Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
* Эти авторы внесли равный вклад
Тест активации базофилов представляет собой дополнительный диагностический тест in vitro для оценки аллергических реакций, опосредованных IgE, основанный на обнаружении активации базофилов в присутствии специфического стимула посредством измерения маркеров активации с помощью проточной цитометрии.
Тест активации базофилов (BAT) является дополнительным диагностическим тестом in vitro , который может использоваться в дополнение к клинической истории, кожному тесту (ST) и специфическому определению IgE (sIgE) при оценке IgE-опосредованных аллергических реакций на пищу, яд насекомых, лекарства, а также некоторые формы хронической крапивницы. Однако роль этого метода в диагностических алгоритмах сильно варьируется и не очень четко определена.
НИМ основан на определении базофильного ответа на активацию IgE аллергена/лекарственного средства путем измерения маркеров активации (таких как CD63, CD203c) с помощью проточной цитометрии. Этот тест может быть полезным и дополняющим инструментом, чтобы избежать контролируемых тестов для подтверждения диагноза аллергии, особенно у субъектов, испытывающих тяжелые опасные для жизни реакции. В целом, эффективность НИМ следует учитывать, если i) аллерген/лекарственное средство дает ложноположительные результаты при ST; ii) отсутствует источник аллергена/лекарственного средства для определения ST или sIgE; iii) существует несоответствие между анамнезом пациента и определением ST или sIgE; iv) симптомы свидетельствуют о том, что ST может привести к системному ответу; v) перед рассмотрением ККТ для подтверждения виновника аллергена/лекарственного средства. Основные ограничения теста связаны с неоптимальной чувствительностью, особенно при лекарственной аллергии, необходимостью выполнения теста не дольше 24 ч после извлечения образца и отсутствием стандартизации между лабораториями с точки зрения процедур, концентраций и клеточных маркеров.
Диагностика IgE-опосредованной аллергии основана на клинической истории, кожных тестах (STs), количественной оценке специфического IgE сыворотки (sIgE) и, если это требуется и показано, контролируемых испытаниях вызова (CCT)1,2,3,4,5,6. Тем не менее, клиническая история может быть ненадежной, поскольку может отсутствовать точная информация, а СТ и КСТ не являются безрисковыми процедурами, которые могут быть противопоказаны субъектам, испытывающим тяжелые опасные для жизни реакции 1,2,3,4,5,6 . Эти проблемы, наряду с тем фактом, что определение sIgE с помощью валидированных и коммерческих фторферментных анализов доступно только для нескольких аллергенов и лекарств, подчеркнули важную роль других функциональных анализов in vitro, таких как тест активации базофилов (BAT).
Базофилы являются ключевыми эффекторными клетками, участвующими в IgE-опосредованных аллергических реакциях, которые активируются при сшивании соседних sIgE, связанных с высокоаффинными рецепторами (FcεRI) на поверхности клеток после воздействия аллергена / лекарственного средства. Активация базофилов запускает дегрануляцию клеток и высвобождение предварительно сформированных и новых синтезированных медиаторов воспаления, содержащихся в гранулах интрацитоплазматической секреции 7,8,9. BAT - это метод in vitro, который пытается имитировать активацию базофилов в присутствии стимула (аллергена или лекарственного средства) и определяет изменения в экспрессии маркеров активации базофилов с помощью проточной цитометрии 7,10. Существуют различные стратегии для идентификации базофилов (IgE+, CCR3+, CRTH2+, CD203c+) и измерения активации клеток (в основном повышение регуляции CD63 и CD203c) с использованием комбинаций фторхром-меченых антител 7,10. CD63, лучший клиническиподтвержденный маркер активации 11,12,13,14, представляет собой мембранный белок, закрепленный на секреторных гранулах, содержащих гистамин, который после активации клеток и слияния гранул с мембраной экспрессируется на поверхности базофилов 15,16,17,18,19,20,21 . CD203c является поверхностным маркером, который конститутивно экспрессируется на базофилах и повышается после стимуляции FcεRI, что также показало надежные результаты в BAT 15,22,23,24,25. Кроме того, он, по-видимому, совместно экспрессируется с CD6326.
В последние десятилетия BAT оказался полезным в диагностике IgE-опосредованных аллергических реакций, вызванных различными триггерами, такими как лекарства, пища или ингалянты, а также при некоторых формах хронической крапивницы, как описано ниже. Однако положение этого метода в диагностических алгоритмах сильно варьируется и не очень четко определено.
Гиперчувствительность к лекарственным средствам
BAT оказался полезным в качестве дополнительного теста для отдельных лекарств и пациентов, особенно для тех, кто испытывает тяжелые реакции из-за того, что диагностическая ценность ST не является хорошо установленной для большинства лекарств, поскольку они проверены и стандартизированы для ограниченного числа лекарств 27,28,29,30. Кроме того, количественная оценка sIgE доступна только для ограниченного числа препаратов с более низкой чувствительностью, чем ST 27,28,29,30,31,32. Поэтому диагностика лекарственной гиперчувствительности обычно опирается на тест на лекарственную провокацию, который может быть противопоказан субъектам, испытывающим тяжелые угрожающие жизни реакции33.
Сообщалось о многообещающих результатах применения НИМ у отдельных пациентов, сообщивших о немедленных реакциях гиперчувствительности на различные препараты, такие как беталактамы (BL)20,34,35,36,37,38,39, нервно-мышечные блокирующие агенты (НМБА)19,22,40,41,42, 43,44,45, фторхинолоны (FQs)46,47,48,49, пиразолоны 50,51,52, радиоконтрастные среды (RCM)53,54,55,56 и соединения платины 57,58,59 . Сообщалось, что НИМ имеют чувствительность и специфичность между 51,7-66,9% и 89,2-97,8%, соответственно; а положительные и отрицательные прогностические значения описываются в диапазоне от 93,4% до 66,3%, соответственно27,31. Кроме того, BAT был предложен в качестве прогностического биомаркера прорывных реакций при десенсибилизации соединениями платины, поскольку экспрессия CD203c увеличивается по сравнению с CD63 у пациентов с высоким риском побочных реакций во время десенсибилизации лекарственного средства57.
Следует отметить, что БАТ полезен только при гиперчувствительности к лекарственным средствам, когда реакция включает дегрануляцию базофилов; поэтому он не полезен в реакциях, возникающих в результате ферментативного ингибирования циклооксигеназы 142.
Пищевая аллергия
BAT стал потенциальным диагностическим инструментом для пищевой аллергии, поскольку определение сывороточного sIgE к всему экстракту аллергена или отдельным аллергенам часто является неоднозначным, требуя перорального пищевого вызова для подтверждения диагноза, который, как и гиперчувствительность к лекарственным средствам, является дорогостоящей и не безрисковой процедурой60. Несколько исследований показали соответствующие результаты: коровье молоко61,62, яйцо 61,63, пшеница 64,65,66,67,68, арахис 63,69,70,71,72, фундук 73,74,75,76 ,77, моллюски78, персик 79,80,81, яблоко21, сельдерей и морковь82,83.
Основная добавленная ценность BAT в диагностике пищевой аллергии по сравнению с ST и sIgE в сыворотке крови заключается в том, что он показывает более высокую специфичность и аналогичную чувствительность. Таким образом, BAT является полезным инструментом для дифференциации клинически аллергических пациентов от сенсибилизированных, но толерантных субъектов, которые имеют как высокую специфичность (75-100%), так и чувствительность (77-98%)63,69,84. Значения чувствительности и специфичности зависят от аллергена и других факторов, таких как фенотипы (например, синдром оральной аллергии в сравнении с анафилаксией), возраст и связанные с географией паттерны сенсибилизации63,85.
BAT с использованием отдельных аллергенных компонентов потенциально может улучшить диагностическую точность для некоторых пищевых аллергенов61,80. Проводятся исследования с использованием белков хранения семян (например, Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3 и Ara h 6 из арахиса)86; белки переноса липидов (например, Pru p 3 из персика и Ara h 9 из арахиса)80,86; и Bet v 1 гомологи (например, Ara h 8 из арахиса)87. Другие потенциальные утилиты связаны с идентификацией виновника аллергена в случаях синдрома пыльцево-пищевой аллергии 21,87,88, аллергии на красное мясо 89 или пищевой анафилаксии, вызванной физическими упражнениями66.
Интересно, что BAT может предоставить информацию о тяжести и пороге аллергических реакций, поскольку у пациентов с более тяжелыми реакциями наблюдается большая доля активированных базофилов, как наблюдалось в исследованиях пациентов с аллергией на арахис и коровье молоко 84,90,91; и пациенты, реагирующие на следовые количества аллергена, демонстрируют большую чувствительность базофилов 84,90,92. Эти данные свидетельствуют о том, что BAT может быть полезен для выявления пациентов с аллергией высокого риска, которые нуждаются в более тщательном наблюдении и более интенсивном образовании93. Кроме того, сообщалось, что НИМ может предсказать ответы на пищевые проблемы 70,91,92,94 и пороги реактивности 90,95, чтобы помочь определить, когда пища может быть безопасно (повторно)введена84. Тем не менее, эти результаты являются спорными в некоторых исследованиях63,96 и требуются дополнительные исследования.
С другой стороны, НИМ использовался для мониторинга разрешения пищевой аллергии, естественной или под иммуномодулирующим лечением, с течением времени, которая до сих пор оценивалась только пероральным пищевым вызовом, с сопутствующими рисками и затратами 84,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106 ,107,108. Кроме того, он также использовался для мониторинга эффекта омализумаба при пищевой аллергии, поскольку активация базофилов уменьшается во время лечения омализумабом, но увеличивается после прекращения лечения109.
Ингаляционная аллергия
BAT редко полезен при ингаляционной аллергии, поскольку диагноз может быть установлен с помощью количественной оценки sIgE и ST. Однако в случаях местного аллергического ринита (неопределяемые уровни sIgE и отрицательные СТ с положительными тестами на провокацию носа) НДТ позволил поставить диагноз в 50% случаев110. Далее сообщалось о корреляции между чувствительностью базофилов и реакцией на носовые/бронхиальные провокационные тесты, а также между тяжестью астмы и эффективностью лечения омализумабом 111,112.
BAT также использовался для мониторинга аллергенной иммунотерапии клещей домашней пыли и пыльцы, поскольку чувствительность базофилов снижается во время иммунотерапии, вероятно, из-за вмешательства в блокирование антител IgG 113 114 115 116 117.
Аллергия на яд перепончатокрылых
Диагностика аллергии на яд перепончатокрылых обычно основывается на ST и сыворотке sIgE. BAT показал высокую чувствительность (85-100%) и специфичность (83-100%) и, как сообщается, он полезен в случаях, которые дают неоднозначные результаты или у пациентов с наводящей клинической историей аллергии на яд, но неопределяемым sIgE и отрицательным ST118,119. Тем не менее, BAT, по-видимому, не предсказывает тяжесть этих реакций120 121.
До 60% пациентов проявляют sIgE как к яду осы, так и к пчелиному яду, и идентификация доминирующего аллергена имеет решающее значение для адекватного лечения иммунотерапией. В этих случаях, как сообщается, BAT полезен для идентификации доминирующего аллергена119 122 123 124. Хотя sIgE к основным аллергенам пчелиных и осиных ядов может снизить полезность BAT у пациентов с двойной положительностью к обоим ядам, он предоставляет полезную информацию в основном у субъектов с отрицательными результатами в определениях sIgE123.
Некоторые исследования показывают, что BAT может быть полезен в качестве прогностического биомаркера побочных эффектов во время фазы наращивания иммунотерапии ядом, поскольку этот вариант лечения, как сообщается, снижает чувствительность базофилов. Тем не менее, реактивность не уменьшается, и эта утилита BAT в настоящее время является спорной 13 120 125 126 127 128 129 130.
Крапивница и ангионевротический отек
Подгруппа пациентов с хронической крапивницей имеет аутоинмунную патофизиологию из-за аутоантител IgE к аутоаллергенам и аутоантителам IgG, которые нацелены на комплексы FcεRI или IgE-FcεRI, присутствующие на поверхности тучных клеток131,132. В клинической практике диагностика этого типа хронической крапивницы опиралась на положительную аутологичную сыворотку ST, которая имеет риск случайного заражения. BAT был предложен в качестве теста in vitro для диагностики и мониторинга пациентов с подозрением на хроническую крапивницу. Сообщалось, что экспрессия CD63 и CD203c на поверхности базофилов увеличивается после стимуляции сыворотками у пациентов с хронической крапивницей, показывая обнаружение активных аутоантител 133 134 135 136 137. Недавно сообщалось, что пациенты с положительным BAT часто испытывают наиболее активное болезненное состояние, оцениваемое по показателю активности крапивницы, и нуждаются в более высоких дозах антигистаминных препаратов вместе с лечением третьей линии (циклоспорин А или омализумаб) по сравнению с пациентами с отрицательным BAT138.
Выполнение протокола проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией принципов и было одобрено местным Комитетом по этике (Comité de Ética para la Investigación Provincial de Málaga, Испания). Все испытуемые были устно проинформированы об исследовании и подписали соответствующую форму информированного согласия.
ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем протоколе подробно описывается процедура НИМ, которую авторы используют ежедневно. Однако это не стандартизированный метод, и существуют различия с процедурами, опубликованными другими авторами. Основные модификации протокола связаны с использованием IL-3 в буфере стимуляции, временем инкубации со стимулом, методом остановки дегрануляции базофилов и стратегиями проточной цитометрии. Кроме того, различные коммерчески доступные комплекты для НИМ включают конкретные протоколы, рекомендованные производителем.
1. Пробоподготовка
2. Подготовка смеси для окрашивания
3. Стимуляция крови
4. Лизирование эритроцитов
5. Получение проточной цитометрии
НДТ, выполняемый с аллергенами или препаратами, позволяет исследовать IgE-зависимые реакции гиперчувствительности. Реактивность базофилов следует измерять по меньшей мере в двух оптимальных концентрациях для получения наилучших результатов34 , а активация визуализируетс?...
BAT является дополнительным диагностическим тестом in vitro для оценки аллергических реакций, опосредованных IgE, который оказался полезным при диагностике реакций, вызванных различными триггерами, такими как лекарства, пища или ингалянты, а также при некоторых формах хронической крап...
Авторам нечего раскрывать.
Мы благодарим Клаудию Кораццу за ее неоценимую поддержку английского языка. Эта работа была поддержана Институтом здравоохранения «Карлос III» (ISCIII) МИНЕКО (грант, совместно финансируемый ЕФРР: "Una manera de hacer Europa"; Гранты No PI20/01715; ПИ18/00095; ПИ17/01410; ПИ17/01318; PI17/01237 и RETIC ARADYAL RD16/0006/0001; Министерство здравоохранения Андалузского региона (грант No PI-0127-2020, PIO-0176-2018; ПЭ-0172-2018; ПЭ-0039-2018; ПК-0098-2017; ПИ-0075-2017; ПИ-0241-2016). ID является клиническим исследователем (B-0001-2017), а AA имеет старший постдокторский контракт (RH-0099-2020), оба поддерживаются Андалузским региональным министерством здравоохранения (совместно финансируется ESF: «Andalucía se mueve con Europa»).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, without Cap, Nonsterile | Corning | 352008 | |
APC anti-human CD193 (CCR3) Antibody | BioLegend | 310708 | |
BD FACSCalibur Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
FITC anti-human CD63 Antibody | BioLegend | 353006 | |
HEPES (1 M) | Thermo-Fisher | 15630106 | |
Lysing Solution 10x concentrated | BD Biosciences | 349202 | |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
N-Formyl-Met-Leu-Phe | Sigma-Aldrich | F3506 | |
PE anti-human CD203c (E-NPP3) Antibody | BioLegend | 324606 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
Purified Mouse Anti-Human IgE | BD Biosciences | 555857 | |
Recombinant Human IL-3 | R&D Systems | 203-IL | |
Sheath Fluid | BD Biosciences | 342003 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
TUBE 9 mL LH Lithium Heparin | Greiner Bio-One | 455084 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены