АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Успех эксперимента кристаллографии времени решены серийный Фемтосекундный зависит от эффективного образца доставки. Здесь мы описываем протоколы для оптимизации экструзионных бактериородопсин микрокристаллов от инжектора микро экструзии высокой вязкости. Методология опирается на пример гомогенизации с Роман трехходовой стяжки и визуализации с помощью высокоскоростной камеры.

Аннотация

Высокой вязкости микро экструзии инжекторы резко сократили потребление образца в серийный Фемтосекундный кристаллографических экспериментов (SFX) на свободных электронах рентгеновских лазеров (XFELs). Далее ряд экспериментов с использованием света driven протонного насоса бактериородопсин создали эти форсунки в качестве предпочтительного варианта доставить кристаллы для кристаллографии (TR-SFX) время решена серийный Фемтосекундный решить структурные изменения белки, после photoactivation. Чтобы получить несколько структурных снимки высокого качества, важно для сбора больших объемов данных и обеспечить Распродажа кристаллов между каждый насос лазерного импульса. Здесь мы подробно описать, как мы оптимизировали экструзии бактериородопсин микрокристаллов для нашей недавно TR-SFX экспериментов в Linac последовательной источник света (ССК). Цель метода – оптимизировать экструзии для стабильного и непрерывного потока при сохранении высокой плотности кристаллов для увеличения скорости на которых данные могут быть собраны в TR-SFX эксперимент. Мы достичь этой цели путем подготовки липидный кубической фазы с равномерное распределение кристаллов с помощью Роман трехходовой шприца сцепного устройства, затем регулируя состав образец, основанный на инструментальных замерах стабильности экструзии, с высокоскоростной установки камеры. Методология может быть адаптирована для оптимизации потока микрокристаллов других. Установка будет доступна для пользователей данного объекта Новый швейцарский бесплатно электронах.

Введение

Серийный Фемтосекундный кристаллографии (SFX) является структурной биологии техника, которая использует уникальные свойства свободных электронах рентгеновских лазеров (XFEL) для определения структуры комнатной температуре от тысячи микрометра размера кристаллов при опережающего большую часть излучения ущерб «дифракционный до разрушения» принцип1,2,3.

В времени решены расширение SFX (TR-SFX) фемтосекундных импульсов от XFEL используются для изучения структурных изменений в белки4,5. Протеин интереса активируется с оптического излучения (или другого действия триггера) накануне расстрела XFEL в установки насоса зонд. Точно управляя задержку между насоса и датчика импульсов, целевого белка могут быть захвачены в разных государствах. Молекулярные фильмы структурных изменений за одиннадцать порядков в время продемонстрировать мощь новых источников XFEL для изучения динамики нескольких белка цели6,,78,9, 10,11,12,13. Главным образом метод присоединяется к динамической спектроскопические и статические структурные методы в одну, обеспечивая мельком динамики белков в вблизи атомных резолюции.

Простые системы для TR-SFX может содержать эндогенного триггера активации с фото чувствительных компонентов, как сетчатки в бактериородопсин (bR)9,10, хромофоры фотосистемы II12,13, фотоактивного желтый белка (Рур)6,7 обратимо фотопереключаемых флуоресцентный белок11, или окиси углерода photolyzable в миоглобина8. Захватывающие вариации техника все еще в развитии полагаться на смеси и внедрить схемы14,15 для изучения ферментативных реакций или электрического поля используется, чтобы вызвать структурные изменения16. Учитывая, что XFEL источники были доступны лишь на несколько лет и экстраполяции прошлых успехов в будущем, метод показывает потенциал как реальная игра чейнджер в отношении нашего понимания того, как функция белков.

Поскольку биологические образцы уничтожаются путем одного контакта с высокой мощности XFEL пульс, необходимы новые подходы к кристаллография протеина. Среди этих процедур способность расти большое количество единообразных микрокристаллов необходимо развитых17,18,19. Чтобы включить сбор данных на XFEL, эти кристаллы должны доставлено, отбрасываются и затем вновь для каждого импульса XFEL. Учитывая, что XFELs огонь полезная импульсов на 10-120 Гц, поставки образца должны быть быстрой, стабильной и надежной, сохраняя также кристаллы нетронутыми и ограничения потребления. Среди наиболее успешных решений — инжектор микро экструзии высокой вязкости, который обеспечивает непрестанно потокового столбца комнатной температуре кристалл Ладена липидный кубической фазы (LCP) через импульсного рентгеновского луча20. Случайным образом ориентированных кристаллах, внедренной в поток LCP, которые перехватываются XFEL импульсов точечных рентгеновских лучей на детектор, где записывается дифракционный рисунок. LCP был естественным выбором для доставки средних образца, как часто используется как средство роста для мембранных белков кристаллы17,21,22,23, еще других высоковязких перевозчик СМИ 24,25,26,27,28,,2930 и31 растворимые белки также были использованы в инжектор. Во время определения структуры мембранных белков13,32 G белка-рецепторы (GPCR)33,34, в том числе успешно SFX с высокой вязкостью инжектор 35,,3637, с качеством данных, достаточных для родной фазирования38,39 во время как время, так и примеры эффективной. В настоящее время, эти форсунки более регулярно используются для измерения комнатной температуры в синхротрона источников28,30,40,41 , а также в ходе более технически требуя TR-SFX эксперименты в XFELs9,10,13,42.

Сопоставимых TR-SFX эксперименты проводились с использованием других типов инжектор как жидкой фазы доставки в потоке сосредоточены сопла6,7,12, однако, этот метод требует белка суммы не доступны для многих биологически интересных задач. Для определения статического структур с использованием вязких экструзии среднее потребление 0,072 мг белка на 10000 индексированных дифракционные текстуры по сравнению с 9.35 mg для Жидкоструйный насадки были зарегистрированы (то есть, около 130 раз больше образца эффективное)20. Высокая вязкость инжектор было показано, быть жизнеспособными образца доставки устройство для TR-SFX пока только жертвуя некоторые из этого образца эффективности43. В Ногли et al. (2018)10, например, образец потребления был около 1,5 мг на 10000 индексированных шаблонов, который выгодно отличается от аналогичных TR-SFX экспериментов с использованием PYP, где потребление среднего образца была значительно выше, с 74 мг белка на 10 000 индексированные моделей6. Высокая вязкость инжекторов таким образом имеют явные преимущества при ограничении количества белка доступны или когда кристаллы выращивают непосредственно в LCP.

Для TR-SFX с использованием высокой вязкости Инжекторы для получения наиболее достоверных данных несколько технических вопросов необходимо решать: скорость потока должна оставаться выше минимального критического значения; хит ставка должна поддерживаться на уровне, который не отображают медленно сбора данных (например, более чем на 5%); и образец должен быть доставлен без чрезмерных потрясений. В идеале, уже выполнены эти условия задолго до запланированного TR-SFX эксперимент, чтобы максимально эффективно использовать имеющееся время XFEL. Pricipally, замедление в потоке LCP может позволить зондирующего кристаллов, которые были активированы с более чем одной оптической лазерного импульса и результат в смешанных активных государств, или зондирования перекачиваемого материала, когда материал umpumped ожидается в пучке. Дополнительное преимущество инъекций предварительного тестирования, что время простоя во время сбора данных на XFEL свернуто как время отводится для замены засоренные сопла, изменения не прессовать образцы, и другие задачи обслуживания уменьшается.

Здесь мы представляем способ оптимизировать поставки образца для TR-SFX сбора данных с высокой вязкостью микро экструзии инжектор. Для простоты описанных методов не полагайтесь на доступ к источнику рентген, хотя работа Синхротронное излучение29 представит дополнительную информацию на ожидаемые хит ставки и кристалл дифракции. Наши протоколы были разработаны для оптимизации эксперименты для захвата сетчатки изомеризации в Протон насос бактериородопсин10 и осуществляется в два этапа, начиная с подготовки образцов кристалл для экструзии, следуют контроля экструзии с помощью высокоскоростной камеры установки. На первом этапе кристалл Ладена LCP смешивается с дополнительные LCP, низкой перехода температуры липиды или другие добавки, чтобы убедиться, что окончательный смесь подходит для доставки в демонстрационной среде без забивания или замедления. Новый шприц трехходовой стяжку был разработан для улучшить однородность смешивания производительности и образца. Второй этап состоит из теста экструзии, записанная с помощью высокоскоростной камеры непосредственно измерить стабильность скорости экструзии. После анализа видео данных можно внести изменения протокола Подготовка образца для улучшения экспериментальных результатов. Эти процедуры могут быть адаптированы для подготовки других белков TR-SFX сбора данных, с минимальными изменениями и будет способствовать эффективному использованию ограниченных XFEL beamtime. С новой XFEL зал просто начиная44,их эксплуатации45 и передачи последовательных данных, основанных на инжектор методов сбора synchrotrons28,30,40,41 , в ближайшие несколько лет несомненно будет продолжать оказывать захватывающее новое понимание структурной динамики все более широкий спектр белковых мишеней.

протокол

1. белки кристалл пробоподготовки

  1. Около 30 минут, прежде чем образец должен быть введен, нагрузка 50 мкл кристалл Ладена monoolein на основе LCP в 100 мкл шприца.
  2. Для инъекций при атмосферном давлении: нагрузки 10 мкл жидкий парафин в задней части второго шприца. Держа шприц вертикально, высылать пузырьков воздуха из шприца.
    1. Для инъекций в вакуумной среде: нагрузка 5 мкл MAG 7,9 и 5 мкл жидкий парафин в задней части второго шприца. Держа шприц вертикально, высылать пузырьков воздуха из шприца.
  3. Подключите шприц с парафином/MAG 7.9 в стяжкой Стандартный шприц, очищать воздух от стяжку, осторожно нажимая на поршень до небольшой объем (< 1 мкл) парафин/липидов виден на кончике иглы стяжку.
  4. Соединить образца шприц шприц стяжку, заботясь, чтобы не вводить каких-либо воздуха в выборку. Смесь липидов/парафин, передав образец материала через стяжка несколько раз.
  5. Загрузите 20 мкл готовые LCP (27% PEG, 100 мм Соренсен рН 5,6 + MO) в другой шприц 100 мкл. Удаление пузырьков воздуха при необходимости.
  6. Удалите пустой шприц из стяжку и придаем готовые LCP кристалл, содержащие шприц, используя стандартный шприц стяжку. Передайте образец в стяжкой 100 раз.
    Примечание: Образец смешивания может нагреть образца слегка46. Смешивание должно осуществляться медленными темпами где температура образца могут быть проведены достаточно постоянным.
  7. Проверьте образец для прозрачности против источника света. Если сформировалась четко однородной LCP, перейдите к шагу 1.9.
  8. Для приведения примера в кубической фазы, 3 мкл monoolein и смешать 50 раз (как описано выше). Повторите эту процедуру, только до тех пор, пока прозрачной фаза сформировала избежать избытка monoolein.
    Примечание: Формирование LCP температуры зависит от47 и наилучшие результаты достигаются чуть выше 20 ° C. Количество дополнительных monoolein необходимо будет зависеть от объема остаточного осадителя раствора, перенесенных из кристаллизации.
  9. Как предварительный тест для образца жесткость (как ожидалось от LCP фазу) и выдавить способности, отсоедините пустой шприц из шприца стяжку и, держа шприц вертикально, выдавить небольшое количество образца (< 2 мкл) через стяжку. Если экструдированные образца образует вертикальный цилиндр, образец готов для тестирования экструзии.
  10. Отрегулируйте общий объем выборки 100 мкл, добавив более готовые LCP (как в шаге 1.5).
  11. Придаем образца шприц и две пустые шприцы трехходовой шприц стяжку (очистка воздуха от стяжки как раньше). Смешайте по крайней мере 50 раз (или до однородной) путем передачи половины образца в втором шприц и затем нажав обе половинки образца в третьем шприц одновременно.
  12. Поместите шприц, содержащего смешанный образец под микроскопом стерео для проверки равномерное распределение кристаллов.

2. Тестирование образца экструзии с помощью высокоскоростной камеры установки

  1. Определение экспериментальных параметров.
    1. Выберите размер сопла для теста.
      Примечание: Размеры сопла, как правило, 50 или 75 мкм внутренний диаметр (ID), но любой размер примерно 30-100 мкм, что ID могут быть рассмотрены. Выбор основан на баланс между среднее время засорения, фон рассеяния, образец потребления и хит скорость.
    2. Расчет оптимального потока скорость на основе размера экспериментальных лазерного пятна (диаметр2 1/e) и схема сбора данных (например, чередующиеся светлые и темные) который будет использоваться в XFEL.
    3. Вычислить требуемый расход (figure-protocol-3642) образца от оптимального потока скорость (figure-protocol-3750) и выбранную насадку диаметром (figure-protocol-3848):
      figure-protocol-3919
      Определить скорость потока (figure-protocol-4016), должны быть введены в насос ВЭЖХ, основанный на коэффициент усиления (figure-protocol-4154) инжектора.
      figure-protocol-4235
      Вычислить максимальное давление (figure-protocol-4337) от номинального давления сопла фитинги (figure-protocol-4444) и коэффициент усиления инжектора (figure-protocol-4545):
      figure-protocol-4618
  2. Установка высокой вязкости экструзии инжектор для автономного использования, как показано на рисунке 1.
    Примечание: Инжектор функции с помощью гидравлические экструзионные руководствовался ВЭЖХ насос и используется совместно течет оболочка газ гелий контролируется регулятором газа. Насос и регулятор установки не обсуждаются в настоящем Протоколе. Смотрите главу 4 в Джеймс (2015)48 для подробного руководства.
    1. Очистить насос и все линии воды обеспечить подачу точны. Очистите стадии гидравлические форсунки.
    2. Смонтируйте инжектор (или камера) на сцене три оси для облегчения разработки и фокус для высокоскоростной видео. Оставьте пространство вокруг точки инъекции для объектива, освещение, Светоотражающий экран и небольшой стакан поймать отработанного образца.
    3. Строить «Макетные сопла» (пустой резервуар с насадкой прилагается) и установить его на инжектор для облегчения позиционирования, фокус и освещение.
    4. Подключите высокоскоростной камеры с кончик насадки вблизи координационным центром цели.
    5. Расположите Светоотражающий экран позади форсунки и отрегулировать освещение для фронт свет сопла.
    6. Включите и подсоедините к камере с помощью прилагаемого программного обеспечения. С живой видео работает для визуальной обратной связи расположите кончик насадки в центре кадра и привести его в фокус с этапа 3 оси.
    7. Отрегулируйте освещение до сопла отчетливо видна и фон равномерно освещенные.
  3. Настройка камеры записывать высокоскоростной покадровой видео.
    1. Набор кадров до 1000 fps. Установите разрешение 512 x 512 пикселей.
    2. С временем экспозиции, теперь установленные частоты кадров, отрегулируйте уровень освещенности до сопла является видимым (то есть, не под- или переэкспонированных). Переместите кончик насадки, чтобы он центрируется слева направо и расположен в верхней трети кадра.
    3. Запуск любой фон коррекции или баланс белого операций.
    4. Установка камеры в режиме покадровой. Установить интервал для 30 s и повторяется до 40 раз, установите режим триггера для случайных (или случайного сброса) и введите количество кадров для записи до 1000.
  4. Загрузить резервуар с 20 мкл испытуемого образца и Прикрепите насадку капилляров.
  5. Прикрепите заполненный резервуар на форсунку. Прикрепите газопровода к порту на насадку и начать газового потока.
  6. Вручную заранее поршень, открыв клапан в строку и нажав шприца. Закройте клапан, когда поршень делает твердых контакт с образцом в водохранилище.
  7. Программа насос с вычисляемые и установите максимальное давление рассчитанное значение (см. шаг 2.1.3).
  8. Одновременно запустите насос и записи камеры.
  9. Как выдавливание начинается, отрегулируйте давление газа для повышения стабильности. Увеличение давления газа, если жидкость образуется падение на кончике сопла вместо столбца. Снижение давления при экструзии нарушается из-за чрезмерного сдвига от газового потока, или быстро осциллируя (взбивания).
  10. Контролировать экструзии (10 мин, как правило, достаточно, чтобы признать условие однородный поток) и, когда давление насоса резко сползает вблизи ожидаемого окончания времени, остановить запись, выключите насос, вентиляционные системы давления, открыв предохранительный клапан.
  11. Анализ видео файлов
    Примечание: Образец экструзии, которая является явно неадекватным не требует подробного анализа. Однако это все еще полезно для определения режима сбоя, чтобы образец может быть оптимизирован.
    1. Откройте видео файл с программного обеспечения для анализа (например, Фиджи49) и калибровки средств измерения.
    2. Калибровку измерений, выбрав линию известной длины видео изображения с помощью инструмента выделения строки. Откройте окно Задать масштаб через анализ | Задать масштаб и введите известные расстояние и единицы измерения.
      Примечание: Известный диаметр сопла обеспечивает адекватные калибровки длину для этих измерений.
    3. Искать кадр в видео где есть функция отслеживаются видимым (например, кристалл) экструзии. Запишите номер кадра.
    4. Заранее видео в кадр, где же функция видна, но переехал со своей позиции на предыдущем шаге. Запишите номер кадра.
    5. Используя средство измерения прямой линии, измерьте расстояние от функция начальную и конечную точку через анализ | Мера.
      Примечание: Больше отслеживаются расстояние меньше ошибок в измерении будет влиять на расчеты
    6. Вычислить скорость струи от измеренного расстояния и время, затраченное (количество затраченного кадров, разделенных кадров).
    7. Повторите шаги 2.11.3-2.11.6 несколько раз для каждого сегмента видео.
    8. Построение рядов данных, как показано на рисунке 2.

Результаты

Высокой плотности микрокристаллов, включены в вязкой перевозчика среднего для инжектора идеальным исходным материалом для выполнения процедур, описанных здесь (рис. 3). Процедура требует около 50 мкл кристалл Ладена перевозчика для каждого приготовлен...

Обсуждение

TR-SFX метод с вязкой экструзии инжектор оказалась жизнеспособной техники для исследования структурной динамики бактериородопсин9,10 и фотосистемы II13 и теперь, похоже, готов для изучения белков, вождение другие биологические процессы фото как ...

Раскрытие информации

Авторы заявляют не конфликтующие интересы.

Благодарности

Мы признаем Гебхард Шертлера, Рафаэль Абела и Крис Milne для поддержки использования высокой вязкости инжекторов в PSI. Ричард Neutze и его команда признаны для обсуждения времени решены Кристаллография и поставки образца с помощью форсунок высокой вязкости. Для финансовой поддержки, мы признаем, Швейцарский Национальный научный фонд для грантов 31003A_141235, 31003A_159558 (для и.с.) и PZ00P3_174169 (для п.н.). Этот проект получил финансирование от Европейского союза Horizon 2020 исследований и инновационной программы под Грант Мари-Склодовская-Кюри соглашение № 701646.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Mosquito LCP Syringe CouplingTTP labtech store3072-01050
Hamilton Syringe 1710 RNR, 100 µlHamiltonHA-81065
Hamilton Syringe 1750 RNR, 500 µlHamiltonHA-81265
MonooleinNu-Chek Prep, Inc.M-239
7.9 MAGAvanti Polar Lipids Inc.850534O
50% w/v PEG 2000Molecular DimensionsMD2-250-7
Paraffin (liquid)Sigma-Aldrich1.07162
High speed cameraPhotronPhotron Mini AX
High magnification lensNavitar12X Zoom Lens System
Three axis stageThorLabsPT3/M
Fiber lightThorlabsOSL2
Fused silica fiberMolex/PolymicroTSP-505375
Lite touch ferruleIDEXLT-100
ASU high viscosity injectorArizona State UniversityPurchasable from Uwe Weierstall (weier@asu.edu)
HPLC pumpShimadzuLC-20AD
Electronic gas regulatorProportion AirGP1

Ссылки

  1. Neutze, R., Wouts, R., van der Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses. Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).
  2. Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
  3. Barty, A., et al. Self-terminating diffraction gates femtosecond X-ray nanocrystallography measurements. Nature photonics. 6 (December), 35-40 (2012).
  4. Aquila, A., et al. Time-resolved protein nanocrystallography using an X-ray free-electron laser. Optics express. 20 (3), 2706-2716 (2012).
  5. Panneels, V., et al. Time-resolved structural studies with serial crystallography: A new light on retinal proteins. Structural Dynamics. 2 (4), 041718 (2015).
  6. Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
  7. Pande, K., et al. Femtosecond structural dynamics drives the trans/cis isomerization in photoactive yellow protein. Science (New York, N.Y.). 352 (6286), 725-729 (2016).
  8. Barends, T. R. M., et al. Direct observation of ultrafast collective motions in CO myoglobin upon ligand dissociation. Science (New York, N.Y.). 350 (6259), 445-450 (2015).
  9. Nango, E., et al. A three-dimensional movie of structural changes in bacteriorhodopsin. Science. 354 (6319), 1552-1557 (2016).
  10. Nogly, P., et al. Retinal isomerization in bacteriorhodopsin captured by a femtosecond x-ray laser. Science. 0094 (June), (2018).
  11. Coquelle, N., et al. Chromophore twisting in the excited state of a photoswitchable fluorescent protein captured by time-resolved serial femtosecond crystallography. Nature Chemistry. 10 (1), 31-37 (2017).
  12. Kupitz, C., et al. Serial time-resolved crystallography of photosystem II using a femtosecond X-ray laser. Nature. , (2014).
  13. Suga, M., et al. Light-induced structural changes and the site of O=O bond formation in PSII caught by XFEL. Nature. 543 (7643), 131-135 (2017).
  14. Stagno, J. R., et al. Structures of riboswitch RNA reaction states by mix-and-inject XFEL serial crystallography. Nature. 541 (7636), 242-246 (2017).
  15. Wang, D., Weierstall, U., Pollack, L., Spence, J. C. H. Liquid Mixing Jet for XFEL Study of Chemical Kinetics. Journal of synchrotron radiation. , 1364-1366 (2014).
  16. Hekstra, D. R., White, K. I., Socolich, M. A., Henning, R. W., Šrajer, V., Ranganathan, R. Electric-field-stimulated protein mechanics. Nature. 540 (7633), 400-405 (2016).
  17. Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Nature. 9 (9), 2123-2134 (2014).
  18. Kupitz, C., Grotjohann, I., Conrad, C. E., Roy-Chowdhury, S., Fromme, R., Fromme, P. Microcrystallization techniques for serial femtosecond crystallography using photosystem II from Thermosynechococcus elongatus as a model system. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 369 (1647), (2014).
  19. Falkner, J. C., et al. Generation of Size-Controlled, Submicrometer Protein Crystals. Chemistry of Materials. 17 (10), 2679-2686 (2005).
  20. Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nature communications. 5, 3309 (2014).
  21. Landau, E. M., Rosenbusch, J. P. Lipidic cubic phases: a novel concept for the crystallization of membrane proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (December), 14532-14535 (1996).
  22. Caffrey, M. A comprehensive review of the lipid cubic phase or in meso method for crystallizing membrane and soluble proteins and complexes. Acta Crystallographica Section F Structural Biology Communications. 71 (1), 3-18 (2015).
  23. Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Current Opinion in Structural Biology. 21 (4), 559-566 (2011).
  24. Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. IUCrJ. 2 (4), 421-430 (2015).
  25. Sugahara, M., et al. Hydroxyethyl cellulose matrix applied to serial crystallography. Scientific Reports. 7 (1), 703 (2017).
  26. Sugahara, M., et al. Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography. Nature Methods. 12 (1), 61-63 (2014).
  27. Sugahara, M., et al. Oil-free hyaluronic acid matrix for serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 6 (1), 24484 (2016).
  28. Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (2), 387-397 (2015).
  29. Kovácsová, G., et al. Viscous hydrophilic injection matrices for serial crystallography. IUCrJ. 4 (4), 400-410 (2017).
  30. Martin-Garcia, J. M., et al. Serial millisecond crystallography of membrane and soluble protein microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 4 (4), 439-454 (2017).
  31. Fromme, R., et al. Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase. IUCrJ. 2, 545-551 (2015).
  32. Caffrey, M., Li, D., Howe, N., Shah, S. T. A. "Hit and run" serial femtosecond crystallography of a membrane kinase in the lipid cubic phase. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 369 (1647), 20130621 (2014).
  33. Liu, W., et al. Serial femtosecond crystallography of G protein-coupled receptors. Science (New York, N.Y.). 342 (6165), 1521-1524 (2013).
  34. Zhang, H., et al. Structure of the Angiotensin Receptor Revealed by Serial Femtosecond Crystallography. Cell. 161 (4), 833-844 (2015).
  35. Fenalti, G., et al. Structural basis for bifunctional peptide recognition at human δ-opioid receptor. Nature Structural & Molecular Biology. (February), (2015).
  36. Kang, Y., et al. Crystal structure of rhodopsin bound to arrestin by femtosecond X-ray laser. Nature. 523 (7562), 561-567 (2015).
  37. Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. Journal of Visualized Experiments. 9 (115), 2123-2134 (2016).
  38. Batyuk, A., et al. Native phasing of x-ray free-electron laser data for a G protein-coupled receptor. Science Advances. 2 (9), e1600292 (2016).
  39. Nakane, T., et al. Native sulfur/chlorine SAD phasing for serial femtosecond crystallography. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (12), 2519-2525 (2015).
  40. Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 2 (2), 168-176 (2015).
  41. Weinert, T., et al. Serial millisecond crystallography for routine room-temperature structure determination at synchrotrons. Nature Communications. 8 (1), 542 (2017).
  42. Tosha, T., et al. Capturing an initial intermediate during the P450nor enzymatic reaction using time-resolved XFEL crystallography and caged-substrate. Nature Communications. 8 (1), 1585 (2017).
  43. Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase injector is a viable crystal delivery system for time-resolved serial crystallography. Nature Communications. 7, 12314 (2016).
  44. Abela, R., et al. Perspective: Opportunities for ultrafast science at SwissFEL. Structural Dynamics. 4 (6), 061602 (2017).
  45. Marx, V. Structural biology: doors open at the European XFEL. Nature Methods. 14 (9), 843-846 (2017).
  46. Cheng, A., Hummel, B., Qiu, H., Caffrey, M. A simple mechanical mixer for small viscous lipid-containing samples. Chemistry and Physics of Lipids. 95 (1), 11-21 (1998).
  47. Qiu, H., Caffrey, M. The phase diagram of the monoolein/water system: Metastability and equilibrium aspects. Biomaterials. 21 (3), 223-234 (2000).
  48. James, D. . Injection Methods and Instrumentation for Serial X-ray Free Electron Laser Experiments. , (2015).
  49. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  50. Moffat, K. Femtosecond structural photobiology. Science (New York, N.Y.). 361 (6398), 127-128 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

144eletron

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены