локусов гетерозиготных, еще более усложняют генетических допроса⁵. Генетически манипулировать C. albicans, это типичный для выполнения нескольких раундов гомологичная рекомбинация⁶. Однако диплоидный характер генома и кропотливого конструкции развития сделали это потенциально утомительный процесс, особенно если несколько изменений не требуется. Эти ограничения и медицинское значение C. albicans требуют разработки новых технологий, позволяющих следователям более легко манипулировать геном C. albicans .

Кластерный регулярно interspaced короткие палиндром повторяется (ТРИФОСФАТЫ)-опосредованной генома редактирования является мощным инструментом, который позволяет исследователям для изменения последовательности генома. ТРИФОСФАТЫ требует трех компонентов: 1) Cas9 Нуклеаза, который расщепляет ДНАО цели, 2) 20 базы руководство РНК, использующий Cas9 последовательность интереса и 3) ремонт шаблон ДНК, что ремонт на сайте расщепления и включает предполагаемого изменения^{7, 8}. Как только руководство приносит Cas9 последовательности генома, Cas9 требует последовательности смежных мотив (PAM) protospacer (НЭС) непосредственно вышестоящего руководства последовательности для расщеплять ДНК⁹. Требование для 20 базового руководства и Пэм последовательности обеспечивает высокую степень ориентации на специфику и ограничивает пробить расщепления.

ТРИФОСФАТЫ системы были разработаны для редактирования геномов набора разнообразных организмов и решать широкий спектр проблем¹⁰. Описанные здесь — это гибкий, эффективный протокол ТРИФОСФАТЫ для редактирования C. albicans ген интереса. Эксперимента вводит стоп-кодон генов, вызывающих прекращение перевода. Другие изменения могут быть сделаны в зависимости от шаблона ремонт, который вводится. Фрагмент, отмеченные nourseothricin (Nat^r) содержащие дрожжи кодон оптимизированный Cas9 (CaCas9) и руководство РНК включена в геном C. albicans на нейтральной территории. Cotransformation с ремонт шаблон кодирования желаемого мутация приводит к ремонт расщепления гомологичная рекомбинация и изменения эффективным генома. Описанные ниже является редактирование TPK2, но все C. albicans открытой чтении кадры могут быть объектом несколько раз ТРИФОСФАТЫ. Система ТРИФОСФАТЫ окружении FRT мест и может быть удален из генома C. albicans индукции Флиппазы, закодированных на выражение плазмида CaCas9. C. albicans ТРИФОСФАТЫ система позволяет следователям точно и быстро редактировать C. albicans генома^11,12.

