Метод перфузии Antegrade для выделения кардиомиоцитов у мышей

Резюме

Мы разработалиупрощенный метод выделения высококачественных отдельных клеток сердца мыши с помощью метода антеградной перфузии. Этот метод не содержит Лангендорфа и полезен для выделения желудочковых и предсердных миоцитов или интерстициальных клеток, таких как сердечные фибробласты или прародители.

Аннотация

В фундаментальных исследованиях с использованием сердца мыши выделение жизнеспособных отдельных кардиомиоцитов является важным техническим шагом для преодоления. Традиционно выделение кардиомиоцитов из кроликов, морских свинок или крыс проводилось с помощью ретроградной перфузии сердца ферментами с использованием аппарата Лангендорфа. Тем не менее, высокая степень мастерства требуется, когда этот метод используется с маленьким мышеным сердцем. Недавно сообщалось о методе антеградной перфузии, который не использует аппарат Лангендорфа для выделения кардиомиоцитов мыши. Здесь мы сообщаем о полном протоколе улучшенной антеградной перфузии иссеченного сердца для выделения отдельных клеток сердца от взрослых мышей (8 - 108 недель). Антеградную перфузию проводят путем введения перфусата вблизи вершины левого желудочка иссеченного сердца, аорту которого зажимали, с помощью инфузионного насоса. Все процедуры проводятся на предварительно подогретом нагревательном коврике под микроскопом, что позволяет контролировать процессы инъекций и перфузии. Результаты показывают, что желудочковые и предсердные миоциты, а также фибробласты могут быть хорошо выделены от одной взрослой мыши одновременно.

Введение

Как правило, первый этап выделения одноклеточной рассеченной ткани включает измельчение ткани на мелкие кусочки с последующим перевариванием соединительной ткани и внеклеточного матрикса ферментами. Однако кардиомиоциты нельзя выделить таким методом измельчения, так как обогащение компонентами внеклеточного матрикса, включая коллагеновые и эластиновые волокна, делает миокард слишком жестким для измельчения, а кардиомиоциты очень чувствительны к гипоксии и другим изменениям микросреды. Так, с помощью ретроградной перфузионной системы 1 на^основеЛангендорфа был разработан метод переваривания внеклеточного матрикса ферментами для выделения отдельных кардиомиоцитов из сердца^2,3,4.

В мышиных моделях ретроградная перфузия сердца на основе Лангендорфа с ферментами также используется для выделения отдельных кардиомиоцитов^5,6,7,8. Однако канюляция маленькой и тонкой мышиной аорты и ее установка на аппарат Лангендорфа для выполнения ретроградной перфузии требует высокой степени мастерства, так как диаметр аорты во взрослом сердце составляет примерно 1,2 мм. Кроме того, требуется время для выполнения нескольких экспериментов, так как аппарат Лангендорфа должен быть очищен перед перфузией следующего сердца.

В качестве альтернативы ретроградной перфузии был разработан новый метод выделения кардиомиоцитов из сердца взрослой мыши без аппарата Лангендорфа. Этот эпохальный метод был основан на антеградной перфузии коронарных артерий^9. Недавно мы улучшили каждый шаг этого протокола антеграда, такой как зажим аорты, введение иглы и контроль температуры, и контролировали все процедуры перфузии с помощью микроскопа^10. Здесь мы подробно сообщаем об усовершенствовании этого метода антеградной перфузии, чтобы сократить время изоляции и предоставить дополнительное видео. При этом методе перфузия сердца занимает примерно 7 мин с 10 мл ферментов, и этот короткий период пищеварения повышает жизнеспособность клеток. Это простой метод выделения одиночных клеток сердца при высоком качестве, не требуя добавления химических веществ, таких как 2,3-бутанедион моноксим^{(БДМ) 6,11} или таурин^5,8. Мы считаем, что этот метод снизит порог мастерства методики и повысит полезность мышиных кардиомиоцитов в фундаментальных исследованиях.

протокол

Все эксперименты на животных соответствовали Руководству по уходу за лабораторными животными и их использованию, опубликованному Национальными институтами здравоохранения США (публикация NIH No 85-23, пересмотрена в 1996 году) и были одобрены институциональным наблюдательным советом Комитета по уходу и использованию животных Университета Сига (утвержден No 2019-3-7). Методы были выполнены в соответствии с утвержденными руководящими принципами.

1. Инструменты и решения

ПРИМЕЧАНИЕ: Схема экспериментальной процедуры проиллюстрирована на блок-схеме(дополнительный рисунок 1). Инфузионный насос (или шприцевой насос) следует использовать для антеградной перфузии сердца односторонним потоком. Перистальтический насос, создающий пульсирующий поток, не рекомендуется.

1. До эксперимента
   1. Отметьте иглу для инъекций в месте примерно в 3 мм от кончика лаком для ногтей. После того, как он высохнет на воздухе, держите его в контейнере при комнатной температуре. Красный или яркий цвет желателен для подтверждения глубины введения в миокард во время перфузии.
   2. Сделайте сердце выжидающим, отрезав крышки от пробирок 1,5,5 и 0,2 мл и прикрепив крышки к нижней части 60-мм чашки для культивирования с помощью двусторонней ленты или клея. Фиксация трех крышек разного размера в одной посуде дает возможность выбрать подходящую по размеру сердца мыши. Эту подставку для сердца можно повторно удобывать после мытья.
   3. Сделайте запасной раствор, как показано в таблице 1. Храните стоковые растворы при 4 °C.
2. В день эксперимента
   ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер изоляции клеток (CIB) содержит (в мМ) 130 NaCl, 5,4 KCl, 0,5 MgCl_2,0,33₂PO_4,22 глюкозы, 40 единиц / мл инсулина и 25 HEPES (рН с поправкой на 7,4 с NaOH); и раствор тирода содержит (в мМ) 140 NaCl, 5,4 KCl, 1,8 CaCl_2,0,5 MgCl_2,0,33₂PO_4, 5,5 глюкозы и 5,0 HEPES (рН с поправкой на 7,4 с NaOH).
   1. Подготовьте CIB. Нагрейте 160 мл дистиллированной воды (DW) с помощью микроволновой печи примерно до 32 °C, а затем добавьте 20 мл 10X CIB. После добавления 0,79 г глюкозы и 10 мкл раствора инсулина регулируют рН с помощью 1 М NaOH и доводят до 200 мл с DW.
   2. Приготовьте раствор ферментной смеси (ферментной смеси). Добавьте 30 мг коллагеназы, 1,8 мг трипсина, 1,8 мг протеазы и 90 мкл 100 мМ стокового раствора CaCl₂ к 30 мл CIB (конечная концентрация Ca²⁺ составляет 0,3 мМ), перемешайте и держите на льду. У мышей <4 недели уменьшают трипсин и протеазу до 0,9 мг^10. Прогрейте при 37 °C на водяной бане перед использованием.
   3. Подготовьте раствор CIB-Ca²⁺-BSA. Добавьте 30 мг BSA и 90 мкл 100 мМ запасного раствора CaCl₂ к 15 мл CIB (конечная концентрация Ca²⁺ составляет 1,2 мМ), перемешайте, фильтруйте через фильтр 20 мкм и держите его на льду.
   4. Подготовьте раствор CIB-EGTA. После приготовления растворов, описанных на этапах 1.2.2 и 1.2.3, добавляют 400 мМ запасного раствора EGTA к оставшемуся CIB при разведении 1:1000 (конечная концентрация EGTA составляет 0,4 мМ) и перемешивают. Наполните 35-миллиметровое блюдо для культуры и подставку для сердца CIB-EGTA и держите их на льду.
      1. Налейте примерно 20 мл CIB-EGTA в стеклянный стакан объемом 30 мл и положите пластиковую передаточную пипетку в стакан, держа его на льду.
   5. Приготовьте раствор Тирода. Добавьте 100 мл 10X Tyrode к 800 мл DW и нагрейте его с помощью микроволновой печи примерно до 32 °C. После добавления 0,99 г глюкозы и 1,8 мл 1 М_CaCl2,отрегулируйте рН с помощью 1 М NaOH и доведите до 1000 мл с DW.
   6. Приготовьте раствор для повторного суспензии клеток. Добавьте 30 мг BSA и 300 мкл 50X антибиотиков к 15 мл раствора Тирода.
   7. Приготовьте шприцы. Заполните шприц 20 мл, соединенный гибкой удлинительной трубкой, и маркированную инъекционную иглу CIB-EGTA. Наполните шприц 30 мл подогретой ферментной смесью. Держите их при 37 °C до непосредственного использования.
   8. Подготовьте перфузионную пластину. Предваряют нагреватель под стереоскопическим микроскопом. Поместите перфузионную пластину (крышку многоязычной культурной пластины) на коврик предварительно прогременного нагревателя. Предваряйте сосудистый зажим, помещая его в перфузионную пластину до использования. Поместите 60-миллиметровую культуральную посуду для пипетки и ситечко для клеток на коврик предварительного нагревателя.

2. Антеградная перфузия сердца мыши

ПРИМЕЧАНИЕ: Пластиковая переносная пипетка, используемая для сосания сердца, должна быть мягкой и не быть резко сужена к кончику. Выбирайте небольшой сосудистый зажим с зазубринами. Рекомендуемые инструменты перечислены в Таблице материалов.

1. Иссечение сердца мыши и зажим аорты
   ПРИМЕЧАНИЕ: Взрослые мыши (>8 недель) должны быть усыплены передозировкой пентобарбитала натрия (>300 мг/кг, внутрибрюшинная [i.p.] инъекция) гепарином (8000 единиц/кг).
   1. Быстро иссежируйте сердце мыши, сосая.
      1. Быстро откройте грудную полость, чтобы обнажить сердце. Вырежьте пластиковую переносную пипетку, кончик которой примерно такого же размера, или немного меньше, чем открытое сердце (обычно на участке примерно в 1 см от отметки 0,5 мл по направлению к кончику, но это зависит от размера сердца).
      2. Всасывайте сердце в пипетку, поднимите пипетку, чтобы создать достаточно места для вставки ножниц, и иссажите сердце изогнутыми ножницами со стороны дорсальной стороны, избегая повреждения предсердий.
      3. Немедленно перенесите иссеченное сердце в стеклянный стакан 30 мл, содержащий охлажденный льдом CIB-EGTA, чтобы остановить сокращение. Эта процедура обычно занимает <1 мин.
   2. Очистка вокруг аорты
      1. Перенесите сердце в 35-миллиметровую культурную чашку, наполненную охлажденной льдом CIB-EGTA, и удалите легкое и другие видимые ткани, а затем перенесите грубо очищенное сердце на сердечную стойку, заполненную охлажденным CIB-EGTA, и поместите ее вершиной вниз.
      2. Под стереоскопическим микроскопом удалите жировые и соединительные ткани для очистки вокруг аорты. Если длина разрезанной аорты слишком длинная, включая брахиоцефальную артерию, левую общую сонную артерию или левую подключичную артерию, отрежьте аорту прямо под брахиоцефальной артерией, чтобы укоротить ее, чтобы перейти к следующему шагу. Эта процедура обычно занимает около 4 минут.
   3. Зажим аорты и размещение зажатого сердца на перфузионной пластине
      1. Под микроскопом поместите сердце в сердечную стойку. Оператор должен повернуть в переднюю поверхность сердца, поднять пинцетом конец аорты и зажать аорту возле предсердия небольшим сосудистым зажимом, при этом осторожно надавливая на аорту.
      2. Поместите зажатое сердце на перфузионную пластину передней стороной вверх, а затем накройте его несколькими каплями CIB-EGTA, чтобы оно не высохло. Эта процедура обычно занимает <20 с.
2. Антеградная перфузия сердца
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во-первых, перфузировать сердце CIB-EGTA для сброса крови и предотвращения свертывания.
   1. Вставьте инъекционную иглу и начните перфузию для сброса крови
      1. Установите шприц 20 мл, наполненный предварительно выпуклым CIB-EGTA, соединенным с гибкой удлинительной трубкой и маркированной инъекционной иглой на инфузионный насос. Запустите насос с медленной скоростью 0,5 мл / мин, чтобы тщательно заполнить иглу и трубку CIB-EGTA и обязательно предотвратить попадание воздуха в трубку.
      2. Поместите инъекционную иглу на перфузионную пластину с более короткой стороной диагональной формы спереди. Сдвиньте иглу к вершине сердца до тех пор, пока она не коснется ее, а затем осторожно вставьте иглу возле вершины левого желудочка в желудочковую камеру, не скручивая. Не отсоеживайте иглу от пластины во время выполнения введения.
      3. Следите за красной меткой, чтобы оценить глубину введения иглы. Когда введение иглы завершено, кровь, вытекающая из коронарной артерии, должна начать разряжаться.
      4. Закрепите инъекционную иглу на пластине скотчем, и увеличьте скорость насоса до 1 мл/мин. Эта процедура обычно занимает около 30 с. Если сердце успешно перфузируется, то поток CIB-EGTA в капилляре прямо под эпикардом можно увидеть под микроскопом.
   2. Перфузия сердца с помощью ферментной смеси
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время ферментативной перфузии глубину вставленной иглы можно контролировать, проверив красную метку на игле.
      1. После перфузии 2-3 мл CIB-EGTA для полного отвода крови из коронарной артерии, измените перфусат на ферментную смесь. Избегайте попадания пузырьков воздуха в трубку. Проверьте поток ферментной смеси и убедитесь, что инъекционная игла не вышла, проверив положение красной метки.
      2. После перфузии 1-2 мл увеличьте скорость насоса до 1,5 мл/мин. Удалите накопленный перфусат, содержащий кровь, которая время от времени вытекала из сердца, пипеткой.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Со временем стенка миокарда в некоторых местах станет полупрозрачной и будет казаться пятнистой, что является признаком переваривания внеклеточного матрикса после успешной перфузии. Другим признаком является возобновление биения предсердий, вызванное присутствием Ca²⁺ в смеси ферментов.
      3. Прекращают перфузию, когда общий объем перфузированной ферментной смеси составляет 10 мл.

3. Выделение отдельных клеток сердца

1. Диссоциирующие клетки сердца
   1. После перфузии с ферментной смесью переложите 10 мл ферментной смеси, оставшейся в шприце, в 60-миллиметровую культуральную чашку, помещенную на нагревательную коврик, и добавьте 20 мг BSA (0,2% BSA в ферментной смеси). Выпавшие порошки BSA должны немедленно раствориться, осторожно закручиваясь рукой. Удалите инъекционную иглу и сосудистый зажим из сердца.
   2. Отделите желудочки и предсердия и перенесите каждый в ферментную смесь, дополненную 0,2% BSA на нагревательном мате.
2. Выделение желудочковых миоцитов
   1. Возьмите эпикард двумя пинцетом, аккуратно разорвите и потяните желудочки из стороны в сторону в ферментной смеси, дополненной 0,2% BSA, на мелкие кусочки. Диспергировать ячейки с помощью мягкого пипетирования (примерно в 30 раз).
   2. Фильтруйте непереваренный мусор через сетчатый сетчатый сетчатый фильтр 100 мкм и перенесите фильтрат в 15-мл центрифужную трубку для центрифугирования при 50 × г в течение 3 мин. Повторно суспендировать гранулированные кардиомиоциты в предварительном растворе CIB-Ca^2+-BSA,инкубировать его в течение 5 мин при 37 °C, а затем центрифугировать при 14 × г в течение 3 мин.
   3. Повторно суспендирует конечные осажденные кардиомиоциты в клеточном ресуспенсионном растворе (состав приведен в таблице 2)и выдерживают его при 37 °С.
3. Выделение предсердных миоцитов
   1. Во время заключительной центрифугирования желудочковой фракции миоцитов на этапе 3.2 начинают выделение предсердных миоцитов. Перенесите предсердия, хранящиеся как на этапе 3.1, в предварительно распохленный раствор CIB-Ca²⁺-BSA, разорвите его на куски и диссоциируют ячейки путем пипетки наконечником пипетки на 10 мкл на нагревательном мате.
   2. Центрифугируют клеточную смесь при 14 × г в течение 3 мин и повторно суспендируют гранулированные предсердные клетки раствором для повторной суспензии клеток.
4. Выделение и культивируется сердечными фибробластами
   1. Перенесите супернатант с первого центрифугирования на этапе 3.2 в другую 15-мл центрифужную трубку и центрифугу при 190 × г в течение 5 мин. Промыть осажденные клетки дважды центрифугированием в модифицированной орлиной среде Dulbecco (DMEM), а затем приостановить клетки DMEM, дополненным 10% фетальным бычим альбумином (FBS) и антибиотиками.
   2. Облейте конечную фракцию клеток в колбу для культивирования^{(25 см2)}и позвольте клеткам прилипать к дну колбы в увлажненной атмосфере с 95% воздуха и 5%_CO2. После 90 мин инкубации отбросьте неприкрепленные клетки и добавьте свежую питательную среду. Клетки должны быть близки к слиянию примерно через 4 дня, после чего они должны быть усилены трипсинизацией и посеяны в новые культуральные блюда.

4. Сбор белков из предсердий и желудочков

1. После перфузии отделяют предсердия и желудочки и гомогенизируют их в буфере лизиса в соотношении 10 мг массы ткани к 100 мкл буфера с помощью небольшой шлифовальной машины в пробирке для образцов объемом 1,5 мл.
2. Выдерживают гомогенат во льду в течение 40 мин с вихревым перемешиванием каждые 10 мин для извлечения белков, а затем центрифугируют трубку при 15000 × г в течение 20 мин при 4 °C. Храните фракцию супернатанта при -80 °C в виде образца белка.

5. Иммуноокрашивание изолированных клеток сердца

ПРИМЕЧАНИЕ: Необходима иммобилизация неприлипающих кардиомиоцитов на дно тарелки для визуализации клеток с использованием биологического клея.

1. Адгезия изолированных кардиомиоцитов к чашке для культивируемости со стеклянным дном
   1. Перед началом выделения клеток посыпьте стеклянную чашку для культивовки биологическим клеем (например, Cell-Tak) в соответствии с инструкцией производителя, промойте DW и высушите на воздухе при комнатной температуре.
   2. После повторного суспензии выделенных кардиомиоцитов в растворе CIB-Ca^2+-BSAопускают клеточную суспензию на дно покрытой клеем посуды и инкубируют в течение 20 мин при комнатной температуре без перемешивания.
2. Иммуноокрашивание
   1. Налейте изолированные кардиомиоциты на стеклянную тарелку, предварительно покрытую биологическим клеем, и держите ее при комнатной температуре в течение 40 минут, чтобы клетки прилипли к блюду. Культивирует сердечные фибробласты в посуде для культуры нижнего стекла.
   2. Промыть клетки фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) и зафиксировать их 4% параформальдегидом (PFA) в течение 5 мин при встряхивании. Неподвижные клетки промыть ПБС в течение 10 мин три раза, и высиживают их в блокно-пермеабилизационном растворе в течение 60 мин при комнатной температуре с встряхиванием.
   3. Зондовые клетки с первичным антителом разводят в блокно-пермеабилизируемом растворе в течение 60 мин при комнатной температуре или на ночь при 4 °С. Промыть клетки PBS в течение 10 мин три раза, а затем инкубировать с флуоресцентно-меченым вторичным антителом в течение 60 мин при комнатной температуре.
   4. После промывки их три раза PBS в течение 10 мин окрашивают ядра DAPI (разведение 1:10000 в PBS). Анализ флуоресцентных сигналов с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа.

6. Записи зажимов для целых клеток

1. Изготовите пластырные электроды из стеклянных капилляров с помощью горизонтального микроэлектродного съемника. Сопротивление электрода варьировалось от 2 до 4 МОм при заполнении^{К+-ричным}пипеткой раствора(таблица 2). Перенесите аликвоту изолированных кардиомиоцитов в записывающей камере, установленной на сцене инвертированного микроскопа, наложенного Тиродом со скоростью 1 мл/мин при 36-37 °С.
2. Регистрируют потенциалы действия методом перфорированного пластыря-зажима с^{К+-богатым}раствором пипетки, содержащим 30 мг/мл амфотерицина В, путем подачи импульсов тока длительностью 5-10 мс со скоростью 1 Гц через патч-электрод.

7. Вестерн-блот-анализ

1. В этом исследовании выполните анализ вестерн-блот маломолекулярных белков, таких как предсердный маркер предсердного натрийуретического пептида (ANP).
2. Растворите образец белка в конечной концентрации буфера 1X Sample, 2% 2' меркаптоэтанола, и денематизируют белки в течение 60 мин при 37 °C. Загрузите 20 мкг белка в каждую скважину и выполните электрофорез в работающем буфере с 20 мА на гель в течение 120 мин.
3. Перенос белка на PVDF-мембрану в переносном буфере при 10 В в течение 40 мин. Промыть перенесенную мембрану дважды с TBST в течение 5 мин, затем заблокить 5% обезжиренным молоком в TBST в течение 60 мин при комнатной температуре и прощупать с первичным антителом, растворенным в TBST на ночь при 4 °C.
4. Промыть мембрану 5 раз ТБСТ в течение 7 мин, и инкубировать ее с вторичным антителом, разведенным в TBST в течение 120 мин при комнатной температуре.
5. После промывки мембраны 5 раз TBST в течение 7 мин визуализируйте сигналы с помощью химилюминесцентного анализа и проанализируйте их с помощью анализатора люмино-изображений.

Результаты

Принцип этого метода прост: перфусат вытекает из левой камеры, открывается аортальный клапан, а перфусат проходит в коронарную артерию в том же направлении, что и кровь, так как аорта закрывается зажимом, что дает возможность глубокой перфузии миокарда с целью переваривания внеклеточного матрикса.

Желудочковые миоциты, свежеизолированные настоящим способом, показаны на фиг.1А. На рисунке 1В показаны увеличенные изображения желудочковых и предсердных миоцитов. Эта процедура изоляции привела к высокой урожайности (70%-80%) палочковидных желудочковых миоцитов покоя взрослых мышей (8-10 недель), которые были доступны в течение примерно 5 ч после выделения(рисунок 1С),интервал, аналогичный интервалу при использовании традиционной процедуры 7 на^основеЛангендорфа. Однако соотношение свежеизолированных жизнеспособных клеток было ниже у пожилых мышей >2 лет(Рисунок 1С). Общее количество желудочковых миоцитов, полученных на сердце взрослого человека с использованием этого протокола, составило примерно 3 х^{10 6} клеток, что было аналогично значению, о котором^{сообщалось ранее 7,12.} Потенциалы действия, зарегистрированные в желудочковых и предсердных миоцитах(рисунок 1D),были аналогичны тем, которые были в клетках, полученных методом¹⁰на основе Лангендорфа. Иммуноиражающий анализ подтвердил, что саркомерная структура желудочковых миоцитов была хорошо организована с хорошо видимой клеточной мембраной(рисунок 2А). Отдельные кардиомиоциты, выделенные этим методом, могут быть непосредственно использованы в экспериментах, таких как электрофизиологический анализ¹⁰ или эксперимент с иммуноокрашиванием.

Сердечные фибробласты существуют в интерстициальных пространствах. Достаточное переваривание внеклеточного матрикса приводит к изоляции этих клеток. Изолированные сердечные фибробласты размножаются в условиях культивации и могут проходить несколько раз или храниться в жидком азоте в соответствующем растворе клеточного резервуара. Рисунок 2B показывает, что большинство культивируемых сердечных фибробластов трансформировались в миофибробласты во время субкультуры, что подтверждается повышенной экспрессией α гладкомышечного актина^13,14. Также сердечные прародители могут быть выделены с помощью настоящего способа и культивированы в соответствующей питательной среде, которые начинают биться автоматически^10,15.

Гомогенизация крепкого миокарда непростая, особенно для сердечной ткани у пожилых мышей, которая обладает большим количеством внеклеточных волокон. После антеградной перфузии белок из предсердий и желудочков может быть легко гомогенизирован в буфере лизиса с легкой силой для извлечения белков. Анализ вестерн-блот продемонстрировала специфическую экспрессию ANP в предсердиях, но не в желудочках у взрослых (20 недель) и пожилых (108 недель) мышей(рисунок 3).

Рисунок 1. Выделены кардиомиоциты у мышей. А. Желудочковые миоциты свежеизолированы с антеградной перфузией, с изображениями, полученными с малым увеличением. После окончательного промывания кардиомиоциты повторно суспендировали 2 мл клеточного раствора для ресуспенсии, 100 мкл которого сбрасывали на чашку со стеклянным дном и ожидали поселения клеток. Бар, 100 мкм.B. Увеличенные изображения изолированных желудочковых миоцитов (верхние) и предсердных миоцитов (нижние). Бар, 100 мкм.C. Изолированные клетки суспендировали в клеточном ресуспенсионном растворе и хранили при 37°С в течение нужного периода, а количество живых желудочковых миоцитов подсчитывали в 10-15 полях под микроскопом. Округлые камеры считались необратимо поврежденными или мертвыми^16. Зеленые, синие и красные символы были получены от 3 мышей в возрасте 8-10 недель, а черные символы были получены от 106-недельной мыши. Желтый символ обозначает среднее значение каждой группы. D. Репрезентативные потенциалы действия, зарегистрированные из желудочковых (черных) и предсердных (красных) миоцитов 8-10 мышей. Данные были получены из клеток примерно через 3 ч после выделения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2. Иммуноокрашивание α-актинина в изолированных желудочковых миоцитах мыши и актина гладких мышц α в культивируемых сердечных фибробластах мыши. A. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия иммуноокрашивания для α-актинина (зеленый), окрашивание DAPI для ядер (синий) и ДВС-изображение желудочковых миоцитов, выделенных из сердца мыши с антеградной перфузией. Bar, 50 мкм.B. Иммуноокрашивание для α актина гладких мышц (зеленый), окрашивание DAPI для ядер (синий) и ДВС-синдромное изображение сердечных фибробластов, выделенных из сердца мыши с антеградной перфузией. Сердечные фибробласты культивировали в течение четырех дней. Бар, 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3. Вестерн-блот-анализ АНП в предсердиях и желудочках. Анализы вестерн-блэт на предсердный маркер предсердного натрийуретического пептида (ANP) в предсердиях (A) и желудочках (V), полученные из сердца взрослых (20 недель) и пожилых (108 недель). АНП присутствует в предсердиях, но отсутствует в желудочах. Используйте глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (GAPDH) в качестве контрольного домашнего белка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Стандартные решения для изоляции клеток сердца
10X CIB (500 мл)
НаКл	37,99 г
KCI	2,01 г
1 ММгCl2	2,5 мл
НаН2ПО4	0,23 г
ХЕПЕС	29,79 г
Д.У.	Наполните до 500 мл
100 мМ CaCl2 запасов
КаКл2	100 мМ
400 мМ EGTA складской раствор
ЭГТА	400 мМ
Раствор инсулина
инсулин	1 единица/мл в 0,1 мл HCl
50X Раствор антибиотиков (20 мл)
пенициллин	100 мг
стрептомицин	100 мг
Фенол красный	1.5 г
Д.У.	20 мл и стерилизовать фильтром
10X Раствор тирода (1000 мл)
НаКл	81,82 г
ККл	4,03 г
1 ММгCl2	5 мл
НаН2ПО4	0,47 г
ХЕПЕС	11,92 г
НаОХ	0.8 г
Д.У.	Наполните до 1000 мл
Сток солутин для иммуноокрашивания
Акции DAPI
ДАПИ	2 мг/мл в метаноле
Стоковые решения для вестерн-блотов
Буфер HEPES (100 мл)
НаКл	0,88 г
400 мМ ЭГТА	0.25 мл
ХЕПЕС	0,24 г
1М НаОН	отрегулируйте pH до 7,4
Д.У.	Наполните до 500 мл
Коктейль ингибиторов протеазы
Полный мини	1 таблетка
Д.У.	0,4 мл

Таблица 1. Описание стоковых решений. Держите запасы растворов при 4 °C. Ингибиторы протеазы Аликвот коктейль для хранения при -20 °C.

Растворы для изольтирования клеток сердца
CIB (200 мл)
10X CIB	20 мл
Раствор инсулина	0.01 мл
глюкоза	0,79 г
1М НаОН	Регулировка pH до 7,4
Д.У.	Залить до 200 мл
Фермент-микс раствор (30 мл)
Коллагеназа типа2	30 мг
трипсин	1,8 мг
протеаза	1,8 мг
100 мМ CaCl2 складской раствор	0.09 мл
КИБ	30 мл
CIB-Ca2+-BSA (15 мл)
БСА	30 мг
100 мМ CaCl2 складской раствор	0.18 мл
КИБ	15 мл
CIB-EGTA (150 мл)
400 мМ EGTA складской раствор	0.150 мл
КИБ	150 мл
Раствор тирода (1000 мл)
10X Тирод стоковое решение	100 мл
глюкоза	0,99 г
1 млн каКл2	1,8 мл
1М НаОН	Регулировка pH до 7,4
Д.У.	Наполните до 1000 мл
Клеточный ресуспенсионный раствор (15 мл)
БСА	30 мг
50X Антибиотики стоковый раствор	0,3 мл
Тиродное решение	15 мл
Растворы для иммуноокрашивания
Клеточный адгезивный раствор (0,3 мл)
Селл-Так	0.01 мл
0,1 М NaHCO3 (pH8,0)	0.285 мл
0,1 М НаОН	0.005 мл
Блокирующий раствор пермеабилизина (10 мл)
Фетальная бытовая сыворотка	1 мл
Тритон Х-100	1 мл
10X PBS	1 мл
Д.У.	7 мл
K+ богатое решение для пипетки
Аспартат калия	70 мМ
ККл	50 мМ
KH2PO4	10 мМ
МгСО4	1 мМ
АТФ динатриевая соль	3 мМ
Соль лития GTP	0.1 мМ
ЭГТА	5 мМ
ХЕПЕС	5 мМ
Ко	Регулировка pH до 7,2
Решения для вестерн-блотов
Буфер лизиса (1 мл)
Буфер HEPES	0.86 мл
Нонидет-П40	0.1 мл
Коктейль ингибиторов протеазы	0.04 мл
Буфер выполнения (1000 мл)
10X TG (0,25 М Трис и 1,92 М Глицин)	100 мл
СДС	1 г
Д.У.	900 мл
Буфер передачи (1000 мл)
10X ТГ	100 мл
метанол	200 мл
Д.У.	700 мл
Буфер блоттинга (TBST) (1000 мл)
5М НаКл	20 мл
2M Трис-HCl (рН 7,5)	5 мл
10% анимация 20	10 мл
Д.У.	965 мл

Таблица 2. Описание рабочих растворов для выделения клеток сердца, иммуноокрашивания и вестерн-блоттинга. Подготовьте все рабочие решения непосредственно перед экспериментами.

Дополнительный рисунок 1. Схема изоляции клеток. Технологическая схема выделения желудочковых и предсердных миоцитов и фибробластов сердца из одного сердца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот рисунок.

Обсуждение

Поскольку сердце очень восприимчиво к ишемии, время, необходимое для иссечения сердца и погружения его в ледяной CIB-EGTA для остановки сокращения, должно быть как можно короче (<1 мин). Это первый критический шаг этого метода. Второй критический шаг касается направления сердца. Особая ориентация иссеченного сердца на этапе 2.1.2 облегчает просмотр и удаление жира и соединительных тканей вокруг аорты. После очистки вокруг аорты поместите зажатое сердце передней стороной поверхности вверх на перфузионную пластину. Последний критический этап включает в себя введение инъекционной иглы. При продвижении иглы к сердцу инъекционная игла не должна отделяться от перфузионной пластины, чтобы поддерживать постоянное расстояние от пластины. Положение вставки находится вблизи вершины левого желудочка. Вставляйте иглу осторожно, не скручивая, так как такое скручивание может увеличить отверстие. Глубину введения иглы можно оценить, наблюдая за красной меткой. Если игла вставлена слишком глубоко, наконечник может проткнуть желудочковую перегородку и войти в правый желудочек или через митральный клапан и войти в левое предсердие. После подтверждения исчезновения крови из коронарной артерии иглу следует закрепить скотчем к перфузионной пластине.

Более длинная длина аорты затрудняет зажим аорты в правильном положении. Если зажим находится слишком далеко от предсердий, сердце может вращаться после инфузии перфусата. Чтобы предотвратить это, отрежьте аорту прямо под брахиоцефальной артерией, чтобы укоротить аорту перед зажатием.

Если кровь не начинает отступать после перфузии с начальной скоростью 0,5 мл/мин, увеличьте скорость до 1 мл/мин. Если это не помогает, инъекционная игла может быть расположена неправильно, например, в правом желудочке, перегородке желудочков или левой стенке миокарда. В таком случае немедленно извлеките иглу и попробуйте повторно вставить ее возле вершины левого желудочка. При введении иглы несколько раз переваренные клетки могут вытекать из открытых отверстий. Обратите внимание, что это обычно не оказывает серьезного влияния на изоляцию клеток.

Операторы могут контролировать весь процесс антеградной перфузии сердца с помощью стереоскопического микроскопа, чтобы наблюдать изменения цвета и прозрачности и перезапуск биения предсердий вместе с пищеварением. В общей сложности 10 мл ферментной смеси должны быть максимально необходимыми, даже для старого сердца. В молодых сердцах (5-7 недель) мы уменьшаем объем до 9 мл, что аналогично подходу через ретроградную перфузию с той же смесью ферментов.

Супернатант при конечной центрифугировании содержит мусор, клетки крови и немиоциты, тогда как гранула содержит в основном кардиомиоциты и загрязняющие немиоциты, такие как фибробласты и эндотелиальные клетки. Чтобы очистить кардиомиоциты, необходимо больше шагов. В общем, гранулу следует повторно суспендировали в соответствующей среде клеточного культивирования и предварительно наносили в течение 2 ч при 37°С на чашку для культуры клеток ткани, а затем осторожно удалять кардиомиоциты путем пипетирования и предварительного покрытия для культивирования.

Ферментная смесь содержит низкую концентрацию Ca²⁺ (0,3 мМ). Поэтому мы инкубируем переваренные клетки в CIB-Ca²⁺-BSA (1,2 мМ Ca²⁺⁾перед окончательным повторным суспензией раствором для повторного суспензии клеток (1,8 мМ Ca^2+),и постепенное увеличение Ca²⁺ позволяет избежать повреждения клеток^7. До тех пор, пока изолированные кардиомиоциты неповреждены (покоящиеся клетки без сокращения), эта процедура адаптации Ca²⁺не влияет на жизнеспособность клеток у мышей. Поскольку поврежденные клетки умирают во время этой инкубации, мы, следовательно, получаем здоровую группу клеток. Аналогичным образом, изолированные интактные предсердные миоциты (покоятся клетки без нерегулярного сокращения) могут храниться в том же растворе для ресуспензии клеток. Тем не менее, предсердные миоциты, как правило, более деликатны для хранения по сравнению с желудочковыми миоцитами.

В лаборатории этот метод изоляции почти всегда успешен, если только введение иглы в левый желудочек не дает сбоя. Нам также удалось изолировать клетки из гипертрофированного сердца, полученные хирургическим поперечным сужением аорты. Однако у пожилых мышей, у которых часто возникают небольшие инфаркты миокарда, перфузия прекращается в некоторых местах, что приводит к неполному пищеварению и, следовательно, низкому выходу(рисунок 1С),аналогично ретроградный метод на основе Лангендорфа. В таких случаях искаженная форма сердца может наблюдаться даже в начале перфузии.

Этот метод антеградной перфузии полезен для выделения клеток сердца у мышей разного возраста, но не от более крупных животных, таких как кролики и морские свинки. Возможно, удастся применить этот метод к неонатальным или молодым крысам перед отлучением от отлучения от детей.

Одним из преимуществ этого метода антеградной перфузии является то, что он уменьшает технические препятствия, связанные с использованием метода ретроградной перфузии на основе Лангендорфа для маленьких мышечных сердец. Время, необходимое для перфузии, составляет примерно 7 мин с 10 мл ферментов, этот короткий период пищеварения повышает жизнеспособность клеток. Кроме того, он позволяет проводить перфузию через коронарную циркуляцию сердца, даже после того, как аортальные клапаны были переварены. Выделение предсердных миоцитов обычно требует ретроградной перфузии на основе Лангендорфа и дальнейшей инкубации с ферментами^17. Этот антеградный перфузионный подход, однако, может глубоко перфузить ткань ферментом для выделения предсердных миоцитов.

В экспериментах с использованием нескольких мышей аппарат Лангендорфа следует очистить перед перфузией следующего сердца. Однако в настоящем антеградном способе, если желаемое количество наборов инструментов (например, иглы для шприцев и перфузионных пластин) приготовлено заранее, перфузию можно выполнять непрерывно.

Здесь мы сообщаем основную методологию антеградной перфузии сердца мыши с использованием тех же растворов, что и метод ретроградной перфузии на основе Лангендорфа без дополнительных химических веществ. Состав перфусата может быть изменен в соответствии с целью эксперимента, например, с использованием моющего средства, содержащего EGTA, вместо ферментов для создания децеллюляризованного сердца^18.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin B	Wako Pure Chemical Industries, Japan
Alexa Fluor 488 anti-mouse IgG antibody	Molecular Probes, USA	A11001	Fluorescent-labeled secondary antibody. (1:400 dilution for immunostaining)
Anti-α-actinin (ACTN)	Sigma-Aldrich, USA	A7811	Mouse monoclonal antibody (clone EA-53). (1:400 dilution for immunostaining)
Anti-atrial natriuretic peptide (ANP)	Merck-Millipore, USA	AB5490-I	Rabbit polyclonal antibody (1:2000 dilution for Western blots)
Anti-Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)	Cell Signaling Technology, USA	2118	Mouse monoclonal antibody (1:10000 dilution for Western blots)
Anti-smooth muscle actin (SMA)	Dako, Denmark	M0851	Mouse monoclonal antibody (clone 1A4) (1:400 for immunostaining)
Anti-rabbit IgG antibody	Amersham, GE Healthcare, USA	NA934	Secondary antibody (1:10000 dilution for Western blots)
ATP disodium salt	Sigma-Aldrich, USA	A26209
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich, USA	A9418
Cell-Tak	Corning	354240	Biological material for adhesion of the cell or tissues
Chemi-Lumi One Super	Nacalai Tesque, Japan	02230-14	Chemiluminescent reagent used for western blotting.
Collagenase Type 2	Worthington Biochemicals, USA	LS004176	Choose the activity guaranteed to be greater than 300 unit/mg.
Complete Mini	Roche, Germany	11836153001	A mixture of several protease inhibitors.
4'6'diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Nacalai Tesque, Japan	11034-56	Used for cell-impermeant nuclear stainig
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Nacalai Tesque, Japan	08458-45	including 4.5 g/L gluose
Extension tube	Top, Japan	X1-50	Connect with syringe and injection needle for antegrade perfusion.
EPC-8 patch-clamp amplifier	HEKA, Germany
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich, USA	F7524-500ML
Glass capillaries	Narishige Scientific Instrument Lab., Japan		outside diameter 1.5 mm, inside diameter 0.9 mm
GTP lithium salt	Sigma-Aldrich, USA	G5884
Horizontal microelectrode puller	Germany)	P-97
Heater mat	Natsume Seisakusho, Japan	KN-475-3-40	Equipment to warm the perfusion plate.
Infusion pump	TERUMO, Japan	TE-311	Infusion syringe pump for antegrade perfusion.
Injeciton needle (27 gauge)	TERUMO, Japan	NN-2719S	Needle for insertion into the left ventricle.
Insulin (from bovine pancrease)	Sigma-Aldrich, USA	I5500	Dissolve in 0.1 M HCl.
Mini cordless grinder	Funakoshi, Japan	cG-4A	Small grinder for homogenizing tissue in 1.5 mL sample tube.
4%-Paraformaldehyde Phosphate Buffer solution (4% PFA)	Nacalai Tesque, Japan	09154-85
Penicillin G potassium	Nacalai Tesque, Japan	26239-84
Phenol Red	Nacalai Tesque, Japan	26807-21
10X Phosphate Buffered Saline (pH7.4) (10X PBS)	Nacalai Tesque, Japan	27575-31
Plastic multi-well culture plate	Falcon, USA	353226	Use the lid of the multi-well culture plate as the perfusion plate.
Plastic syringe (20 mL)	TERUMO, Japan	SS-20ES	Use for infusion of CIB-EGTA.
Plastic syringe (30 mL)	TERUMO, Japan	SS-30ES	Use for infusion of Enzyme-mix
Plastic transfer pipette	Sarstedt, Germany	86.1171	Cut the tip just before sucking mouse heart into the pipette.
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane	Merck-Millipore, USA	IPVH00010	Immobilin-P membrane (Transfer membrane for protein blotting)
Protease	Sigma-Aldrich, USA	P5147	A mixture of three or more proteases including extracellular serine protease.
4X Sample buffer solution	Fuji Film, Japan	198-13282	Contains 0.25 M Tris-HCl (pH 6.8), 8 w/v% SDS,40 w/v% Glyceroland 0.02 w/v% BPB
SDS polyacrylamide gel  (15%)	Fuji Film, Japan	193-14991
Streptomycin sulfate	Nacalai Tesque, Japan	32237-14
10X Tris-Glycine buffer solution (10X TG)	Nacalai Tesque, Japan	09422-81	Contains 0.25 M-Tris and 1.92 M-Glycine, (pH 8.3)
Trypsin	Sigma-Aldrich, USA	T8003	Trypsin from bovine Type 1.
Vascular clamp	Karl Hammacher GmbH, Germany	HSE 004-35	Small straight vascular clamp used for clamping aorta.
All other reagents	Nacalai Tesque, Japan