Использование секвенирования следующего поколения для выявления мутаций, связанных с восстановлением CAS9-индуцированного разрыва двойной цепи вблизи промотора CD4

Резюме

Здесь представлена эндонуклеаза sgRNA/CAS9 и протокол секвенирования следующего поколения, который может быть использован для идентификации мутаций, связанных с восстановлением двухцепочечного разрыва вблизи промотора CD4.

Аннотация

Двухцепочечные разрывы (DSB) в ДНК являются наиболее цитотоксическим типом повреждения ДНК. Поскольку множество оскорблений может привести к этим поражениям (например, стресс репликации, ионизирующее излучение, невосстановленное УФ-повреждение), DSB возникают в большинстве клеток каждый день. В дополнение к гибели клеток, невосстановленные DSB снижают целостность генома, и возникающие мутации могут привести к опухолевому генезу. Эти риски и распространенность DSB мотивируют исследования механизмов, с помощью которых клетки восстанавливают эти поражения. Секвенирование следующего поколения может быть сопряжено с индукцией DSB ионизирующим излучением, чтобы обеспечить мощный инструмент для точного определения мутаций, связанных с дефектами восстановления DSB. Однако этот подход требует вычислительно сложного и дорогостоящего секвенирования всего генома для обнаружения восстановления случайно возникающих DSB, связанных с ионизирующим излучением. Редкие режущие эндонуклеазы, такие как I-Sce1, обеспечивают способность генерировать один DSB, но их сайты распознавания должны быть вставлены в интересующий геном. В результате место ремонта по своей сути является искусственным. Последние достижения позволяют направлять РНК (sgRNA) направлять эндонуклеазу Cas9 в любой интересующий его локус генома. Это может быть применено к исследованию восстановления DSB, что делает секвенирование следующего поколения более экономически эффективным, позволяя ему сосредоточиться на ДНК, фланкирующей CAS9-индуцированный DSB. Цель рукописи состоит в том, чтобы продемонстрировать осуществимость этого подхода путем представления протокола, который может определить мутации, возникающие в результате восстановления DSB перед геном CD4. Протокол может быть адаптирован для определения изменений мутагенного потенциала DSB, связанных с экзогенными факторами, такими как ингибиторы репарации, экспрессия вирусного белка, мутации и воздействие окружающей среды с относительно ограниченными требованиями к вычислениям. После того, как геном организма был секвенирован, этот метод теоретически может быть использован в любом геномном локусе и в любой модели клеточной культуры этого организма, которая может быть трансфектирована. Подобные адаптации подхода могут позволить сравнивать точность репарации между различными локусами в одном и том же генетическом фоне.

Введение

Поддержание геномной стабильности имеет решающее значение для всех живых организмов. Точная репликация ДНК и надежный ответ на повреждение ДНК (DDR) необходимы для добросовестного распространения генетического материала ^1,2. Повреждения ДНК происходят регулярно в большинстве клеток ^2,3. Когда эти повреждения ощущаются, прогрессирование клеточного цикла останавливается, и активируются механизмы репарации ДНК. Двухцепочечные разрывы в ДНК или DSB являются наиболее токсичным и мутагенным типом повреждения ДНК ^3,4

протокол

1. Покрытие ячеек

1. Выращивайте клетки HFK LXSN и HFK 8E6 в 10 см пластинах в кератиноцитарной культуральной среде (10 мл / пластина) с добавкой роста кератиноцитов человека (HKGS) и 1% пенициллином / стрептомицином. Вырастите клетки примерно до 80% слияния при 37 °C в оболочке инкубатора с 5% CO₂.
2. Заменить культуральную среду 3 мл трипсина-ЭДТА (0,05%, этилендиамин тетрауксусной кислоты). Инкубировать при 37 °C в течение 3 мин. Нейтрализуют трипсин равным объемом фетальной бычьей сыворотки (FBS), дополненной средой, и переносят клетки в центрифужную трубку объемом 15 мл. Центрифуга при 300 х г в течение 5 мин.

Результаты

Для этого протокола представлены три репрезентативных результата. Рисунок 1 представляет собой иммуноблот, подтверждающий экспрессию CAS9 в контроле HFK (LXSN) и HFK, экспрессирующем бета-ВПЧ 8E6 (8E6). Через 48 ч после трансфекции цельклеточные лизаты собирали и ?.......

Обсуждение

Помимо глубины предоставляемой информации, у этого метода есть несколько преимуществ. Во-первых, репарация DSB, теоретически, может быть оценена в любом геномном локусе без изменения генома интересующей клетки. Во-вторых, доступ к анализу ремонта NGS увеличивается за счет снижения затрат .......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
6 Well Tissue Culture Plate	Celltreat	229106	Cell culture plate
BCA Kit	VWR	89167-794	BCA assay kit
Centrifuge 5910 R	Eppendorf	2231000772	Tabletop Centrifuge
CLC Genomic Workbench	Qiagen	832001	deep sequence data analysis software/indel caller/variant caller
Digital Microplate Genie pulse	Scientific industries	SI-400A	Plate shaker
DYKDDDDK Tag Monoclonal Antibody (FG4R)	ThermoFisher Scientific	MA191878	Anti-FLAG antibody
Epilife CF Kit	ThermoFisher Scientific	MEPICF500	Cell cultrue media and supplements
Fetal Bovine Serum (FBS)	VWR	89510-194	Cell culture supplement
Goat anti-Rabbit IgG	ThermoFisher Scientific	A-11012	Secondary antibody
HighPrep PCR Clean-up system	MagBio	AC-60005	Bead-based PCR cleanup kit
KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR Kit	KAPA Biosystems	KK2600	PCR mastermix/PCR assay
MagAttract HMW DNA kit	Qiagen	67563	High Molecular Weight DNA extraction kit
Magnetic Stand-96	Thermo Fisher Scientific	AM10027	96-Well Magnetic Rack
MiniAmp Thermal Cycler	Applied Biosystems	A37834	Thermal Cycler
Miseq	Illumina	SY-410-1003	Sequencer
Miseq v2 300 cycle reagent kit	Illumina	MS-102-2002	300-cycle cartridge/sequencing reagents
Nextera XT DNA Library Prep kit	Illumina	FC-131-1024	Library preparation kit
Nextera XT Kit v2 Set A	Illumina	20027215	Indexes
Nunc 96-well polypropylene DeepWell Stroage plates	Thermo Fisher Scientific	260251	deep well 96-well plates
Penicillin-Streptomycin Solution (100X)	Calsson Labs	PSL02-6X100ML	Antibiotics for cell culture
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Bio Basic	PD8117	PBS
px330-CD4	Addgen	136938	SgRNA/CAS9 plasmids targeting 5’- GGCGTATCTGTGTGAGGACT
QIAxcel Advanced System	Qiagen	9001941	capillary electrophersis machine
QIAxcel DNA screening kit	Qiagen	929004	DNA buffer/ capillary electrophersis tubes
Qubit 1x ds HS Assay Kit	ThermoFisher Scientific	Q23851	Fluorometer reagents/1x dsDNA solution
Qubit 4 Fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q33238	Fluorometer
Qubit Assay Tubes	Thermo Fisher Scientific	Q32856	Fluorometer assay tubes
RIPA Lysis Buffer	VWR	VWRVN653-100ML	Lysis buffer for protein extraction
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	ThermoFisher Scientific	25300054	Trypsin
Vortex-Genie 2	Scientific industries	SI-0236	Vortex
Xfect Transfection Reagent	Takara Bio	631318	Transfection reagent
genomic data analysis software	QIAGEN	CLC Workbench v21.0.	Data analysis software