протокол

1. Идентификация и клонирование руководство РНК последовательности

1. Идентификация руководство РНК последовательности
   1. Определить 5'-НЭС-3' PAM последовательность близко к где будет вставлен стоп-кодон. (Рис. 1A) Помечены все, что Пэм последовательности находятся в первых 100 пар оснований TPK2 (Рисунок 1A).
      Примечание: Руководство последовательности ориентации каждый кадр открытом чтения C. albicans можно найти в http://osf.io/ARDTX ^11,12.
   2. Определить последовательность вперед руководство Primer_3, который будет 20 базы прямо вверх по течению NGG PAM сайта и не будет содержать больше чем 5 Ts подряд. Щелкните левой кнопкой мыши на базе прямо вверх по течению NGG и перетащите курсор 20 базы, затем щелкните левой кнопкой мыши на вкладке грунтовка для добавления в грунт.
   3. Определение последовательности обратный руководство Primer_3, который станет дополнением к вперед руководство последовательности.
      Примечание: Показаны являются направляющими, которые используют PAM_3 (рис. 1B).
   4. Щелкните правой кнопкой мыши грунтовка и выберите «Копировать данные грунт». Вставьте последовательности программы для редактирования текста.
2. Добавьте выступ последовательности вперед и обратить вспять руководство oligos для облегчения клонирования (таблица 1, рис. 1B).
   1. Добавьте нуклеотидной последовательности ATTTG к 5' концу вперед руководство Primer_3 перед покупкой.
   2. Добавление G к 3' концу вперед руководство Primer_3 перед покупкой.
   3. Добавьте нуклеотидной последовательности AAAAC к 5' концу обратный руководство Primer_3 перед покупкой.
   4. Добавление C к 3' концу обратный руководство Primer_3 перед покупкой.
3. Дайджест CaCas9 выражение вектор pV1524 с BsmBI.
   Примечание: pV1524 содержит ампициллин (^rAmp) и nourseothricin (Nat^r) маркеров. Cas9 был кодон оптимизированный для C. albicans.
   1. Дайджест плазмида, добавив: 2 мкг pv1524, 5 мкл 10 x буфер, 1 мкл BsmBI и H₂O до 50 мкл в 1,5 мл. Инкубируйте на 55 ° C в течение 20 минут (в качестве альтернативы, дайджест pv1524 15 мин с Esp3I, isoschizomer BsmBI, при 37 ° C.)
   2. Прохладной комнатной температуре (RT) и спина для 30 s на 2348 x g довести конденсации в нижней части трубки. Перейдите к пункт 1.4 или хранить переваривается плазмида при-20 ° C.
4. Фосфатаза лечить переваривается позвоночника.
   1. Добавить 1 мкл икры кишечной фосфатазы (CIP) в смеси пищеварение и инкубировать при 37 ° C в течение 1 ч.
   2. Очистить переваривается плазмида, использование коммерчески доступных полимеразной цепной реакции (ПЦР) очистки комплект (комплект инструкции) и элюировать в 30 мкл буфера (EB).
5. Фосфорилировать и отжига вперед руководство Primer_3 и обратить вспять Primer_3 руководство.
   1. Добавить 0,5 мкл, 100 мкм вперед руководство Primer_3, 0.5 мкл, 100 мкм вспять руководство Primer_3, 5 мкл 10 x T4 лигаза буфера, 1 мкл T4 полинуклеотид киназы и 43 мкл H₂O для ПЦР-пробирку.
   2. В второй ПЦР-пробирку добавьте 5 мкл 10 x T4 лигаза буфера, 1 мкл T4 полинуклеотид киназы и 44 мкл молекулярной биологии класса H₂O.
      Примечание: Это будет служить в качестве отрицательного контроля.
   3. Инкубируйте реакция смеси в Термоциклер при 37 ° C за 30 мин, затем при 95 ° C за 5 мин.
   4. Прохладный смеси на медленные темпы рамп до 16 ° C для отжига, oligos. Затем поместите смесь отожженная oligo на 4 ° C.
6. Перевязать отожженная oligos в усваивается pv1524 от шага 1.4.3.
   1. ПЦР-пробирку добавить следующее: 1 мкл 10 x T4 лигаза буфера, 0.5 мкл T4 ДНК лигаза, 0.5 мкл отожженная oligo смеси, переваривается, CIP-лечение очищенные плазмид (20 – 40 нг) и H₂O до 10 мкл общего объема.
   2. ПЦР-пробирку добавить следующее: 1 мкл 10 x T4 лигаза буфера, 0.5 мкл T4 ДНК лигаза, переваривается CIP-лечение очищенный вектор (20 – 40 нг), 1 мкл отрицательный контроль смесь, и H₂O до объема 10 мкл.
   3. Инкубировать обеих трубок в Термоциклер на 16 ° C в течение 30 мин, потом на 65 ° C для 10 мин, затем охладите до 25 ° C.
7. Превратите 5 мкл маточных смесей химически сведущее Escherichia coli DH5α с использованием протокола преобразования стандартный тепловой шок. Выберите LB Amp/Nat СМИ (200 мкг/мл АМП, 50 мкг/мл Nat).
   Примечание: Неспособность выбрать pV1524 и его производные на двойной выбор СМИ приведет к потере Nat/CaCas9/руководство модуля путем иссечения ФЛП/FRT бактерий.
8. Очищения плазмиды от четырех трансформантов, алкалический и последовательности вставки последовательность с последовательность праймера (Таблица 1).
   Примечание: Большую часть времени, секвенирование 4 трансформантов достаточно, чтобы определить по крайней мере 1 правильное клонирование.
9. Сохранить плазмиды, которые руководство РНК последовательности, клонированные один раз в BsmBI, вырезать сайта при-20 ° C.

2. Проектирование и создание шаблона ремонт

1. Вставьте стоп-кодон, щелкнув в последовательности гена и добавления нуклеотидов, которые кодируют стоп кодон и ограничение пищеварение сайта (рис. 1 cТаблица 1).
   Примечание: Вставки будет нарушить последовательность PAM.
   Примечание: На сайте пищеварение ограничения будут включены в шаблон последовательности восстановления для облегчения эффективного отбора клонов (рис. 1 c).
2. Нажмите левую кнопку 10 баз по течению где будет производиться мутации и перетащите курсор 60 строит вверх по течению. Щелкните левой кнопкой мыши на вкладке грунтовка для добавления в грунт. Это позволит добавить ремонт шаблон Forward_3. Нажмите левую кнопку 10 основы вверх по течению где будет производиться мутации и перетащите курсор 60 баз вниз по течению. Щелкните левой кнопкой мыши на вкладке грунтовка для добавления в грунт. Это позволит добавить ремонт шаблон обратный 3. (Рис. 1 c)
3. Выполните расширение грунтовка для создания шаблона ремонт.
   1. Добавить 1.2 мкл, 100 мкм ремонт шаблон вперед грунт, 1.2 мкл, 100 мкм ремонт шаблон обратный грунтовки, 6 мкл deoxynucleotide трифосфаты (дНТФ) (всего концентрации 40 мм), 6 мкл буфера, 0,6 мкл Taq-полимеразы (3 шт) и 45 мкл H₂O для каждого из 4 PCR трубы.
   2. Выполните выдвижение праймера, между 20 и 30 раундов ПЦР. Пример расширения условий: 2 мин при 95 ° C, (30 сек при 95 ° C, 1 мин при 50 ° C, 1 мин на 68 ° C) x 34, 10 мин на 68 ° C.
   3. Объединить содержимое всех 4 трубок ПЦР в 1,5 мл трубку и использовать комплект очистки ПЦР для очистки продуктов в 50 мкл H₂O.
   4. Quantitate грунтовка расширение продуктов для обеспечения достаточной ДНК путем определения поглощения на 260 Нм.
      Примечание: Типичный конечная концентрация праймера расширения продукта является ~ 200-300 нг/мкл.

3. преобразование C. albicans с ремонт шаблон и плазмиды

1. Сделайте TE/лития ацетат.
   1. Микс 10 мм трис-Cl, ЭДТА 1 мм, 100 мм ацетат лития и H₂O (все Стоковый раствор pH 7.5) для достижения общий объем 50 мл.
2. Сделать пластина
   1. Смешайте 40% PEG 3350, ацетат лития 100 мм, 10 мм трис-Cl, 1 мм ЭДТА и H₂O (все Стоковый раствор pH 7.5) для достижения общий объем 50 мл.
3. Переварить правильно клонирования плазмиды от шага 1.9.
   1. Добавить 10 мкг плазмида, 4 мкл 10 x буфер, 0.4 мкл 10 мг/мл, бычьим сывороточным альбумином (БСА), 0.5 мкл KpnI, 0.5 мкл SacI и H₂0 до 40 мкл общий объем в 1.5 мл. Инкубируйте при 37 ° C ночь (рис. 1 d).
4. Растут на ночь культуры SC5314 C. albicans , одичал типа prototroph, при 25 ° C в дрожжи Пептон Декстроза дополнена 0.27 мм уридина (YPD + Uri), в идеале ОД₆₀₀ меньше, чем 6.
   1. Пелле 5 ОД₆₀₀ единиц клеток на преобразования, спиннинг на 5 мин на 2348 x g и приостановить 5 ОД₆₀₀ гранулированных клеток в 100 мкл TE/лития ацетат.
5. Добавьте следующее в 1,5 мл трубку в указанном порядке: 1) 100 мкл клеток из шага 3.4.1, 2) 40 мкл вареной и быстро охлаждается спермы лосося ДНК (10 мг/мл), 3) 10 мкг, плазмида пищеварения из шага 3.3.1, 4) 6 мкг очищенный ремонт шаблона и 5) 1 мл пластины.
6. Добавьте следующее в 1,5 мл трубку в указанном порядке: 1) 100 мкл клеток, 2) 40 мкл вареной и быстро охлаждается спермы лосося ДНК (10 мг/мл), 3) H₂O тома равно трансформации ДНК в шаг 3.5 и 4) 1 мл пластины.
   Примечание: Это будет служить в качестве отрицательного контроля.
7. Осторожно перемешать преобразований, закупорить и пусть инкубации при 25 ° C на ночь.
8. Тепловой шок клетки, помещая их в водяной бане 44 ° C 25 мин.
9. Спина за 5 мин на 2348 x g в центрифуге benchtop и удалить супернатант пластины смесь. Мыть раз 2348 x g, добавив 1 мл YPD + Uri и центрифуги снова за 5 мин.
10. Приостановить клетки в 0,1 мл YPD + Uri и инкубировать на роликовых барабан или шейкер при 25 ° C на ночь.
11. Тарелка на YPD + Uri с 200 мкг/мл nourseothricin. Колонии появится в 2 – 5 дней.

4. полосы для одного колоний

1. 100 мм х 15 мм Петри разделить кварталы и этикетки каждого квадранта.
   1. Коснуться одной из колоний от преобразования пластины с стерильных зубочистку или аппликатор и полоса по длинной стороне квадранта.
   2. Полоса для одного колоний, с использованием асептической техники и позволяют колоний расти при 30 ° C в течение 2 дней.

5. Колония PCR

1. Дизайн вперед проверить грунтовка (FCP) ~ 200 пар оснований вверх по течению ограничение сайта, который был представлен и обратной проверки грунтовка (RCP) ~ 300 пар оснований вниз по течению.
   1. Добавление 0,3 мкл FCP, 0,3 мкл RCP, 0,3 мкл термостабильной полимеразы (ExTaq 1.5 единиц), 3 мкл дНТФ (всего концентрации 40 мм), 3 мкл ExTaq буфер, и 23 мкл H₂O в 1,5 мл трубку.
      Примечание: Добавление 0.5 мкл/реакции диметилсульфоксида (ДМСО) могут повысить эффективность ПЦР.
   2. Добавьте 0,25 мкл колонии одного дрожжей из шага 4.1.2 смесь из шага 5.1.1, с помощью кончика пипетки P10 и стараясь не нарушить агар.
   3. Усилить ДНК методом ПЦР и запустить 5 мкл ПЦР на гель для обеспечения усиления является успешным, стараясь не нарушить Пелле клеток в нижней части трубки.

6. ограничение пищеварение колонии PCR

1. Добавить 10 мкл ПЦР продукта (стараясь не не беспокоить Пелле клеток в нижней части трубки), 3 мкл буфера, 1 мкл энзима ограничения, и 16 мкл H₂O, а затем инкубировать согласно инструкции производителя и решить на геле агарозы для определения прав CT изменения генома.
   Примечание: Энзима ограничения, используемые здесь это сайт, закодированные в шаблоне определенного ремонта TPK2 .

7. Сохранение штаммов

1. Растут на ночь культуры из колоний, которые были подтверждены пищеварение ограничения в YPD + Uri при 30 ° C.
2. Добавьте 1 mL культуры и 1 мл 50% глицерина (в результате чего конечная концентрация глицерина до 25%) в трубку, пригодных для хранения при температуре-80 ° C.
3. Хранить правильно клонов-80 ° c.
   Примечание: Правильные штаммы могут храниться при температуре-80 ° C на протяжении многих лет.

8. Удаление Nat^r маркер

1. Правильный transformant полоска на дрожжи Пептон мальтозные (YPMaltose) (2% мальтозы).
2. Выберите колонии с прожилками плиты и культура дрожжей для 48 ч при 30 ° C в жидких мальтоза 20 г/Л YPMaltose.
3. Плита 200 – 400 клеток на YPMaltose 20 г/Л мальтозу и Инкубируйте на 30 ° C в течение 24 ч.
4. Реплицировать пластину на YPMaltose и YPMaltose 200 мкг/мл Nat.
5. Инкубируйте на 30 ° C в течение 24 ч.
   Примечание: Колонии, которые больше не растут на YPMaltose 200 мкг/мл nourseothricin, но растут на YPMaltose потеряли маркер^r Nat (CaCAS9) и руководство РНК.
6. Сохраните штаммов, которые потеряли Nat^r маркер (CaCAS9) и руководство РНК как сделано в шагах 7.1-7.3.
   Примечание: Подобные плазмида, pV1393, использует SAP2 отличие от MAL2 promotor. Рост на СДП-BSA будет вызывать Флиппазы и удаления Nat^r при pV1393 используется для редактирования гена.

Результаты

Последовательности руководство РНК и ремонт шаблоны, которые нацелены C. albicans TPK2, c-AMP киназы каталитическая субъединица, были разработаны в соответствии с руководящими принципами, предложенных выше. Последовательности показаны (Таблица 1, рис. 1). Руководство РНК были клонированы в векторы выражения CaCas9 и cotransformed с ремонт шаблон в одичал тип C. albicans. На сайте пищеварение ограничения экоРи и остановить кодонов в шаблоне ремонт нарушить сайт PAM и содействовать скрининга для правильной мутантов (рис. 1). Трансформантов были прожилками для одного колоний и экранируется колонии PCR и ограничение пищеварение для включения ремонт шаблона (рис. 2). Пищеварение ограничения быстро отличает одичал тип от мутантов последовательности.

Имя олигонуклеотида	Последовательности олигонуклеотида
Primer_3 вперед руководство	ATTTGgggtgaactatttgttcgccG
Обратный Primer_3 руководство	AAAACggcgaacaaatagttcacccC
Ремонт Forward_3 шаблон	tcagcaatatcagcaacaatttcaacaaccgcagcaacaactttatTAAGAATTCggcga
Ремонт Reverse_3 шаблон	attttgtccagtttgggctgcagcagggtgaactatttgttcgccGAATTCTTAataaag
Грунтовка вперед проверить	ttaaagaaacttcacatcaccaag
Обратных проверки грунт	actttgatagcataatatctaccat
Секвенирование грунтовка	ggcatagctgaaacttcggccc

Таблица 1: список oligo нуклеотидов, используемые для этого исследования. Сайты, добавленные для клонирования целей капитализируются и жирным шрифтом в руководстве праймера последовательностей. В шаблоне ремонт последовательности, которые мутировать геномной ДНК капитализируются и жирным шрифтом.

Рисунок 1 : Диаграмма руководство РНК и ремонт дизайн шаблона. (A) обозначать всех последовательностей PAM в первых 100 нуклеотидов TPK2. Пэм последовательность 3 (PAM_3) выделяется, как это последовательность, используемая в этом исследовании. (B) руководство РНК дизайн, с использованием PAM_3. строчная и синий 20 базовых грунты, разработаны с использованием SnapGene. Дополнительные основания, необходимые для клонирования прописных и зеленый показано смещения. (C) ремонт шаблон грунты, которые вставляют TAA стоп-кодон и экори сайт вставляются в TPK2 чтение фрейма. ДНК, которая отличается от дикого типа последовательности красный и прописными буквами. (D) пример как руководство предназначено на позитивные нити ДНК, используя PAM_4. (E) принципиальная схема pV1524 после клонирования руководство РНК и пищеварения с KpnI и SacI. Neut5L-5' и Neut5L-3' цель вектор на Neut5L сайт в геном C. albicans . CaENO1p является promotor, что диски, проявление оптимизирован дрожжей CaCas9. NAT^r является кассеты сопротивления nourseothricin. CaSNR52p является promotor вождения руководство РНК выражение (sgRNA). FRT сайты расщепляется и полноцветного Флиппазы (FLP) удаление ТРИФОСФАТЫ кассета Флиппазы выражение. Схема аналогична (E) был опубликован Vyas и др. ¹¹. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 : Введение и подтверждения стоп-кодон и экори ограничение сайта TPK2. Праймеры для амплификации, перечислены в таблице 1. Одичал типа и мутантов последовательности приведены ниже геля. Эта цифра была изменена Vyas et al.¹¹. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 : Мультфильм описание ремонта шаблонов, которые будут генерировать исключения (A) и (B) вставки. Серый тире в (A) изображают последовательности не присутствует в ремонт шаблон грунтовки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Обсуждение

C. albicans ТРИФОСФАТЫ эффективно редактирует геном C. albicans . pV1524 кодирует дрожжи кодон оптимизированный Cas9 и разработана таким образом, что следователи могут легко клонировать руководство РНК последовательности по течению CaSNR52 промоутер (рис. 1)¹¹. Необходимо обеспечить, что только одна копия руководство последовательности был клонирован в векторы выражения CaCas9 по виртуализации, как дополнительные копии будет препятствовать изменения генома. Если несколько копий руководства представлены последовательно, один следует снизить концентрацию отожженная руководства, используемых в перевязки. Вектор и протокол описал позволяете таргетинга любой C. albicans гена. Хотя C. albicans диплоидный, только одно преобразование требуется целевой обе аллели гена. Кроме того processive характер изменения генома ТРИФОСФАТЫ-CaCas9 позволяет исследователям ориентироваться на нескольких членов семей ген. Многие семьи ген как выделяется аспартил протеазами (ПСП) и агглютининов как последовательности белков (ALS) имеют важное значение для вирулентности C. albicans . Изменения генома ТРИФОСФАТЫ облегчит расследование этих семей ген.

Протоколы, описанные выше ввести стоп-кодон в открытом чтения рамку, результате фенотипические эквивалент null (рис. 2). Широкий спектр генетические изменения могут быть сделаны различные ремонт шаблон. Чушь, Миссенс и молчаливый мутации могут вставляться через рекомбинации с шаблоном соответствующий ремонт. Включение ограничения сайта упрощает transformant скрининг, как те без должны проверяться путем секвенирования^12,13. Кроме того C. albicans ТРИФОСФАТЫ позволяет исследователям для создания вставок и удалений, что делает его идеальной системы для вставки тегов сходства, выполнения активаторных ОСП и создания нокауты (рис. 3). Скрининг для правильного трансформантов для эти мутации более трудоемкий, как это необходимо для последовательности изменения для подтверждения правильного включения шаблонов ремонт. Кроме того Южная помарка может быть необходимо убедиться, что дополнительные копии гена не были вставлены в дополнительных местах расположения в геноме. Требование на сайте NGG PAM места незначительные ограничения на регионы генома, которые могут быть направлены. Разработка альтернативных систем ТРИФОСФАТЫ, что использование альтернативных nucleases таких, как Cpf1 или вариации на системе Cas9 есть/будет облегчить многие из этих ограничений¹⁴. Для следователей знаний в настоящее время эти системы не еще не были применены к C. albicans.

ТРИФОСФАТЫ система, описанная в вышеупомянутый Протокол был разработан таким образом, что он может применяться в самых разнообразных видов, включая Saccharomyces cerevisiae, Naumouozyma castelliiи человеческий патоген Candida glabrata¹¹ . Преобразований и эффективного редактирования этих дрожжей требует незначительные изменения в протоколе описаны, однако рамки для редактирования этих альтернативных геномов удивительно аналогична описанной для C. albicans¹². Кроме того дрожжи обеспечивают отличный механизм для разработки генома редактирования процедур. В дрожжи когда ADE2 мутировал, прекурсор к путь биосинтеза аденин накапливается, поворачивая красный клетки. Это легко наблюдаемых фенотип позволяет следователям для определения измененные клетки и быстро устранять генома, редактирование протоколов. В сочетании с обширной молекулярной биологии элементов, доступных для грибов, протоколы для редактирования многочисленных видов дрожжей были развитыми^15,16. Такое широкое применение генома редактирования технологии в грибов имеет потенциал, чтобы существенно повлиять на широкий спектр научных дисциплин.

ТРИФОСФАТЫ значительно повысило эффективность техники генома в C. albicans, но на сегодняшний день ТРИФОСФАТЫ не были использованы для выполнения генома широкие экраны в C. albicans. Текущие протоколы требуют ремонта шаблон для внедрения мутаций, как nonhomologous конце присоединения путь в C. albicans является неэффективным¹². Поколение oligos ремонт шаблон для каждого гена является существенным барьером для исполнения генома общесистемной экранов. Слияния снижении затрат синтез ДНК и авансов ТРИФОСФАТЫ технологий сделает развитие удаления библиотек более осуществимым. Например выражение шаблона ремонт от вектора CaCas9 прокладывает путь для развития устойчивого плазмида библиотек, которые цели каждый ген¹¹. Кроме того переходные Candida ТРИФОСФАТЫ протоколы, которые не требуют CaCas9 выражение вектор соединяются в геном C. albicans были развитые¹⁷. Кроме того увеличение руководство выражение увеличивает генома редактирования эффективности¹⁸. Эти и другие достижения ТРИФОСФАТЫ технологий, имеют решающее значение для развития всей генома экранов в C. albicans^19,20,,2122.

Геном C. albicans диплоидные, но A и B аллелей не всегда являются идентичными⁵. Такие гетерозиготности обеспечивает как вызовы, так и возможности. Если один стремится нацелены обе аллели, должен использоваться сайт PAM, руководство последовательности и ремонт шаблон, который будет действовать на обе копии гена. Однако в зависимости от единичных нуклеотидных полиморфизмов в ген, ТРИФОСФАТЫ системы C.albicans позволяет следователи Целевой один аллель. Такая точность имеет потенциал, чтобы позволить следователей для изучения функциональных различий между аллелями. Ориентация определенных аллелей должно быть сделано тщательно, как наблюдается потеря гетерозиготности (LOH) на аллель или всей хромосомы. При редактировании одного C. albicans аллелей, один должен изучить смежные последовательности ДНК для определения, если клон поддерживает профиль диплоидных SNP. Кроме того пробить эффекты являются довольно низкими для C. albicans ТРИФОСФАТЫ, но всего генома может рассматриваться для ключевых штаммов.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Agar	BD Bacto	214010
agarose	amresco	0710-500G
Ampicillan	Sigma-Aldrich	A9518
Bacto Peptone	BD Bacto	211677
Bsmb1	New England Biolabs	R0580L
Calf intestinal phosphatase (CIP)	New England Biolabs	M0290L
Cut Smart Buffer	New England Biolabs	B7204S
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
dNTPs	New England Biolabs	N0447L
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	3609
Glacial Acetic Acid	Sigma-Aldrich	2810000ACS
Glucose	BDH VWR analytical	BDH9230
Glycerol	Sigma-Aldrich	49767
Kpn1	New England Biolabs	R3142L
LB-Medium	MP	3002-032
Lithium Acetate	Sigma-Aldrich	517992
L-Tryptophan	Sigma-Aldrich	T0254
Maltose	Sigma-Aldrich	M5885
Molecular Biology Water	Sigma-Aldrich	W4502
NEB3.1 Buffer	New England Biolabs	B7203S
Nourseothricin	Werner Bioagents	74667
Poly(ethylene glycol) PEG 3350	Sigma-Aldrich	P4338
Sac1	New England Biolabs	R3156L
Salmon Sperm DNA	Invitrogen	AM9680
T4 Polynucleotide kinase	New England Biolabs	M0201S
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202L
Taq polymerase	New England Biolabs	M0267X
Tris HCl	Sigma-Aldrich	T3253
uridine	Sigma-Aldrich	U3750
Yeast Extract	BD Bacto	212750
Equipment
Electrophoresis Appartus
Incubator
Microcentifuge
PCR machine
Replica Plating Apparatus
Rollerdrum or shaker
Spectrophotometer
Waterbath