Поведенческие тест батареи для повторные оценки моторных навыков, настроение и познания в мышей

Резюме

Всеобъемлющий поведенческих тест батареи моторики, настроение — включая социальное взаимодействие, депрессии и тревоги — и познание предназначен для повторные оценки связанных с нейродегенеративные поведенческих изменений в мышей.

Аннотация

Фармакологические и токсикологические исследования в нейродегенеративные требуют всеобъемлющего анализа поведения в мышей, потому что моторные дисфункции и расстройств настроения и познания являются общими и часто общие симптомы в нейродегенеративных заболеваний. Здесь показан поведенческих тест батареи для двигателя, настроение и познание, которое может быть повторно проверена в продольное исследование. Эта батарея оценивает общей поведенческой фенотип в мышей, изучив каждый домен поведения с по крайней мере двух независимых общепринятых испытаний (т.е., полевых испытаний и rotarod тест для двигательной функции, тест социального взаимодействия, повышенные плюс лабиринт тест, и вынуждены плавать тест для эмоциональные функции и Моррис водный лабиринт тест и Роман объект признание тест на когнитивные функции). Таким образом этой чувствительной и всеобъемлющий тест батареи является мощным инструментом для изучения поведенческих чередование в нейродегенеративные.

Введение

Нейродегенеративные заболевания Рекомендуемые разрушительные поведенческие симптомы, в том числе когнитивных нарушений, настроение дисфункции, таких как тревога и депрессия или моторные дисфункции¹. Патогенез различных видов нейродегенеративных заболеваний является неясным². Накопительный исследования показывают, что генетические и экологические факторы могут способствовать в патогенезе нейродегенеративных заболеваний. Выявление факторов риска нейродегенеративные требует поведенческого анализа. Хотя каждый тип нейродегенеративные заболевания имеет поведенческие симптом его подписи (например, болезнь Альцгеймера [AD] отличен с когнитивными нарушениями и болезнь Паркинсона [PD] с моторные дисфункции). По мере прогрессирования заболевания пациентов проявляются сопутствующие заболевания различных поведенческих отклонений³. Например объявление больных показывают симптомы дисфункции настроение в продвинутой стадии^4,5. PD пациентов может прогрессировать в PD-связанных деменции и развивать когнитивных нарушений⁶. Опираясь на эти возможности, поведенческого анализа в модели нейродегенеративные обычно всеобъемлющей и неоднократно.

Для достижения этой цели, батарея, которая содержит классические и широко используемых поведенческие тесты с отличным действительность был разработан для поведенческого анализа в мотор, настроение и познания. Мотор функция может быть проверен полевых испытаний^7,8 и ускорения rotarod теста. Настроение дисфункции, включая социальной дисфункции, депрессии и тревожности, наиболее часто видели в нейродегенеративных заболеваний⁵. Следовательно эта батарея включает социального взаимодействия для коммуникабельность⁹, повышенный плюс лабиринт тест тревожности¹⁰и вынуждены плавать теста для депрессии¹¹. Когнитивные нарушения является одним из наиболее характерных симптомов в нейродегенеративных заболеваний, таких как AD и frontotemporal Лобар слабоумия¹². Когнитивная доменов, включая краткосрочную память и эпизодические памяти, подвержены нейродегенеративные^13,14,15. Таким образом Моррис воды лабиринт для пространственного обучения и памяти¹⁶ и Роман объект признание теста для краткосрочной памяти¹⁷ включены в батарею. Эти тесты являются совместимыми друг с другом. Порядок проведения испытаний был разработан чтобы максимизировать привыкания и свести к минимуму вмешательство, для дальнейшего увеличения совместимости внутри батареи. Поскольку каждая функция проверяется по крайней мере две независимые тесты, которые отличаются в принципе и метод, результаты каждого теста может проверяться далее. Кроме того протоколы некоторых тестов будут выделены для повторного тестирования, содействие продольное исследование развития нейродегенеративных заболеваний. Поэтому этот тест батареи поведение исследования различных подобластей поведенческие изменения, видел на различных стадиях нейродегенеративные при калькуляции минимальное количество животных. Эта батарея была использована в продольное исследование, которое оценивается поведенческие изменения в молодых взрослых мышей C57BL/6Н (3-месяц старый) мужчин после респираторных воздействия кремния наночастиц, профессиональных рисков, что является потенциальным фактором риска нейродегенеративные¹⁸. Однако другие штаммы или модели, такие как возрасте мышей и генетически манипулировать мышей, могут вести себя по-разному чем молодых мышей C57BL/6Н. Таким образом предупреждение может потребоваться при использовании эту батарею в этих мышей.

протокол

Все методы, описанные здесь были одобрены Комитетом по использованию Live животных в области преподавания и научных исследований (CULATR), Университет Гонконга.

1. общий протокол

Примечание: Этот раздел основан на диакон¹⁹.

1. Настройка поведения номер
   1. Избавиться от несвязанных стимуляции/дистракции, включая прямые яркий свет на экспериментальный аппарат, запаха, шума и прочих нерелевантных животных, в зале поведенческих (который должен быть около 10 m² с регулируемым освещения и, желательно, иметь прихожей).
      Примечание: Поскольку мышь ночное животное, освещение под 15 люкс в полевых испытаний, Роман объект признание теста и социального взаимодействия тест может свести к минимуму вмешательства/стресс от света и помочь мыши, чтобы сосредоточиться на тест.
   2. Установите камеру для видео-записи по крайней мере 1,5 м выше уровня пола, обеспечивая, что это из виду тестирования мыши.
2. Жилье и привыкания
   1. Группа Дом мышей в подразделение животных под наблюдением (например, Группа жилище не более чем четырех взрослых мышей).
      Примечание: Здесь были использованы 3-месячного самцов мышей C57BL/6Н и размещены в 1144B клетке. Исключает больных, раненых или напряженной мышей. Опыт от голода, жажды или издеваются может повлиять на производительность мыши.
   2. Организовать же дрессировщик проводить поведенческие тесты, чтобы уменьшить изменчивости. Выполнять перевозки, обработки и эксперимент свет цикла с 7:00 до 7:00. Если это возможно организовать все другие обработки, например управление любой наркотиков/токсин (например, интраназальной инстилляции кремния наночастиц) или клетка очистка, после испытания.
   3. Изменить метку клетки с случайных чисел для слепых экспериментатор перед каждой эксперимент. Приучать мышей экспериментальной среды в поведенческих номер для 15-30 мин в их дома клетках. Держите дома клетки в поведенческих комнате в течение всего эксперимента.
   4. Перед началом эксперимента, поставьте nonexperimental C57BL/6Н мыши в аппарат так, что экспериментальный условие для первого мыши является таким же, как и остальные. Затем очистите аппарат следующим образом: удалить моча и фекалии с чистым бумажным полотенцем, очистить экспериментальное устройство с водопроводной водой и затем, охватывают запах левой мышью, вытирая аппарат с бумажным полотенцем, слегка опрыскивают 70% этиловом спирте.
   5. Чтобы свести к минимуму отвлечение, вызванных экспериментатора, попросите экспериментатор поведенческих оставляют во время записи видео, или остаться за кулисами во время Моррис водный лабиринт тест.
3. Поведенческие тест композиция
   1. Организовать поведенческих тестов в том порядке, как показано на рисунке 1A. План для выполнения тестов, растянула на 24 часа, за исключением повышенный плюс лабиринт тест.
      Примечание: Поскольку вся процедура требует до 2 недель, упростите аккумулятор, выбирая среди аналогичных испытаний перед применением в острой или краткосрочные исследования.
      ОСТОРОЖНОСТЬЮ: 2 день полевых испытаний обеспечивает надлежащего привыкание для распознавания теста Роман объекта. Тест, тест принудительного плавания последний, как это может вызвать стресс у мышей C57BL/6Н.

2. BehavioralTest протокол

1. Открыть полевые испытания^8,18,19,20
   1. Выполнение полевых испытаний в 60 см (длина [L]) x 60 см (ширина [W]) x 40 см (высота [H]) непрозрачных белых пластиковых Арена.
      Примечание: Использование нескольких аренах может увеличить пропускную способность теста.
   2. Начать запись камеры и аккуратно положить мышь рядом с середины стены арены, что же на стену. Запись поведение мыши за 10 мин до возвращения домой клетку. Очищайте аппарат, как описано в шаге 1.2.4.
      Примечание: Начальная точка в полевых испытаний также может быть в центре арены. Быть согласованы среди мышей.
   3. Повторяйте, пока все мышей закончить протокол. Уравновесить порядок тестирования между группами.
   4. Анализ данных.
      1. Арена делят на четыре квадрата на четыре квадрата (воображаемая сетка) на экране компьютера. Для оценки функции опорно-двигательного аппарата, подсчитать количество линий, пересек мышью в Арена¹⁹.
         Примечание: Определение «пересечение линией», когда оба задних конечностей крест его. Это определение также применяется к повышенный плюс лабиринт тест.
      2. Замерить время, затраченное в центральном районе в качестве показателя тревоги. Центральная площадь-четырех квадратов в центре арены.
         Примечание: Дополнительные параметры, такие как воспитание (обе передние лапы от земли, с передними лапами против стены или стоя), задержку первого сзади, груминг и и замораживать указывают эмоциональности мыши.
      3. Кроме того используйте отслеживания программного обеспечения, как описано в деталях, Seibenhener Вутен⁸, чтобы измерить расстояние, скорость и время, проведенное в районе центр.
2. Ускорение rotarod испытания¹⁸
   1. Выполните 3 дня обучения ускорения rotarod тестирование перед любой обращения наркотиков или токсина/моделирования/начала заболевания и моторную функцию в 1 день, как и планировалось на рисунке 1A.
      Примечание: Мышь получает три судебных процесса в день во время обучения и тестирования. Каждого судебного разбирательства начинается с вращением стержня и заканчивается с падением мыши.
   2. Место rotarod аппарат на скамейке в зале поведенческих. Избегайте прямого освещения оборудования. Программа оборудования как начиная с 4 об/мин, ускорение до 40 об/мин в течение 5 мин.
   3. В каждом испытании, положите мыши на статические стержень, лицом к стене машины. Запуск устройства, когда мыши поселились. Остановить устройство после того, как мышь падает и записи времени мыши на стержень. Сразу же повторите для еще два испытания прежде чем вернуться домой клетку мыши.
   4. Повторите эту процедуру на другой мышей.
   5. Мера среднее время, затраченное на стержень трех судебных процессов во время испытания для оценки двигательной функции.
      Примечание: Среднее время на стержень в течение третьего дня обучения является базовой двигательной функции.
3. Социальное взаимодействие испытания¹⁸
   1. Для испытания социального взаимодействия, использовать открытое-манеж с двух одинаковых прозрачный камер (8 см [L] x 6 см [W] x 12 см [H]) с отверстиями на поверхности — и Роман мышь (помощник), который является несовершеннолетних считалась того же пола, что имеет не предыдущий контакт с Тема мышь. Рисунок 1B показана схема процедуры. Очистите Арена и камеры, как описано в шаге 1.2.4.
      Примечание: Роман мыши не может быть помёте или клетке Мате предмет мыши. Это здание группа и здоровым. Приучать Роман мыши в поведенческих комнату для 15-30 мин, как описано в шаге 1.2.3.
   2. Отдельно место двух палат в середине двух противоположных стен арены. Ввести тему мышь в арену как описано в шаге 2.1.2 и показано на рисунке 1B, для исследования 3 мин. Вернуться домой клетку предмет мыши и удалите все мочи или кала на арене.
   3. Положите хелпер в одной из палат. Вновь предметом мыши на арену и записывать на 3 мин после возвращения обеих мышей к каждому из их собственного дома клетки. Повторите процедуры с другим предметом мышей, как описано выше.
      Примечание: Противовес стороне помощника или случайным образом назначать в рамках группы.
   4. От видео, оценить параметр, характеризующий деятельность социального взаимодействия мыши как tвспомогательный/т_пустой, что означает отношение времени, взаимодействующих с помощником камеры (t_{вспомогательный}) и пустой один (t_пустой), или использовать признание индекс t_{вспомогательный}/ (т_{вспомогательный} + t_пустой).
      Примечание: Взаимодействие между предметом мыши и камеры определяется как когда нос мыши находится в пределах 2 см камеру и указывающей его.
4. Повышенные плюс лабиринт тест ¹⁰
   1. Проводить повышенный плюс лабиринт тест в тот же день, после всех мышей прошли испытания в открытом поле. Очищайте аппарат, как описано в шаге 1.2.4.
      Примечание: Конфигурации повышенный плюс лабиринт является «+»-форма. Она имеет два распростертыми объятиями (30 x 5 см x 0,5 см) напротив друг друга и перпендикулярно два закрытых оружия (30 x 5 x 16 см) с помощью центра платформы (5 x 5 см x 0,5 см). Лабиринт является повышенный 40 см от земли.
   2. Поместите курсор мыши на стыке открытых и закрытых оружия, стоящих перед открытой рукой, которая находится напротив экспериментатор (рис. 1 c). Запись поведение для 5 минут, прежде чем вернуться домой клетку мыши. Повторите до испытания всех мышей.
      Примечание: Ввод лабиринт с его лицом на открытой руке может увеличить разведки мыши открытой руки.
   3. Измерить время мышь в объятия (_{Открыть}) и в закрытой оружия (t,_{Закрыть}), основываясь на видео: tОткрыть/т_{Закрыть} указывает уровень тревоги.
5. Вынуждены плавать тест¹¹
   1. Аппарат вынуждены плавать теста является цилиндрический резервуар, высотой 30 см и 20 см в диаметре. Заполните резервуар водопроводной водой при комнатной температуре (23-25 ° C) до 15 см.
      Примечание: Использование свежей воды для каждой мыши.
   2. Старт записи видео и аккуратно положить мышь в воде, в центре аппарата. Запись видео на 6 мин перед вводом мыши обратно в свои дома клетке под инфракрасный свет.
      Примечание: Не беспокоить мыши утопления его или скручивания его хвост.
   3. Измерьте время неподвижность в последних 5 минут записанного видео. Мобильность означает любые движения, помимо тех, которые требуются для баланс тела и держать голову над водой.
6. Роман объект признания испытания^17,18
   1. Настройка теста признание Роман объекта включить 2 дня привыкания, 1 день ознакомления и 1 день тестирования (рис. 1 d); Каждая сессия является 10 мин на мышь, и межсессионный интервал составляет 24 часа.
      Примечание: Привыкания, используя открытое поле тест выполняется, как описано в разделе 2.1. Мышь взаимодействует с двух идентичных объектов (старый) в ознакомления. В тесте мыши взаимодействует с одной из старых объектов и новый объект, оба размещены в том же месте объекты в ознакомление. Аппарат Роман объект признание теста включает открытое-Арена и два набора объектов. Каждый набор содержит два идентичных объектов (объекты A и A и объекты B и B). Объекты, A и B, аналогичные по размеру, но различные текстуры (стекло/пластик/бумага), форма (раунд/кубический) и цвет (светлые/темные). Объекты должны быть запаха и достаточно большой для мыши для изучения в течение 10 мин. Соответствующий размер для взрослых мышей C57BL/6Н-8 см высотой и диаметром 5 см широкий/в.
   2. Отметьте позиции двух объектов в ознакомления и тестирования, которые являются 5 см от стороны и 7 см от верхней части арены.
      Примечание: Отметьте положение вечером перед ознакомления, чтобы избежать запаха маркера.
   3. В ознакомление мыши взаимодействует с одним набором одинаковых объектов. Очистите Арена и объектов, как описано в шаге 1.2.4 перед размещением мыши на арене, сталкивается в середине стены, как показано на рисунке 1 d. Запись на 10 минут, прежде чем вернуться домой клетку мыши. Повторяйте, пока не всех мышей закончены и возвращение всех клеток в группе животных.
      Примечание: Противовес объекты, используемые в ознакомления в рамках группы уменьшить предвзятость (например, мыши № 1 и 2 исследовать объекты A и A и мышей № 3 и 4 исследовать объекты B и B; таким образом, Роман объекта является объект B для мышей № 1 и 2 и объект A для мышей нет 3 и 4).
   4. Выполните тест 24 ч после ознакомления. Используйте ту же процедуру для ознакомления, за исключением заменить один из объектов с одним из другого набора (рис. 1 d). Повторяйте, пока все мышей выполнили тест и, потом, возвращение всех клеток в группе животных.
      Примечание: Противовес стороне нового объекта в группе уменьшить предвзятость (например, ввести мышей № 1 и 3 на объекты A и B и мышей № 2 и 4 на объекты A и B). Таким образом объект роман показывает на правой стороне для мышей № 1 и 4 и на левой стороне для мышей № 2 и 3. Левая сторона здесь, в левой части экспериментатор смотря на арене.
   5. Измерьте время, каждая мышь взаимодействует с новый объект (t_новые) и старый объект (t_старый) отдельно, от видео кадры в стадии тестирования. Взаимодействие между животным и объект описан в записке, следующий шаг 2.3.4. Рассчитать памяти мыши как предпочтение Роман объект = tновые/т_старых; или t_новые/ (_Новый t + t_старый).
      Примечание: тновых/т_старый равен 1 или t_новые/ (_Новый t + t_старый) равен 0.5 означает мышь не предпочтение Роман объекта (например, ухудшение памяти). Времени, взаимодействующих с объектами в ознакомление может служить элемент управления эксперимента. Общее время указывает на геологоразведочные работы мыши, и tслева/т_правый предлагает пространственного смещения.
7. Моррис воды лабиринт тест¹⁶
   1. Настройка аппарата следующим образом.
      1. Положите воды лабиринт, круговой пул (120 см в диаметре и глубиной 60 см), в центре поведенческих комнату и отметьте положение лабиринта, чтобы убедиться, что позиция остается неизменной в течение всего эксперимента.
      2. Лабиринт делят на четыре равных мнимой квадрантах. Повесьте визуальные подсказки (например, круг, квадрат, треугольник и Пентагон) в центре каждого квадранта, 130 см над уровнем пола и 53 см от стены лабиринта.
         Примечание: Лабиринт и биток должен оставаться в той же позиции в ходе всего испытания, поэтому мышь может сформировать точной пространственной памяти.
      3. Установите платформу 25 см от стены, в центре четвертого квадранта и отметьте положение. Платформа для мыши — 10 см в диаметре.
         Примечание: Положение и диаметр платформы определяют сложность задачи. Ближе к стене лабиринта, или больше платформы, тем легче это задача.
      4. Заполните водой лабиринт с водой (при температуре 23-25 ° C, окрашены в белый и сделал непрозрачный молочный порошок/еда отбеливания порошок) до тех пор, пока уровень воды находится на 1 см выше, чем платформы. Принести мышей в поведенческих комнату для 15-30 мин привыкания, как показано в шаге 1.2.3 и включите инфракрасный свет над клеток, которые будут использоваться для просушки мышей.
         Примечание: Крышка в верхней части платформы с белой ткани и сетки, что мышь можно легко подняться на него. Убедитесь, что есть нет прямого освещения над водой.
   2. Вести на этапе подготовки следующим образом.
      1. Этап подготовки занимает 5 дней, четыре испытания в день. Полу-случайно организовать отправных точек на каждый день, как показано в литературе¹⁶. Это усилие предотвращает создание ассоциативной памяти, которая является наиболее распространенным способом «обмануть» в тесте мыши.
      2. В начале каждого судебного разбирательства, начать запись видео и аккуратно положить мышь в лабиринте.
         Примечание: Не роняйте мыши в бак и крутить хвостом, который может вызвать дополнительный стресс и дезориентации.
      3. Спросите экспериментатор остаться вне поля зрения мыши и вернуться к вернуть его домой клетку, когда любой из следующих мыши происходит: (i) Мышь не может найти платформу в течение 60 сек; (ii мыши находит платформы в течение 60 s и остается на ней 10 s. В обстоятельство, (i), попросите экспериментатор поместите курсор мыши на платформе, и пусть он остаться там на 10 s.
         Примечание: Пункт (ii) означает, что мышь успешно расположены платформы.
      4. Остановить видео и положить мышь обратно в дом клетке под инфракрасный свет.
         Примечание: Поддержание температуры тела мышей имеет решающее значение для их работы, поскольку гипотермия подчеркивает мышей и может повлиять на следующие тесты.
      5. Повторите процедуру с другой мыши.
      6. На основе видео, запись побег задержку, которая является продолжительность периода мыши тратит в лабиринте, въезд в лабиринте до момента его успешно находит платформы. Если мышь не может найти платформу или остается там менее чем 10 s в 60 s, задержку эвакуации считается 60 s. участок кривой обучения против учебных дней с задержкой средняя бежать в день.
         Примечание: Избежать задержки не включают в себя 10 s тратить на платформе.
   3. Выполнения этапа зонд следующим.
      1. На шестой день Моррис водный лабиринт тест, настройте аппарат, как описано в шаге 2.7.1., взять фотографию лабиринта, чтобы записать позицию платформы, а затем удалить платформу из бака.
      2. Начать запись видео и аккуратно положить мышь в лабиринте в квадранте раскосно напротив квадрант целевой.
      3. Попросите экспериментатор остаться вне поля зрения мыши во время записи видео 1 мин. Потом есть экспериментатор взять мыши из лабиринта и положил его обратно в дом клетке.
      4. Используйте изображение, полученное на шаге 2.7.3.1. в качестве эталона для измерения длительности пересечения любой платформы. Время продолжительности мыши остается в целевом квадранте (t_{целевой}), согласно видео. Общее время — t_всего. Измерьте предпочтение целевой квадрант как t_{целевой} общая/t_всего.

Результаты

Эта батарея поведенческих тест был разработан для всеобъемлющей и действительный поведенческого анализа мотор, настроения и познания, которые часто затрагиваются в нейродегенеративные⁵. Мы применили этот аккумулятор для изучения поведенческих изменен?...

Обсуждение

Поведенческий анализ мышей имеет решающее значение для нейродегенеративные исследований. В то время как когнитивная функция часто является наиболее восприимчивы домен поведения пострадавших в нейродегенеративных заболеваний, настроение дисфункции, такие как депрессия и тревога, ча...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
chambers in social interaction test	home made		(8 cm (L) x 6 cm (W) x 12 cm (H)), transparant with holes, plastic
cylindrical tanks used in forced swimming test	home made		30 cm height, 20 cm diameters, glass
elevated plus maze	home made		open arms (30 cm x 5 cm x 0.5 cm) ,closed arms (30 cm x 5 cm x 16 cm), center platform (5 cm x 5 cm x 0.5 cm), 40 cm tall. Plastic, nontransparant
IITC Roto-Rod Apparatus	IITC life science Inc.	755, series 8
open field arena	home made		60 cm (L) x 60 cm (W) x 40 cm (H), plastic, nontransparant
water maze	home made		120 cm in diameter, 60 cm deep, steel