Method Article
Этот протокол описывает настройку биореактора ЯМР для поддержания жизнеспособности инкапсулированных клеток человека в течение 72 ч, с последующим сбором и анализом внутриклеточных данных ЯМР с временным разрешением. Методика применяется для мониторинга внутриклеточных белково-лигандных взаимодействий в режиме реального времени.
Внутриклеточный ЯМР – это уникальный подход к наблюдению структурных и динамических свойств биологических макромолекул при атомном разрешении непосредственно в живых клетках. Можно наблюдать сворачивание белка, химические модификации и конформационные изменения, вызванные связыванием лигандов. Поэтому данный метод имеет большой потенциал в контексте разработки лекарственных средств. Однако короткое время жизни клеток человека, заключенных в ЯМР-спектрометре, ограничивает диапазон применения внутриклеточного ЯМР. Чтобы преодолеть эту проблему, используются биореакторы ЯМР, которые могут значительно улучшить стабильность образца клеток с течением времени и, что важно, позволяют регистрировать в реальном времени спектры ЯМР в клетке. Таким образом, эволюция таких процессов, как проникновение лиганда и связывание с внутриклеточной белковой мишенью, может контролироваться в режиме реального времени. Биореакторы часто ограничены низкой жизнеспособностью клеток при высоком количестве клеток, что приводит к компромиссу между общей чувствительностью эксперимента и жизнеспособностью клеток. Недавно мы сообщили о биореакторе ЯМР, который поддерживает высокое количество метаболически активных клеток человека в течение длительных периодов времени, до 72 ч. Эта установка была применена для мониторинга белково-лигандных взаимодействий и химической модификации белка. Мы также ввели рабочий процесс для количественного анализа данных ЯМР в реальном времени, основанный на многомерном разрешении кривой. Способ обеспечивает профили концентраций химических веществ, присутствующих в клетках, в зависимости от времени, которые могут быть дополнительно проанализированы для получения соответствующих кинетических параметров. Здесь мы приводим подробное описание установки биореактора ЯМР и его применения для мониторинга белково-лигандных взаимодействий в клетках человека.
Внутриклеточная спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) в последнее время стала мощным подходом к исследованию структурных и динамических свойств макромолекул в клеточной среде1,2,3,4,5,6. Внутриклеточный ЯМР преуспел в исследовании функционально значимых процессов, таких как сворачивание/неправильное сворачивание белка7,8,9, связывание металлов7,10, образование дисульфидных связей11,12 и белково-белковое взаимодействие13, взаимодействие белок-лиганд14,15,16 и взаимодействие нуклеиновых кислот-лигандов17 ,18 в живых клетках человека. Одним из ограничивающих факторов применения ЯМР в клетках является короткое время жизни клеток во время эксперимента. Решение этой проблемы предполагает использование биореакторов ЯМР. В этих устройствах постоянный поток питательной среды применяется к клеткам, которые содержатся в пределах ЯМР-спектрометра, чтобы обеспечить кислород и питательные вещества и удалить токсичные побочные продукты. После появления внутриклеточных ЯМР было разработано несколько конструкций биореакторов ЯМР для повышения жизнеспособности клеток в течение более длительных периодов времени, в которых либо бактерии, либо клетки млекопитающих инкапсулируются в гидрогель19,20,21,22 или хранятся во взвешенном состоянии и перфузируются с помощью микродиализной мембраны23. . Такие биореакторы позволили получить более длительные эксперименты ЯМР с повышенным отношением сигнал/шум (S/N)5 и, что еще более важно, могли быть использованы для исследования клеточных процессов в режиме реального времени22,23,24. Благодаря высокой химической и конформационной чувствительности ЯМР, последнее применение может дать ценную информацию о кинетике функциональных процессов в живых клетках с атомным разрешением.
В этом протоколе мы показываем, как настроить и эксплуатировать улучшенный биореактор, о котором недавно сообщалось25, который был получен путем объединения существующей модульной конструкции биореактора23 с подходом, основанным на инкапсуляции клеток в гидрогеле, которые были впервые предложены другими группами19,20,21,22,26,27 . Описано применение биореактора к внутриклеточным ЯМР-исследованиям внутриклеточного белка с наблюдением за связыванием лигандов в клетках HEK293T в режиме реального времени. В биореакторе клетки инкапсулируются с высокой плотностью в нити агарозного геля и поддерживаются высокожизнеспособными и метаболически активными в течение 72 ч, в течение которых регистрируются внутриклеточные ЯМР-эксперименты в режиме реального времени. Биореактор состоит из стеклянной трубки, которая подходит для стандартных 5 мм ЯМР-зондов, которые являются водонепроницаемыми и подключены к держателю трубки, так что внутренняя камера для отбора проб имеет внутренний диаметр 4,2 мм, высоту 38 мм и объем 526 мкл. Входное отверстие представляет собой капилляр PEEK длиной 7 метров (o.d. = 1/32", т.д. = 0,5 мм), вставленный в камеру для отбора проб до ~6 мм от нижней части, в то время как выходное отверстие представляет собой капилляр PTFE длиной 7 метров (o.d. = 1/32", т.д. = 0,5 мм), прикрепленный в верхней части держателя трубки (рисунок 1). Трубка соосно вставляется в регулируемую температуру линию, соединенную с водяной баней. Входное и выходное отверстие соединены через трубку PEEK с 4-ходовым 2-позиционным клапаном, прикрепленным к насосу FPLC для управления потоком среды и контейнером для отходов.
Биореактор применяется для изучения кинетики взаимодействия, о котором сообщалось ранее14,25, между двумя препаратами, ацетазоламидом (AAZ) и метазоламидом (MZA), в клетках человека со второй изоформой карбоангидразы человека (CA II), фармакологически значимой мишенью28,29,30, и кинетики образования внутримолекулярной дисульфидной связи, стимулируемой малой молекулой ebselen25, 31, из не содержащей меди, связанной с цинком формы человеческой меди, супероксиддисмутазы цинка (SOD1), антиоксидантного фермента, участвующего в возникновении бокового амиотрофического склероза7,8,32. Наконец, количественный анализ данных ЯМР в реальном времени выполняется в MATLAB с использованием алгоритма Multivariate Curve Resolution-Alternating Least Squares (MCR-ALS)33, с помощью которого для наблюдаемых видов получаются чистые спектральные компоненты и профили концентраций в зависимости от времени, которые могут быть дополнительно проанализированы для получения соответствующих кинетических параметров.
Протокол начинается с колбы T75 из клеток HEK293T (~ 3 x 107 клеток на колбу), временно переэкспрессирующих либо человеческий CA II (без маркировки), либо человеческий SOD1 (меченый 15N). Клетки выращивали и поддерживали в колбах Т75 с высоким содержанием глюкозы DMEM по 1:10 проходов каждые 3-4 дня и трансфицировали кДНК, кодирующей интересующий белок за 48 ч до начала эксперимента. О шагах, связанных с этим этапом, подробно сообщается в другом месте34.
1. Настройка реагента и раствора
2. Настройка биореактора
3. Подготовка образца клетки
4. Эксплуатация и очистка биореактора
5. ЯМР-эксперименты
6. Анализ MCR-ALS
7. Тест трипана синего
Вышеуказанный протокол позволяет инкапсуляцию клеток в нити гидрогеля для максимизации жизнеспособности клеток в течение длительных периодов времени, необходимых для исследования внутриклеточных процессов в режиме реального времени. В биореакторе клетки поддерживаются живыми и метаболически активными до 72 ч, что подтверждается синим тестом Трипана (рисунок 2a-c). В принципе, этот протокол может быть применен для наблюдения за внутриклеточным интересующим белком, претерпевающим какие-либо конформационные или химические изменения. В первой заявке, описанной выше, биореактор применяют для мониторинга в режиме реального времени связывания двух ингибиторов, AAZ и MZA, с CA II, сверхэкспрессированным в цитозоле клеток HEK293T. Первый зарегистрированный спектр скульптуры возбуждения 1Н (zgesgp) используется для оценки общей интенсивности сигнала (которая пропорциональна количеству клеток), наличия сигналов от сверхэкспрессированного белка и однородности поля (рисунок 2d). В случае CA II внутриклеточное связывание двух ингибиторов можно контролировать с помощью 1D 1H ЯМР-спектров WATERGATE 3-9-1935 1D 1H (p3919gp), наблюдая сигналы 1H в области между 11 и 16 ppm. Эти сигналы возникают из цинк-координационных гистидинов и других ароматических остатков CA II36 и нарушаются при связывании лигандов14,15. Концентрации лигандов могут быть выбраны на основе скорости диффузии или, при наличии, из ранее определенных значений проницаемости14. Успешное связывание подтверждается визуально появлением дополнительного набора сигналов в интересующей спектральной области, который постепенно заменяет исходные сигналы (рисунок 3). Зависящие от времени кривые связывания получены методом анализа MCR-ALS, который разделяет два набора сигналов ЯМР, возникающих из свободного и связанного СА II (рисунок 4a), и одновременно обеспечивает относительные профили концентрации двух видов (рисунок 4b). Во втором применении биореактор применяют для мониторинга образования связанной с цинком внутримолекулярной дисульфидной связи SOD1, продвигаемой эбселеном, миметиком глутатионпероксидазы, в клетках человека. Этот процесс контролируется путем наблюдения за изменениями в спектрах 1H-15N 2D SOFAST-HMQC37 (которые обеспечивают отпечаток конформации белковой основы), вызванными возмущениями структуры белка, вызванными образованием дисульфидной связи. Дополнительные сигналы, возникающие в результате дисульфид-окисленного SOD1, появляются в спектре 1H-15N и постепенно заменяют сигналы дисульфид-восстановленного SOD1. Анализ MCR-ALS на отдельных областях 2D-спектра разделяет сигналы, возникающие от двух видов (рисунок 5a), и дает их относительные профили концентрации (рисунок 5b). Полученные кривые концентрации могут быть дополнительно проанализированы методом нелинейной примерки для получения информации о кинетике исследуемых процессов25.
Рисунок 1: Схема биореактора. Слева: вид поперечного сечения блока пустого потока. Справа: схема установки биореактора. Впускные трубки PEEK показаны зеленым цветом; выпускная трубка из PTFE показана синим цветом. Левая панель воспроизводится с разрешения Luchinat et al.25. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Тест Trypan Blue на инкапсулированных клетках и проверка образцов с помощью 1H ЯМР. Репрезентативные срезы агарозы, содержащие внедренные клетки и окрашенные трипановым синим цветом, (а) сразу после отливки и (б) через 72 ч в биореакторе; (c) жизнеспособность клеток в зависимости от времени в биореакторе ЯМР при активном потоке (черный) и в статических условиях (красный), измеренная с помощью теста Трипана Блю. (d) спектры ЯМР zgesgp 1H, зарегистрированные на встроенных в агарозу клетках, сверхэкспрессирующих CA II в отсутствие (черный) и в присутствии (красный) пузырьков газа в биореакторе. В последнем случае снижение однородности поля вызывает расширение линий и появление артефактов подавления растворителей. Обозначены интересные спектральные особенности. Панели (a-c) воспроизводятся с разрешения Luchinat et al.25. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Репрезентативные внутриклеточные данные ЯМР 1H в реальном времени, полученные на инкапсулированных агарозой клетках в биореакторе. Каскадные графики 1D 1H ЯМР-спектров (область между 15,6 и 11,1 ppm) клеток HEK293T, сверхэкспрессирующих CA II и впоследствии обработанных (a) 25 мкм AAZ и (b) 10 мкМ MZA, зарегистрированных как функция времени в биореакторе ЯМР. Время обработки лигандами показано стрелкой. Спектральная интенсивность (a.u.) имеет цветовую кодировку от синего (самый низкий) до желтого (самый высокий). Эта цифра воспроизводится с разрешения Luchinat et al.25. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативный выход MCR-ALS из спектров 1D ЯМР. (a) 1H ЯМР спектров чистых компонентов, реконструированных MCR-ALS: CA II в отсутствие лигандов (черный) и в комплексе с AAZ (красный) или MZA (пурпурный); (b) относительные профили концентрации свободного (черного) и связанного CA II в зависимости от времени при добавлении AAZ (красный) или MZA (пурпурный), полученные MCR-ALS. Время обработки лигандами обозначено стрелками. Эта цифра воспроизводится с разрешения Luchinat et al.25. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Репрезентативный выход MCR-ALS из спектров 2D ЯМР. (a) спектральные области 1H-15N (обозначенные I-IV) чистых компонентов, реконструированных MCR-ALS: дисульфид-восстановленный SOD1 (черный) и дисульфид-окисленный SOD1 (красный); b) профиль относительной концентрации чистых компонентов в зависимости от времени при добавлении эбселена (отмеченного стрелкой), полученного MCR-ALS. Эта цифра воспроизводится с разрешения Luchinat et al.25. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Целью использования биореактора для эксперимента с внутриклеточным ЯМР является поддержание жизни и метаболической активности клеток в течение длительного периода времени. Для достижения этой цели необходимо учитывать ряд важнейших аспектов. Во-первых, крайне важно избегать бактериального загрязнения при подготовке образца клеток и во время сбора данных ЯМР. Если штаммы E. coli или других бактерий, обычно используемых для клонирования генов и экспрессии рекомбинантного белка, используются в лаборатории, они могут загрязнять клетки во время подготовки образца. Попав в биореактор, бактерии будут быстро расти, используя свежую питательную среду, и будут вызывать гибель клеток из-за производства эндотоксинов. Бактериальное загрязнение обнаруживается только на запущенной стадии, когда оно превращает среду роста в желтый и мутный. Кроме того, неполная очистка биореактора может привести к загрязнению насоса или трубки бактериями, дрожжами или обычными плесенями.
Обязательным условием успеха эксперимента является недопущение образования газовых пузырьков. Пузырьки газа, захваченные между нитями агарозы в активном объеме катушки ЯМР, внесут большие неоднородности магнитного поля, вызывая неполное подавление сигнала H2O и серьезную потерю спектрального качества (рисунок 2d). Пузырьки могут быть вызваны воздухом, захваченным в системе, или образованием газообразного CO2. Первого можно легко избежать, промыв систему средой перед введением образца клетки, в то время как во избежание последнего рекомендуется уменьшить концентрацию NaHCO3 в питательной среде и поддерживать все части системы при постоянной температуре, чтобы свести к минимуму различия в растворимости CO2 . Клеточный аэробный метаболизм также может вызывать образование газообразного CO2, который можно предотвратить, увеличив скорость потока.
Жизнеспособность клеток должна проверяться после каждого запуска Trypan Blue Test. Однако это не дает представления о метаболической активности. Для получения более полной картины метаболического состояния клеток во время работы биореактора можно выполнить ЯМР-спектры 31P для оценки продукции АТФ в зависимости от времени23,25. Однако для этого измерения часто необходим специальный зонд, который может позволить одновременную запись с 1H ЯМР.
В случае CA II наличие хорошо разрешенных репортерных сигналов в необычной области спектра 1H облегчает анализ из простых спектров 1D ЯМР и не требует обогащения изотопами во время экспрессии белка. В целом, другие белки могут давать сигналы 1H, полезные для мониторинга спектральных изменений в других областях, таких как типичное для гидрофобного ядра белка от 0 до -1 ppm11; однако эти области, как правило, переполнены для свернутых белков размером более ~ 10 кДа. В этом случае, как показано для SOD1, предпочтительно обогащать белок 15N, обеспечивая равномерно обогащенную 15N питательную среду во время экспрессии белка, и контролировать изменения в 2D 1H-15N ЯМР-спектрах 2D 1H-15N. 2D-спектры импортируются в виде 2D-массивов в MATLAB, перестраиваются в 1D-массивы и складываются перед анализом MCR-ALS. Последний подход в целом применим к любому внутриклеточному белку, который порождает обнаруживаемые сигналы, и предоставляет информацию о конформационных изменениях белка на уровне одного остатка. В принципе, последний подход может быть обобщен на спектры nD и на другие схемы маркировки изотопов.
Что касается применения к различным типам клеток, протокол должен быть легко адаптирован к различным клеточным линиям и не требует, чтобы интересующий белок непосредственно экспрессировался в клетках. Поэтому другие подходы к внутриклеточному ЯМР могут быть объединены с этим протоколом, в котором макромолекула, представляющая интерес, производится рекомбинантно или синтезируется, а затем вводится в ячейки электропорацией или другими способами доставки1,9,38. При работе с различными клеточными линиями или протоколами пробоподготовки такие параметры, как концентрация агарозы, толщина резьбы и конечная плотность ячеек в нитях агарозы, возможно, потребуется оптимизировать эмпирически. Кроме того, применимость протокола, описанного здесь, ограничена клетками, которые переносят инкапсуляцию агарозы. Другие типы клеток могут требовать различных составов гидрогелей, тогда как другая установка рекомендуется при анализе клеток, которые изначально растут в суспензии, например, с использованием коаксиальной микродиализной мембраны для обеспечения диффузии питательных веществ при сохранении взвешенных клеток, ограниченных в трубке ЯМР23.
По сравнению с другими конструкциями биореакторов ЯМР19,20,21,22, устройство, описанное здесь, опирается на коммерчески доступный блок потока, адаптированный с незначительными изменениями. Поэтому устройство можно легко тиражировать в разных лабораториях с высокой воспроизводимостью. Кроме того, он обеспечивает стандартизированную работу и полное соблюдение строгих лабораторных правил безопасности, если это необходимо. В целом, гибкость и простота работы биореактора должны позволить использовать многие другие применения раствора ЯМР, как в клетках, так и in vitro, в дополнение к тем, о которых уже сообщалось23,25. В конце концов, та же конструкция биореактора может быть применена к образцам, которые больше напоминают физиологическую среду ткани, такие как сфероиды или органоиды, при условии, что будут найдены соответствующие каркасы для поддержания таких образцов живыми или даже поддержания их роста в ЯМР-спектрометре.
Авторы заявляют, что конфликта интересов нет.
Эта работа была поддержана iNEXT-Discovery, номером гранта 871037, финансируемым программой Horizon 2020 Европейской комиссии, Instruct-ULTRA, номером гранта 731005, проектом ЕС H2020 для дальнейшего развития услуг Instruct-ERIC, и грантом Ministero dell'Istruzione, dell'Università e della Ricerca PRIN 20177XJCHX. Авторы признают поддержку Instruct-ERIC, знакового проекта ESFRI, посредством присуждения премии JRA No 815 и использования ресурсов Итальянского центра CERM/CIRMMP. Мы благодарим Маттео Пеннестри (Bruker, Великобритания) за поддержку работы блоки потока InsightMR.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials | |||
Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275 | |
D2O | Sigma-Aldrich | 453366 | |
DMEM, high glucose | Life Technologies | 10313-021 | |
DMEM, high glucose, powder | Sigma-Aldrich | D5648 | |
FBS | Life Technologies | 10270 | |
HCl | Sigma-Aldrich | 30721 | |
L-glutamine (200 mM) | Life Technologies | 25030 | |
Low-gelling agarose, powder | Sigma-Aldrich | A4018 | |
NaHCO3, powder | Carlo Erba | 478537 | |
PBS | Life Technologies | 10010 | |
Penicillin–streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
NaOH, pellets | Sigma-Aldrich | 30620 | |
Trypan Blue solution (0.4% (wt/vol) | Sigma-Aldrich | T8154 | Hazard statement(s): H350 may cause cancer. |
Trypsin–EDTA (0.05% (wt/vol)) | Life Technologies | 25300-054 | |
Equipment | |||
Avance III Spectrometer equipped with a 5 mm CryoProbe | Bruker | n/a | All modern spectrometers and narrow-bore magnets equipped with 5 mm probes are compatible. |
InsightMR flow unit | Bruker | n/a | |
P-920 pump module from ÄKTA FPLC | GE Healthcare | n/a | Any FPLC, HPLC peristaltic or syringe pump should be compatible with the flow unit. |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены