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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il test di attivazione dei basofili è un test diagnostico complementare in vitro per la valutazione delle reazioni allergiche IgE-mediate basato sulla rilevazione dell'attivazione dei basofili in presenza di uno stimolo specifico attraverso la misura dei marcatori di attivazione mediante citometria a flusso.

Abstract

Il test di attivazione dei basofili (BAT) è un test diagnostico complementare in vitro che può essere utilizzato in aggiunta alla storia clinica, al test cutaneo (ST) e alla determinazione specifica delle IgE (sIgE) nella valutazione delle reazioni allergiche IgE-mediate al cibo, al veleno degli insetti, ai farmaci e ad alcune forme di orticaria cronica. Tuttavia, il ruolo di questa tecnica negli algoritmi diagnostici è altamente variabile e non ben determinato.

La BAT si basa sulla determinazione della risposta dei basofili all'attivazione incrociata delle IgE allergene/farmaco attraverso la misurazione di marcatori di attivazione (come CD63, CD203c) mediante citometria a flusso. Questo test può essere uno strumento utile e complementare per evitare test di provocazione controllati per confermare la diagnosi di allergia, specialmente nei soggetti che manifestano gravi reazioni potenzialmente letali. In generale, le prestazioni delle BAT devono essere prese in considerazione se i) l'allergene/farmaco produce risultati falsi positivi nella ST; ii) non esiste una fonte di allergeni/farmaci da utilizzare per la determinazione di ST o sIgE; iii) vi è discordanza tra la storia del paziente e la determinazione ST o sIgE; iv) i sintomi suggeriscono che la ST può provocare una risposta sistemica; v) prima di prendere in considerazione un CCT per confermare l'allergene/farmaco colpevole. I principali limiti del test sono legati alla sensibilità non ottimale, soprattutto nell'allergia ai farmaci, alla necessità di eseguire il test non più di 24 ore dopo l'estrazione del campione e alla mancanza di standardizzazione tra i laboratori in termini di procedure, concentrazioni e marcatori cellulari.

Introduzione

La diagnosi allergica IgE-mediata si basa sull'anamnesi, sui test cutanei (ST), sulla quantificazione delle IgE sierospecifiche (sIgE) e, se richiesto e indicato, sui challenge test controllati (CCT)1,2,3,4,5,6. Tuttavia, l'anamnesi clinica può essere inaffidabile poiché potrebbe esserci una mancanza di informazioni accurate e ST e CCT non sono procedure prive di rischio che possono essere controindicate nei soggetti che manifestano gravi reazioni potenzialmente letali 1,2,3,4,5,6 . Questi problemi, insieme al fatto che la determinazione delle sIgE mediante saggi immunoenzimatici fluoroenzimatici validati e commerciali è disponibile solo per pochi allergeni e farmaci, hanno evidenziato l'importante ruolo di altri saggi funzionali in vitro come il test di attivazione dei basofili (BAT).

I basofili sono cellule effettrici chiave coinvolte nelle reazioni allergiche IgE-mediate che si attivano in seguito al cross-linking di sE adiacenti legate su recettori ad alta affinità (FcεRI) sulla superficie cellulare dopo esposizione ad allergeni / farmaci. L'attivazione dei basofili innesca la degranulazione cellulare e il rilascio di mediatori infiammatori preformati e nuovi sintetizzati contenuti nei granuli di secrezione intracitoplasmatica 7,8,9. La BAT è un metodo in vitro che cerca di imitare l'attivazione dei basofili in presenza di uno stimolo (allergene o farmaco) e determina cambiamenti nell'espressione dei marcatori di attivazione dei basofili mediante citometria a flusso 7,10. Esistono diverse strategie per identificare i basofili (IgE+, CCR3+, CRTH2+, CD203c+) e per misurare l'attivazione cellulare (principalmente la sovraregolazione di CD63 e CD203c) utilizzando combinazioni di anticorpi marcati con fluorocromo 7,10. CD63, il miglior marcatore di attivazione clinicamente validato 11,12,13,14, è una proteina di membrana ancorata ai granuli secretori contenente istamina che, dopo attivazione cellulare e fusione dei granuli con la membrana, è espressa sulla superficie basofila 15,16,17,18,19,20,21 . CD203c è un marcatore di superficie che è costitutivamente espresso sui basofili e sovraregolato dopo stimolazione FcεRI, che ha anche mostrato risultati affidabili in BAT 15,22,23,24,25. Inoltre, sembra co-esprimere con CD6326.

Negli ultimi decenni, la BAT ha dimostrato di essere utile nella diagnosi di reazioni allergiche IgE-mediate indotte da diversi fattori scatenanti come farmaci, cibo o inalanti, nonché in alcune forme di orticaria cronica, come descritto di seguito. Tuttavia, la posizione di questa tecnica negli algoritmi diagnostici è altamente variabile e non ben determinata.

Ipersensibilità ai farmaci
La BAT ha dimostrato di essere utile come test complementare per farmaci e pazienti selezionati, in particolare per coloro che manifestano reazioni gravi a causa del fatto che il valore diagnostico della ST non è ben stabilito per la maggior parte dei farmaci, in quanto sono validati e standardizzati per un numero limitato di farmaci27,28,29,30. Inoltre, la quantificazione delle sIgE è disponibile solo per un numero limitato di farmaci, con sensibilità inferiore a ST 27,28,29,30,31,32. Pertanto, la diagnosi di ipersensibilità ai farmaci di solito si basa sul test di provocazione farmacologica, che può essere controindicato nei soggetti che manifestano gravi reazioni pericolose per la vita33.

Sono stati riportati risultati promettenti per l'uso di BAT in pazienti selezionati che hanno riportato reazioni di ipersensibilità immediata a diversi farmaci come betalattamici (BL)20,34,35,36,37,38,39, agenti bloccanti neuromuscolari (NMBA)19,22,40,41,42, 43,44,45, fluorochinoloni (FQs)46,47,48,49, pirazoloni 50,51,52, mezzi di contrasto radiocontrastanti (RCM)53,54,55,56 e composti di platino57,58,59 . È stato riportato che le BAT hanno una sensibilità e una specificità comprese rispettivamente tra il 51,7-66,9% e l'89,2-97,8%; e i valori predittivi positivi e negativi sono descritti tra il 93,4% e il 66,3%, rispettivamente27,31. Inoltre, la BAT è stata proposta come biomarcatore predittivo per le reazioni breakthrough durante la desensibilizzazione con composti di platino, poiché l'espressione di CD203c è aumentata rispetto a CD63 in pazienti con alto rischio di reazioni avverse durante la desensibilizzazione del farmaco57.

È da notare che la BAT è utile solo nell'ipersensibilità ai farmaci quando la reazione comporta la degranulazione dei basofili; pertanto, non è utile nelle reazioni derivanti dall'inibizione enzimatica della cicloossigenasi 142.

Allergia alimentare
La BAT è emersa come un potenziale strumento diagnostico per l'allergia alimentare perché la determinazione delle sIgE sieriche all'intero estratto allergenico o ai singoli allergeni è spesso ambigua, richiedendo la sfida alimentare orale per confermare la diagnosi, che, analogamente all'ipersensibilità ai farmaci, è una procedura costosa e non priva di rischi60. Diversi studi hanno mostrato risultati rilevanti con latte vaccino 61,62, uovo 61,63, frumento 64,65,66,67,68, arachidi 63,69,70,71,72, nocciola 73,74,75,76 ,77, crostacei78, pesca 79,80,81, mela21, sedano e carota82,83.

Il principale valore aggiunto delle BAT nella diagnosi di allergia alimentare rispetto alle ST e alle sIgE nel siero è che mostra una maggiore specificità e una sensibilità simile. Pertanto, la BAT è uno strumento utile per differenziare i pazienti clinicamente allergici da soggetti sensibilizzati, ma tolleranti, che hanno sia un'elevata specificità (75-100%) che sensibilità (77-98%)63,69,84. I valori di sensibilità e specificità dipendono dall'allergene e da altri fattori come fenotipi (ad esempio, sindrome allergica orale contro anafilassi), età e modelli di sensibilizzazione legati alla geografia63,85.

Le BAT che utilizzano singoli componenti allergenici possono potenzialmente migliorare l'accuratezza diagnostica per alcuni allergeni alimentari61,80. Esistono studi che utilizzano proteine di stoccaggio dei semi (ad esempio, Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3 e Ara h 6 da arachidi)86; proteine di trasferimento lipidico (ad esempio, Pru p 3 dalla pesca e Ara h 9 dall'arachide)80,86; e Bet v 1 omologhi (ad esempio, Ara h 8 da arachidi)87. Altre potenziali utilità sono legate all'identificazione dell'allergene colpevole nei casi di sindrome da allergia ai pollini 21,87,88, allergia alla carne rossa 89 o anafilassi indotta dall'esercizio fisico dipendentedal cibo 66.

È interessante notare che la BAT può fornire informazioni sulla gravità e la soglia delle reazioni allergiche poiché i pazienti con reazioni più gravi mostrano una percentuale maggiore di basofili attivati, come osservato negli studi su pazienti allergici al latte di arachidi e latte vaccino 84,90,91; e i pazienti che reagiscono a tracce dell'allergene mostrano una maggiore sensibilità basofila 84,90,92. Questi dati suggeriscono che le BAT possono essere utili per identificare i pazienti allergici ad alto rischio che richiedono un follow-up più attento e un'istruzione più intensa93. Inoltre, è stato riportato che le BAT possono prevedere le risposte di sfida alimentare 70,91,92,94 e le soglie di reattività90,95 per aiutare a determinare quando il cibo può essere (re)introdotto in modo sicuro 84. Tuttavia, questi risultati sono controversi in alcuni studi63,96 e sono necessarie ulteriori ricerche.

D'altra parte, il BAT è stato utilizzato per monitorare la risoluzione dell'allergia alimentare, sia naturalmente che sotto trattamenti immunomodulatori, nel tempo, che fino ad ora è stata valutata solo per via orale, con i rischi e i costi associati 84,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106 ,107.108. Inoltre, è stato anche usato per monitorare l'effetto di omalizumab nell'allergia alimentare poiché l'attivazione dei basofili diminuisce durante il trattamento con omalizumab, ma aumenta dopo la cessazione del trattamento109.

Allergia inalante
La BAT è raramente benefica nell'allergia inalante poiché la diagnosi può essere stabilita di routine mediante quantificazione delle IgE e ST. Tuttavia, nei casi di rinite allergica locale (livelli non rilevabili di sIgE e ST negative con test di provocazione nasale positivi), la BAT ha permesso la diagnosi nel 50% dei casi110. È stata inoltre riportata una correlazione tra sensibilità ai basofili e risposta ai test di provocazione nasale/bronchiale, nonché tra gravità dell'asma ed efficacia del trattamento con omalizumab111.112.

Il BAT è stato utilizzato anche per monitorare l'immunoterapia con allergeni per acari della polvere domestica e pollini, poiché la sensibilità dei basofili diminuisce durante l'immunoterapia, probabilmente a causa dell'interferenza degli anticorpi IgG bloccanti 113.114.115.116.117.

Allergia al veleno degli imenotteri
La diagnosi di allergia al veleno degli imenotteri si basa di routine sulla ST e sulle sIgE sieriche. La BAT ha mostrato un'elevata sensibilità (85-100%) e specificità (83-100%) ed è stata riportata come utile nei casi che producono risultati equivoci o in pazienti con una storia clinica suggestiva di allergia al veleno ma sIgE non rilevabile e ST118.119 negativa. Tuttavia, la BAT non sembra essere predittiva della gravità di queste reazioni120.121.

Fino al 60% dei pazienti presenta sIgE sia alla vespa che al veleno d'api e l'identificazione dell'allergene dominante è fondamentale per un adeguato trattamento immunoterapico. In questi casi, il BAT è stato segnalato per essere utile nell'identificazione dell'allergene dominante 119,122,123,124. Sebbene le sIgE ai principali allergeni dei veleni di api e vespe possano ridurre l'utilità della BAT nei pazienti con doppia positività ad entrambi i veleni, fornisce informazioni utili principalmente in soggetti con risultati negativi nelle determinazioni delle sIgE123.

Alcuni studi suggeriscono che il BAT può essere utile come biomarcatore predittivo per gli effetti collaterali durante la fase di accumulo dell'immunoterapia del veleno poiché questa opzione di trattamento è stata segnalata per ridurre la sensibilità dei basofili. Tuttavia, la reattività non diminuisce e questa utilità BAT è oggi controversa 13,120,125,126,127,128,129,130.

Orticaria e angioedema
Un sottogruppo di pazienti con orticaria cronica ha una fisiopatologia autoimmune, dovuta agli autoanticorpi IgE contro gli autoallergeni e agli autoanticorpi IgG che colpiscono i complessi FcεRI o IgE-FcεRI presenti sulla superficie dei mastociti131.132. Nella pratica clinica, la diagnosi di questo tipo di orticaria cronica si è basata su ST sierico autologo positivo, che ha il rischio di infezione accidentale. La BAT è stata proposta come test in vitro per la diagnosi e il monitoraggio dei pazienti con sospetta orticaria cronica. È stato riportato che sia l'espressione di CD63 che quella di CD203c sulla superficie dei basofili sono aumentate in seguito alla stimolazione con sieri di pazienti con orticaria cronica, mostrando la rilevazione di autoanticorpi attivi 133.134.135.136.137. Recentemente, è stato riportato che i pazienti con BAT positivo spesso sperimentano lo stato di malattia più attivo, valutato dal punteggio di attività dell'orticaria, e richiedono dosi più elevate di antistaminici insieme a trattamenti di terza linea (ciclosporina A o omalizumab), rispetto a quelli con BAT138 negativo.

Protocollo

L'esecuzione del protocollo è stata condotta secondo i principi della Dichiarazione di Helsinki e approvata dal Comitato Etico locale (Comité de Ética para la Investigación Provincial de Málaga, Spagna). Tutti i soggetti sono stati informati oralmente dello studio di ricerca e hanno firmato il corrispondente modulo di consenso informato.

NOTA: Il presente protocollo descrive in dettaglio la procedura BAT che gli autori utilizzano quotidianamente. Tuttavia, questo non è un metodo standardizzato ed esistono differenze con le procedure pubblicate da altri autori. Le principali modifiche del protocollo sono legate all'uso di IL-3 nel tampone di stimolazione, al tempo di incubazione con lo stimolo, al metodo per fermare la degranulazione dei basofili e alle strategie di citometria a flusso. Inoltre, diversi kit disponibili in commercio per BAT includono protocolli specifici raccomandati dal produttore.

1. Preparazione del campione

  1. Raccogliere il sangue periferico in provette eparinizzate da 9 ml e mantenere il campione a temperatura ambiente (RT) in un rotore fino a quando non è necessario per il protocollo sperimentale.
  2. Etichettare i tubi citometrici da 5 ml per controlli negativi (2 provette), controlli positivi (2 provette) e diverse concentrazioni di allergene/farmaco (1 tubo per ogni concentrazione di allergene/farmaco testata). Posizionare i tubi in un rack dove i tubi si adattano perfettamente senza scivolare.
  3. Preparare tampone di stimolazione in acqua bidistillata contenente 2% (v/v) HEPES, 78 mg/L NaCl, 3,7 mg/L KCl, 7,8 mg/L CaCl 2, 3,3 mg/L MgCl2, 1 g/L HSA. Regolare il pH a 7,4 e aggiungere IL-3 a 2 ng/ml. Preparare solitamente 100 ml e dividere in 2,5 ml di aliquote da congelare a -20 °C.
  4. Preparare controlli positivi in PBS-Tween-20 0,05% (v/v) (PBS-T): controllo positivo 1, N-formilmetionil-leucil-fenilalanina (fMLP) (4 μM), per confermare la qualità dei basofili; Controllo positivo 2, Anti-IgE (0,05 mg/ml) come controllo positivo IgE-mediato.
  5. Preparare l'allergene/farmaco in PBS-T a 2 volte la concentrazione finale desiderata.
    NOTA: Le concentrazioni ottimali di allergeni/farmaci da utilizzare devono essere preventivamente determinate utilizzando un'ampia gamma di concentrazioni, mediante curve dose-risposta e mediante studi di citotossicità che seguono le stesse fasi del protocollo139.

2. Preparazione della miscela di colorazione

  1. Aggiungere gli anticorpi monoclonali marcati con fluorocromo al tampone di stimolazione dopo la concentrazione di anticorpi raccomandata dal produttore o mediante precedente titolazione degli anticorpi. In questo protocollo aggiungiamo 1 μL di ciascun anticorpo (CCR3-APC e CD203c-PE per l'identificazione dei basofili; CD63-FITC per l'attivazione dei basofili)140 per 20 μL di tampone di stimolazione.
    NOTA: Proteggere la preparazione della miscela di colorazione dalla luce.
  2. Aggiungere 23 μL di miscela colorante a ciascun tubo.

3. Stimolazione del sangue

  1. Aggiungere 100 μL di PBS-T alle provette 1 e 2 (controllo negativo), 100 μL di fMLP alla provetta 3, 100 μL di anti-IgE alla provetta 4 e 100 μL delle diverse concentrazioni di allergeni/farmaci alle seguenti provette. Incubare per 10 minuti a 37 °C in bagno termostatico con agitazione media per preriscaldare i reagenti.
  2. Aggiungere delicatamente 100 μL di sangue a ciascuna provetta per evitare l'emolisi. Vorticare delicatamente i tubi e incubare per 25 minuti a 37 °C in un bagno termostatico con media agitazione.
  3. Arrestare la degranulazione, mantenendo i tubi a 4 °C per almeno 5 min.
    NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui a 4 °C per 30-45 minuti se necessario141.142.143.

4. Lisa eritrociti

  1. Aggiungere 2 ml di tampone lisante 1x a ciascuna provetta per lisare gli eritrociti. Vortice ogni tubo e incubare per 5 minuti a RT.
    NOTA: In questa fase, le cellule sono fisse a causa di agenti fissativi (formaldeide) contenuti nel tampone.
  2. Centrifugare a 300 x g a 4 °C per 5 min. Decantare il surnatante, rovesciando il rack in un lavandino. Le cellule rimangono sul fondo dei tubi.
  3. Aggiungere 3 ml di PBS-T a ciascun tubo per lavare le cellule. Vortice ogni tubo.
  4. Centrifugare a 300 x g a 4 °C per 5 min. Decantare il surnatante, rovesciando il rack in un lavandino.
    NOTA: Conservare i campioni a 4 °C, al riparo dalla luce fino all'acquisizione del citometro a flusso.

5. Acquisizione della citometria a flusso

  1. Acquisire campioni tramite citometro a flusso (ad esempio, BD FACSCalibur Flow Cytometer). Collegare il citometro a flusso al software del computer e attendere che il citometro sia pronto. Caricare il modello e le impostazioni dello strumento (Tabella 1).
  2. Avviare l'acquisizione del campione.
  3. Utilizzare le seguenti strategie citometriche per la selezione dei basofili attivati139.
    1. Eliminare i linfociti dal grafico Side Scatter (SSC) - Forward Scatter (FSC).
    2. Eliminare i basofili dalla popolazione linfocitaria come cellule CCR3 + CD203c +. Acquisire almeno 500 basofili per tubo.
    3. Mostra un grafico CCR3 - CD63 per analizzare l'attivazione utilizzando CD63 come indicatore di attivazione. Impostare la soglia negativa CD63 a circa il 2,5% utilizzando i tubi di controllo negativi.
    4. Acquisisci tutti i campioni.

Risultati

La BAT eseguita con allergeni o farmaci consente di studiare le reazioni di ipersensibilità IgE-dipendenti. La reattività dei basofili deve essere misurata in almeno due concentrazioni ottimali per ottenere i migliori risultati34 e l'attivazione viene visualizzata dalla sovraregolazione di CD63 sulla superficie cellulare. Nel caso di allergeni, inoltre, per confermare la reattività dei basofili, la sensibilità dei basofili dovrebbe essere analizzata misurando la reattività a concentrazioni mu...

Discussione

La BAT è un test diagnostico complementare in vitro per la valutazione delle reazioni allergiche IgE-mediate che si è dimostrato utile nella diagnosi di reazioni indotte da diversi fattori scatenanti come farmaci, alimenti o inalanti, nonché in alcune forme di orticaria cronica. In generale, le prestazioni delle BAT devono essere considerate se i) l'allergene/farmaco produce risultati falsi positivi nella ST; ii) l'allergene/farmaco non è disponibile per essere utilizzato per la quantificazione ST o sIgE; ii...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Ringraziamo Claudia Corazza per il suo prezioso supporto in lingua inglese. Questo lavoro è stato sostenuto dall'Istituto di Sanità ''Carlos III'' (ISCIII) del MINECO (sovvenzione cofinanziata dal FESR: "Una manera de hacer Europa"; Sovvenzioni n. PI20/01715; PI18/00095; PI17/01410; PI17/01318; PI17/01237 e RETIC ARADYAL RD16/0006/0001; Ministero regionale andaluso della sanità (concessione n. PI-0127-2020, PIO-0176-2018; PE-0172-2018; PE-0039-2018; PC-0098-2017; PI-0075-2017; PI-0241-2016). ID è uno sperimentatore clinico (B-0001-2017) e AA detiene un contratto post-dottorato senior (RH-0099-2020), entrambi supportati dal Ministero della Salute regionale andaluso (cofinanziato da ESF: "Andalucía se mueve con Europa").

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, without Cap, NonsterileCorning352008
APC anti-human CD193 (CCR3) AntibodyBioLegend310708
BD FACSCalibur Flow CytometerBD Biosciences
Calcium chlorideSigma-AldrichC1016
FITC anti-human CD63 AntibodyBioLegend353006
HEPES (1 M)Thermo-Fisher15630106
Lysing Solution 10x concentratedBD Biosciences349202
Magnesium chlorideSigma-AldrichM8266
N-Formyl-Met-Leu-PheSigma-AldrichF3506
PE anti-human CD203c (E-NPP3) AntibodyBioLegend324606
Potassium chlorideSigma-AldrichP9541
Purified Mouse Anti-Human IgEBD Biosciences555857
Recombinant Human IL-3R&D Systems203-IL
Sheath FluidBD Biosciences342003
Sodium chlorideSigma-AldrichS3014
TUBE 9 mL LH Lithium HeparinGreiner Bio-One455084
Tween 20Sigma-AldrichP1379

Riferimenti

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