Method Article
Этот протокол описывает, как вызвать дифференциацию M-клеток в стволовых клетках человека полученных илеальных монослойных и методов для оценки их развития.
M (микросклад) клетки кишечника функционируют для транспортировки антигена из апикального проема в основные патчи Пейера и ламинальные проприии, где находятся иммунные клетки, и, следовательно, способствуют слизистой оболочке иммунитета в кишечнике. Полное понимание того, как M клетки дифференцировать в кишечнике, а также молекулярные механизмы поглощения антигена M клеток не хватает. Это потому, что M клетки являются редкой популяции клеток в кишечнике и потому, что в пробирке модели для M клеток не являются надежными. Открытие самообновляющейся системы культуры стволовых клеток кишечника, называемой энтероидами, дало новые возможности для культивирования Клеток М. Энтероиды являются выгодными по сравнению со стандартными культивированными клеточными линиями, потому что они могут быть дифференцированы на несколько основных типов клеток, найденных в кишечнике, включая клетки кубок, клетки Панета, энтероэндокринные клетки и энтероциты. Цитокин RANKL имеет важное значение в развитии M клеток, и добавление RANKL и TNF-я в культурные носители способствует подмножество клеток из илеальных энтероидов дифференцироваться в M-клетки. Следующий протокол описывает метод дифференциации M-клеток в трансвелле эпителиальной поляризованной монослойной системы кишечника с использованием человеческих илеаловых энтероидов. Этот метод может быть применен к изучению развития и функции M-клеток.
M (микросклад) клетки специализированные кишечные эпителиальные клетки, найденные в основном в фолликуле связанных эпителия (FAE) кишечника над тонкими лимфоидными регионами называется Peyer патчи1. M клетки имеют короткие нерегулярные атикальные микровилли и глубоко invaginated на их базолутеральной стороне, которая позволяет иммунные клетки, чтобы проживать близко к их клеточному телу2. Эта уникальная морфология позволяет M-клеткам образец антигена из аптического просвета кишечника и доставить его непосредственно в основные иммунные клетки2. Таким образом, M клетки важны для иммунного наблюдения в кишечнике, но также могут быть использованы патогенами для входа в ламины propria1,2,3,4,5, 6,7.
Изучение M-клеток было затруднено несколькими факторами. Во-первых, M клетки находятся на низкой частоте в мыши и кишечнике человека8. В культурных клеточных системах, M-клеточные клетки были индуцированы, чтобы дифференцировать путем совместного культивирования поляризованной линии клеток аденокарциномы, Caco-2, либо с лимфоцитами B из патчей мыши Пейер или линии клеток В-клеток, Raji B9,10 . Это приводит к подмножество клеток Caco-2, которые выражают маркеры M-клеток Sialyl Lewis Антиген и UEA-1 в поляризованном эпителии9,10. (Эти маркеры также выражены на клетках кубок в кишечных тканях, поэтому в настоящее время реже используются в качестве окончательных маркеров M-клеток11,12.) Эта клеточная система Caco-2-M была использована для изучения поглощения частиц и транслокации бактерий13,14. Тем не менее, клетки Како-2 являются установленной клеточной линии от большой кишечной аденокарциномы с смешанным фактором, что различные источники клеток Caco-2 отображают различные фенотипы среди лабораторий15. Кроме того, они не могут полностью резюмировать уровни транскрипции истинных клеток M, так как им не хватает выражения известных в настоящее время маркеров M-клеток GP2 и SpiB16. Поэтому для изучения развития и функций клеток М необходимы дополнительные и более физиологически значимые модели культуры.
В течение последних десяти лет, поле enteroid полученных типовых систем кишечника быстро продвигается вперед от первоначального открытия, что кишечные стволовые клетки, полученные из кишечной биопсии человека может самопропагандировать и самообновления в культуре 17 Лет , 18. Важно, удаление факторов содействия стволовых клеток из средств роста позволяет этим культурам стволовых клеток дифференцироваться во многих типах клеток, найденных в кишечнике18. Кроме того, последние работы свидетельствуют о важности RANKL-RANK сигнализации в развитии M клеток в кишечнике19,20. Рецептор RANK является членом семейства Рецепторов TNF, который выражается на эпителиальных клетках-предшественниках в кишечнике19, в то время как RANKL (лиганд рецепторов RANK) высвобождается стромальными клетками патчей Пейера20. Так как эпителиальные типы клеток, присутствующие в ileal enteroids не производят RANKL, M-клеточная дифференциация в илеальных энтероидных культурах может быть вызвана добавлением RANKL в культуру сми21,22. Включение TNF в культурные медиа-медиа помогает поддерживать развитие M клеток в ileal enteroids23. Здесь мы описываем методы индуцирования дифференциации M-клеток в кишечных монослойах, полученных из человеческих илеальных энтероидов. Наши методы частично основаны на модификациях из следующих протоколов21,22,23.
Все методы, описанные здесь, были одобрены МКБ Университета Тафтса и IRB.
1. Индуцирование M-клеточной дифференциации в монослойах, полученных из человека, илеоидных
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол использует илеал-энтероиды, полученные из биопсии тканей человека. Пожалуйста, обратитесь к опубликованным протоколам для методов о том, как расти и прохождения этих ячеек18,24. Следующие методы для разработки монослой были адаптированы из Зоу и др.24. Методы индуцирования M-клеток в культурах, полученных из илеила, были адаптированы из предыдущих отчетов21,22,23. Все работы выполняются в стерильной ткани культуры капюшони и инкубации находятся в капюшоне или ткани культуры инкубатора, как указано. Смотрите Таблица материалов, необходимых для подготовки илеал enteroid монослойных и различных средств массовой информации.
2. Проверка m-дифференциации клеток qRT-PCR
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующую работу на стерильной БЕЗРНС скамейке. Ознакомьтесь с таблицей материалов для списка предпочтительных материалов для qRT-PCR.
3. Проверка M-клеточной дифференциации с помощью иммунофлуоресценции
ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда держите нижнюю палату пластины заполнены PBS так, что мембраны остаются влажными. Эта процедура проводится на скамейке запасных. См Таблица материалов для списка предпочтительных материалов для иммунофлуоресценции.
Ileal enteroids, выращенные в ECM, анализируются визуально и qRT-PCR для их относительного состояния здоровья и дифференциации как средства контроля качества для илеальных энтероидных культур и для использования в монослойных. Недифференцированные илеалэнтоиды, выращенные в ECM, кажутся прозрачными и кистозными в морфологии, что указывает на наличие многих стволовых клеток(рисунок 1A). Со временем, недифференцированные ileal enteroids, выращенные в средствах роста может взять на промежуточный фенотип, где некоторые будут появляться кистозные, а некоторые появляются непрозрачные (Рисунок 1B). Часто наши недифференцированные образцы напоминают те, которые показаны на рисунке 1B, а не на рисунке 1A. Эти промежуточные культуры содержат более неизлечимо дифференцированные энтероциты, измеряемые выражением маркера энтероцита, sucrase isomaltase (SI), и предположительно экструдированные мертвые энтероциты в просвете способствуют их плотному внешнему виду. Ileal enteroids могут быть использованы в этом промежуточном состоянии для развития монослой, но следует иметь в виду, что количество кишечных стволовых клеток, присутствующих в культурах, может быть низким, и некоторые дифференцированные типы клеток могут присутствовать (например, см. qRT-PCR уровни в недифференцированных образцах, выращенных в ECM, напоминающих рисунок 1B на рисунке 2). Для сравнения, ileal enteroids культивируется с дифференциацией средств массовой информации в ECM в течение 5 дней появится равномерно потемнело и лобкулярных и культур с этой морфологии не являются хорошими кандидатами для посева монослойных(рисунок 1C).
Выражение генов стволовых клеток и генов дифференциации кишечных клеток может быть проанализировано qRT-PCR как еще одно средство оценки состояния здоровья илеаловых энтероидов, выращенных в ECM, и их возможностей дифференциации, когда-то посеянных в качестве монослойных на трансвеллах. Выражение гена стволовых клеток, LGR5, ген энтероцита, SI, ген клетки кубок, MUC2, и ген клетки Paneth, LY ,сравнивается между недифференцированными илеал энтероидных культур, выращенных в ECM и дифференцированных илеал энтероидные монослои при наличии или отсутствии РАНКЛ/ТНФЗ(рисунок 2). Хотя значения могут отличаться между экспериментами, выражение LGR5 должно уменьшаться после дифференциации монослоев18,26. Выражение LGR5 обычно не обнаруживается в дифференцированных монослойных илебезмых без RANKL и TNF' на 7-й день. И наоборот, выражение маркеров дифференциации конкретных типов клеток, таких как SI и MUC2, увеличивается после дифференциации18. Выражение ЛИЗ обычно уменьшается после дифференциации в наших культурах. Если илеал энтероидных культур, используемых для принятия монослоев больше похожи на Рисунок 1B, чем Рисунок 1A, увеличение кишечной дифференциации маркеров может быть скромным после дифференциации, потому что эти первоначальные культуры неоднородны в типы кишечных клеток и имеют более высокий базальный уровень СИ и MUC2. Однако дифференциация в монослойных слоях по-прежнему происходит по оценке потери экспрессии LGR5 и микроскопии (см. ниже). Кроме того, добавление RANKL и TNF в медиадифференциацию уменьшает потерю экспрессии LGR5 (рисунок 2). Параллельно, выражение SI и MUC2 немного ниже, чем в дифференцированном состоянии, не хватает RANKL и TNF, хотя их уровни увеличиваются выше недифференцированного состояния.
Дифференциация M клеток в монослойах определяется как qRT-PCR и иммунофлуоресценции с использованием двух M клеток конкретных маркеров, включая гликопротеин поверхности клетки 2 (GP2) и транскрипционный фактор SpiB21. Выражение GP2 и SPIB регулируется в илеал-энтероидных монослойных в присутствии РАНКЛ и ТНФЗ и не обнаруживается в обработанных образцах, не входящих в РАНКЛ и ТНФЗ (Рисунок 3). Выражение этих маркеров также может быть нормализована до куска тонкой ткани кишечника22, если таковые имеются. Это позволяет сделать изменение этих маркеров M-клеток, сравнимых с тканью, которая имеет M-клетки, а не для контроля монослойных, которые не имеют выражения этих маркеров и позволяет стандартизировать между экспериментами в одной лаборатории. M клетки также обнаруживаются поверхностное выражение GP2 иммунофлуоресценции(рисунок 4). Как правило, в сопливой монослой, от 1 до 5 М клетки наблюдаются в данном поле микроскопа на 40X увеличение дней с 6 по 8 после посева в образцах, обработанных с RANKL и TNF (Рисунок 4A-D). В необработанных образцах(рисунок 4E)не видно выражения GP2. Ортогональное представление плоскости X', наложенной фаллоидиным зондом, показывает структуры актина, окружающие каждую клетку, и выражение GP2 на апиктической поверхности m-клеток(рисунок 4F-G). Эта модель резюмирует низкую частоту M клеток,найденных в кишечнике человека 1,2,8. Для очистки и изоляции m-клеток для дальнейшего изучения, M-клетки могут быть окрашены с помощью экспрессии поверхности GP2 и отсортированы с помощью FACS для клеток GP2.
M-клетки связываются и транспортируют антиген из просвета кишечника в иммунные клетки, проживающие под эпителием2. Секретор igA производится в кишечнике связывается с бактериями и может связываться с актической поверхности M клеток для облегчения транспортировки микробов27,28. Чтобы определить, способны ли M-клетки, разработанные в этой модели, связываться с IgA, в верхнюю камеру добавляется сыворотка человека IgA, разрешенная для связывания в течение 1 ч, после чего монослои готовятся к иммунофлуоресценционному анализу. Присутствие IgA на M-клетках визуализировано с помощью флюора-конъюгированного вторичного антитела, которое распознает тяжелую цепь человеческой сыворотки IgA. M клетки, обработанные IgA в течение 1 ч имеют IgA связаны с афикальной поверхности (Рисунок 5A), в то время как M клетки в контрольных скважин, которые были обработаны только с вторичным антителом IgA не имеют обнаруживаемого сигнала (Рисунок5B). Кроме того, IgA специально связывается с актической поверхностью M-клеток и не обнаруживается связанным с любыми клетками, не имеющими поверхностного пятна GP2. Кроме того, M-клетки имеют характерно более короткий плотный актин на их апической поверхности2. Для анализа морфологии M-клеток в этой модели, илеал энтероид полученных монослой выращивается в течение 7 дней и собирают для иммунофлуоресценции анализа F-актина с использованием фаллоидина. Измерения интенсивности пикселей актина рассчитываются для M-клеток и для не-M-клеток, которые непосредственно примыкают к каждой ячейке M с помощью программного обеспечения ImageJ(рисунок 6A). Интенсивность действия снижается на клетках GP2'M в этой модели, а репрезентативное изображение отображается на рисунке 6B. В целом, M-клетки, разработанные в этой модели монослойного монослойного микроэлемента, полученных из илеоловых, имеют характерную экспрессию генов, морфологию и некоторые функции Клеток М человека, такие как связывание с IgA.
Рисунок 1: Представитель морфологии человека илеал энтероидов в ECM одну неделю после расщепления. (A) Ясные и кистозные недифференцированные илеалвейные энтериды. (B) Промежуточный фенотип с некоторыми кистозными илеаловых энтероидов и некоторые непрозрачные лобкулярных илеаловых enteroids. (C) Потемнело и лобкулярной дифференцированных илеаловых enteroids. Изображения, сделанные через объектив оптического светового микроскопа при 4x увеличении с помощью камеры iPhone7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Относительное выражение стволовых клеток и маркеры дифференциации человеческих илеаловых энтероидов, выращенных в ECM или дифференцированных как монослои. Ileal enteroids были выращены в течение 7 дней в ECM (недифференцированные) или выросли и дифференцированы как монослои без (дифференцированный) или с RANKL и TNF (Дифференцированный R/T). Илеал энтероидных культур или монослой были собраны в Trizol для извлечения РНК. Выражение гена было определено qRT-PCR и выражается относительно GAPDH. Данные в среднем 3 независимых скважины илеал-энтероидов или монослой ных спойлов на одно состояние. Ошибки баров показывают SEM. ND не обнаружен. Статистическая значимость определялась на значениях, преобразованных в журнале, с помощью односторонней ANOVA с тестом несколько сравнений Даннетта по сравнению с недифференцированным. Р-л; 0,01, п.л.; 0,001 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Относительное выражение M-клеточных специфических маркеров GP2 и SPIB от человеческих илеаловых энтероидных монослойов. РАНКЛ/ТНФЗ, обработанные и необработанные человеческими илеалами, были собраны в Тризоле для извлечения РНК после 7 дней после посева. Выражение гена было определено qRT-PCR и выражается относительно GAPDH. Данные в среднем 6 независимых монослойных на состояние. Ошибки баров показывают SEM. ND не обнаружен. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Иммунофлуоресценция поверхностного экспрессии GP2 на M-клетках в человеческих илеаловых энтероидных монослойах с течением времени. RANKL/TNF' обработанные и необработанные человеческие илеидные энтероидные монослои были зафиксированы в 4% ПФА и окрашены для иммунофлуоресценции в различные указанные дни после посева. Изображения были проанализированы с помощью программного обеспечения ImageJ. DAPI - Синий; Гликопротеин 2 (GP2) - красный. (A-D) РАНКЛ/ТНФЗ лечили монослой в разные дни после посева. (E) Необработанный монослой, собранный в день 7 после посева. (F-G) Ортогональный ХЗ плоскости монослойных на 7 день после посева накладывается с фаллоидиина зонд для F-актина. Фаллоидин и циан. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: IgA связывается специально с актической поверхностью m-клеток. RANKL/ TNF'-обработанные человека илеол-выведенных монослойов были выращены в течение 7 дней, а затем (A) лечение с 10 мкг человеческой сыворотки IgA в течение 1 ч или ( B ) макет-обработанных с PBS только (Нет IgA управления). После 1 ч, монослой были промыты 2x в PBS, были зафиксированы в 4% PFA, permeabilized с 0.1% TritonX-100, и окрашенные для иммунофлюоресценции. Изображения были проанализированы с помощью программного обеспечения Image J и являются репрезентативными для 3 независимых экспериментов. DAPI - Синий; Гликопротеин 2 (GP2) - красный; Антитела к человеческой сыворотке IgA и зеленый; Фаллоидин и циан. Черные стрелки обозначают IgA, привязанную к актической поверхности M-клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 6: M клетки снизили интенсивность актина по сравнению с соседними не-M клеток. RANKL/TNF'-обработанные человека илеол-выведенных монослойов были выращены в течение 7 дней, а затем фиксированной в 4% ПФА и были окрашены для иммунофлуоресценции. (A) Использование ImageJ, GP2 "M клетки были изложены с помощью freehand выбор инструмент и измерения области и комплексной плотности были приняты в канале Phalloidin. Затем был завершен тот же анализ для каждой соседней ячейки, не являющейся M-ячейкой, которая соседствует с ячейкой M. Сырье Интегрированная плотность была разделена на площадь каждой отдельной ячейки для нормализации. Средняя интегрированная плотность/область была рассчитана для каждой прилегающей ячейки, не относясь к M для каждой ячейки M. Изображения были проанализированы из 3 независимых экспериментов; каждая точка m ячейки или среднего соседних ячеек. Бары ошибок указывают на SD. Статистическая значимость была определена на значениях, преобразованных журналом, с помощью теста Paired t. р 0.0001 (B) Представитель изображение самолета X' из сюжета в A. Images были проанализированы с помощью программного обеспечения ImageJ. DAPI - Синий; Гликопротеин 2 (GP2) - красный; Фаллоидин и циан. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Для разработки монослойных, которые правильно дифференцируются в основные типы клеток кишечника и M-клеток, очень важно быть в курсе нескольких факторов. Ileal enteroids должны быть собраны из ECM культур, которые являются недифференцированными и имеют высокую долю lgr5 "стволовых клеток. Визуально, большинство ileal enteroids в культурах ECM не должны быть затемнены и многолобулярны, и выражение LGR5 должно быть обнаружено в этих культурах с помощью анализа qRT-PCR. Контроль качества условных носителей имеет важное значение для распространения недифференцированных культур с течением времени и должен быть завершен для каждой партии условных носителей, которые производятся. Контроль качества может быть завершен путем тестирования новой партии носителей на некоторых культурах ECM и сравнения морфологии илеал-энтероидов с предыдущей партией носителей в течение недели. Выражение LGR5 должно оставаться относительно похожим в илеалэнтерных культур, выращенных в новой партии носителей по сравнению с предыдущей партии.
При подготовке илеальных энтероидов для посева в качестве монослойных, важно энергично пипетку клеточного раствора после инкубации с трипсином, чтобы разбить ileal enteroids на одиночные клетки. Клеточные комки могут привести к многослойной образованию при посеве для монослойных. Кроме того, важно эмпирически определить количество клеток, необходимых для формирования монослой для каждого отдельного ileal enteroid линии, которая получена. Как правило, это значение может варьироваться от 2,5 х 105 - 5,0 х 105 клеток / хорошо, но зависит от степени кистозных до некистовых илеаловых enteroids в культурах и варьируется для каждого отдельного ileal enteroid линии. Из опыта, ileal enteroids, выращенных в ECM, которые появляются менее кистозные требуют более высокой плотности посева клеток для достижения монослойных. Целесообразно помыть верхнюю камеру после 1 дня роста, аккуратно пайпетируя средства массовой информации вверх и вниз в 2-3 раза и заменив свежими средствами роста. Этот процесс вытесняет клетки, которые приземлились на другие клетки, уменьшая вероятность многослойного образования. Переключение средств массовой информации в верхней палате от роста средств массовой информации для M-клеток средств массовой информации, когда монослой в 80% сливов, которые обычно происходят в день 2 после посева, помогает достичь хорошей дифференциации M ячейки. Добавление RANKL/TNF в верхнюю камеру во время индукции M-клеток не приводит к развитию большего числа M-клеток на монослой и, следовательно, может быть исключено из среды верхней камеры. Трансвеллы различных размеров пор могут быть использованы в этом протоколе, не влияя на развитие M ячейки; однако, плотность посева клеток должна быть оптимизирована для тех, кто с большими размерами пор. Коллаген IV может быть заменен на ECM в качестве подвального мембранного протеинового покрытия для трансвелл или хорошо пластин, которые могут быть лучше подходят для некоторых приложений.
Илеал-энтероид-производные монослой на трансуэллах обеспечивают двухкамерную систему, которая позволяет создавать определенные апикальные и базолатеральные поверхности таким образом, что 4-5 различных типов эпителиальных клеток кишечника могут поляризовать, чтобы выразить поверхностные маркеры на каждом стороны по отношению к тому, что находится в кишечнике. К любой стороне могут быть добавлены дополнительные факторы, такие как частицы, инфекционные агенты или другие типы клеток. Однако на сегодняшний день некоторые ограничения остаются. Как описано, эта система является статическая система, которая не хватает физиологического потока, кишечных сокращений, и содержимое кишечника. Кроме того, архитектура виллуса-крипта теряется в результате образования плоского монослойа. Эти системы не имеют патч регионов Пейер, иммунные клетки, и стромальные клетки. Ли отсутствие иммунных и стромальных клеток, проживающих тесно под M клеток влияет на вагинации, которые не наблюдаются в этой системе и других физиологических функционирования является важной будущей области исследования. Этот протокол может быть адаптирован к 96-ну хорошо пластины или многоколодцв формат пластины. Процедура покрытия 96-ну хорошей пластины ECM и посева с одиночными клетками из илеальных энтероидов остается такой же, как и для трансвелл. Титрация плотности посева клетки, необходимых для получения монослойных должно быть сделано, но, как правило, колеблется от 1,0 х 105 - 3,0 х 105 клеток / хорошо в 96-колодец формата пластины. M клетки индуцируются путем замены роста средств массовой информации с М ячейки средств массовой информации, когда монослой 80% слияния, как правило, в дни 1-3 в зависимости от первоначальной плотности посева клеток.
Этот метод дифференциирования M-клеток от илеальных энтеридов in vitro обеспечивает значительные улучшения по сравнению с методом Caco-2. Ileal enteroids являются первичными клетками и по крайней мере 4-5 типов эпителиальных клеток присутствуют в системе. Кроме того, ileal enteroid линий, полученных от разных людей могут быть изучены, чтобы исследовать, как генетика или состояние болезни влияние Развития и поведения Клеток M. Дополнительные манипуляции илеал-энтероидов во время дифференциации M ячейки позволит лучше понять развитие M ячейки в том числе характеристики M клеток-прекурсоров. Наконец, поскольку молекулярные механизмы фagoцитоза ИКТитозаИ. до сих пор не до конца поняты 3,29,эта модель дает возможность изучить и визуализировать поглощение антигена и частиц M-клетками.
Авторам нечего раскрывать.
Эта работа была поддержана НИАИД U19AI131126 д-ру Исбергу (Медицинская школа Туфтского университета) и д-ром Капланом (Университет Тафтса); (JM является лидером проекта 2) и NIAID R21AI128093 в JM. ACF была частично поддержана NIAID T32AI007077. SEB и MKE были поддержаны NIAID U19AI116497-05. Мы благодарим сотрудников лаборатории Mecsas, лаборатории Ng и доктора Исберга из Медицинской школы Университета Тафтса за полезные обсуждения. Конфокальная визуализация была выполнена в Центре неврологии Тафтса, P30 NS047243.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
[Leu15]-Gastrin I | Sigma-Aldrich | G9145 | MCMGF+ and DM ingredient Solvent: PBS Stock Concentration: 10 µM Final Concentration: 10 nM |
0.5 M EDTA | Invitrogen | 15575020 | For breaking up ECM Solvent: PBS Stock Concentration: 0.5 M Final Concentration: 0.5 mM |
40 µm cell strainer | Corning | 352340 | For excluding clumps from single cells Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
A-8301 | Sigma-Aldrich | SML0788-5MG | MCMGF+ and DM ingredient Solvent: DMSO Stock Concentration: 500 µM Final Concentration: 500 nM |
Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-028 | MCMGF+ and DM Basal medium Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG | Thermo Fisher | A-11005 | For secondary stain Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: 1:200 |
Alexa Fluor 647 Phalloidin | Invitrogen | A22287 | Optional secondary stain for F-actin Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: 1:100 |
B27 Supplement | Invitrogen | 17504-044 | MCMGF+ and DM ingredient Solvent: Stock Concentration: 50x Final Concentration: 1x |
Bovine Serum Albumin | Chem-Impex | 00535 | 5% for blocking solution Solvent: PBS Stock Concentration: Final Concentration: 0.01 |
Chloroform | Fisher Scientific | C298-500 | For RNA isolation Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
Circle coverslips | Thomas Scientific | 1157B50 | For mounting membrane on glass slide Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Thermo Fisher | 62247 | For secondary stain Solvent: PBS Stock Concentration: 100x Final Concentration: 1x |
DEPC Treated RNAse free H2O | Fisher Scientific | BP561-1 | For RNA isolation Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
DNA Removal Kit | Invitrogen | AM1906 | For RNA isolation Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
Ethyl Alcohol, 200 proof | Sigma Aldrich | EX0276-4 | For RNA isolation Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
Feather Scalpels | VWR | 100499-580 | For cutting membrane from transwells Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140079 | For inactivating trypsin Solvent: Advanced DMEM/F12 Stock Concentration: 1 Final Concentration: 0.1 |
Glass slides | Mercedes Scientific | MER 7200/90/WH | For mounting membrane on glass slide Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
GlutaMAX | Invitrogen | 35050-061 | MCMGF+ and DM ingredient Solvent: Stock Concentration: 200 mM Final Concentration: 2 mM |
GP2 Antibody | MBL International | D277-3 | Surface stain for M cells Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: 1:100 |
HEPES | Invitrogen | 15630-080 | MCMGF+ and DM ingredient Solvent: Stock Concentration: 1 M Final Concentration: 10 mM |
Human Serum IgA | Lee BioSolutions | 340-12-1 | For functional analysis of M cells Solvent: PBS Stock Concentration: 1 mg/mL Final Concentration: 10 µg |
L-Wnt3a conditioned media | Cell line from ATCC | CRL-2647 | Refer to ATCC Product Sheet for L Wnt3A (ATCC CRL2647) for conditioned media protocol; MCMGF+ ingredient Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: 75% in MCMGF+ 0% in DM |
Matrigel, GFR, phenol free | Corning | 356231 | Extracellular Matrix (ECM) Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
Mouse recombinant EGF | Invitrogen | PMG8043 | MCMGF+ and DM ingredient Solvent: PBS Stock Concentration: 50 µg/mL Final Concentration: 50 ng/mL |
N2 Supplement | Invitrogen | 17502-048 | MCMGF+ and DM ingredient Solvent: Stock Concentration: 100x Final Concentration: 1x |
N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165-5G | MCMGF+ and DM ingredient Solvent: H2O Stock Concentration: 500 mM Final Concentration: 1 mM |
Noggin conditioned media | Cell line gift from Dr. Gijs van den Brink (University of Amsterdam) | Ref 30 for conditioned media protocol; MCMGF+ and DM Ingredient Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: 5% in MCMGF+ 5% in DM | |
Paraformaldehyde (PFA) | MP Biomedicals | 2199983 | For fixing monolayers Solvent: PBS Stock Concentration: 0.16 Final Concentration: 0.04 |
PBS, -Mg, -Ca | Corning | MT21040CV | Solvent for 0.5 mM EDTA Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Optional ingredient of MCMGF+ and DM Solvent: Stock Concentration: 100x Final Concentration: 1x |
Prolong Gold | Invitrogen | P36930 | Antifade mounting solution Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
Qiagen RNeasy Kit | Qiagen | 74106 | For RNA isolation Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
Recombinant human RANKL | Peprotech | 310-01 | Used to induce M cells Solvent: H2O Stock Concentration: 0.1 mg/mL Final Concentration: 200 ng/mL |
Recombinant murine TNFa | Peprotech | 315-01A | Used to induce M cells Solvent: H2O Stock Concentration: 5 mg/mL Final Concentration: 50 ng/mL |
R-spondin conditioned media | Cell line from Trevigen | 3710-001-01 | Refer to Trevigen Cultrex Rspo1 Cells product manual (HA-R-Spondin1 293T cell line) for conditioned media protocol; MCMGF+ Ingredient Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: 10% in MCMGF+ 0% in DM |
Secondary anti-human IgA antibody | Jackson Immuno Research | 109-545-011 | For secondary stain Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: 1:200 |
Super Script IV Reverse Transcriptase | Thermo Fisher | 18091200 | For conversion of RNA to DNA Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
Transwell inserts, 24 well-sized | Greiner Bio-One | 662641 | 0.4 µm pore size Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
TritonX-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Not required during GP2 primary stain Solvent: 1% BSA Stock Concentration: Final Concentration: 0.001 |
TRIzol | Invitrogen | 15596018 | For RNA isolation Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
TrypLE Express | Invitrogen | 12605010 | Trypsin for breaking up enteroids into single cells Solvent: Stock Concentration: Final Concentration: |
Y-27632 | Sigma-Aldrich | Y-0503 | MCMGF+ ingredient on day 0 Solvent: H2O Stock Concentration: 5 mM Final Concentration: 10 µM |
GAPDH forward primer | CATGAGAAGTATGACAACAGCCT | ||
GAPDH reverse primer | AGTCCTTCCACGATACCAAAGT | ||
GP2 forward primer | CAATGTGCCTACCCACTGGA | ||
GP2 reverse primer | ATGGCACCCACATACAGCAC | ||
LYZ forward primer | CGCTACTGGTGTAATGATGG | ||
LYZ reverse primer | TTTGCACAAGCTACAGCATC | ||
MUC2 forward primer | ATGCCCTTGCGTCCATAACA | ||
MUC2 reverse primer | AGGAGCAGTGTCCGTCAAAG | ||
SI forward primer | TCCAGCTACTACTCGTGTGAC | ||
SI reverse primer | CCCTCTGTTGGGAATTGTTCTG | ||
SPIB forward primer | CAGCAGCCGCTTTTAGCCAC | ||
SPIB reverse primer | GCATATGCCGGGGGAACC | ||
LGR5 forward primer | TCAGTCAGCTGCTCCCGAAT | ||
LGR5 reverse primer | CGTTTCCCGCAAGACGTAAC |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены