Выделение и культура in vitro макрофагов, полученных из костного мозга, для изучения БИОЛОГИИ NO-окислительно-восстановительных соединений

Резюме

Этот протокол был установлен для культивирования тетрагидробиоптерина (BH4) и индуцируемой синтазы оксида азота (iNOS) с дефицитом первичных мышиных макрофагов для изучения биологии NO-окислительно-восстановительных работ. Исследование фокусируется на снижении потенциального загрязнения BH4 и других артефактов, обнаруженных в традиционных методах изоляции и культуры, которые могут спутать экспериментальные результаты и интерпретацию результатов.

Аннотация

Макрофаги получены из кроветворных клеток-предшественников по всему телу, занимают центральное место в воспалительных процессах и участвуют в врожденных и адаптивных иммунных реакциях. Исследование макрофагов in vitro может быть предпринято путем культивирования ex vivo из брюшины или путем дифференцировки миелоидных клеток-предшественников костного мозга с образованием макрофагов, полученных из костного мозга (BMBM). Общий подход к дифференцировке макрофагов от предшественников включает использование условных сред из клеток L929 (LCM). Этот носитель легко производить самостоятельно, но страдает от серийной изменчивости, а его составляющие не определены. Аналогичным образом, фетальная бычья сыворотка (FBS) используется для поддержки роста, но содержит обширную смесь неопределенных молекул, которые могут варьироваться между партиями. Эти методы не подходят для изучения биологии оксида азота и окислительно-восстановительных механизмов, поскольку они оба содержат значительное количество малых молекул, которые либо мешают окислительно-восстановительным механизмам, либо дополняют уровни кофакторов, таких как тетрагидробиоптерин (BH4), необходимые для производства NO из индуцируемой синтазы оксида азота (iNOS). В этом отчете мы представляем оптимизированный протокол, позволяющий контролировать NO-окислительно-восстановительную среду путем снижения уровня экзогенного биоптерина при сохранении условий, подходящих для роста и дифференцировки клеток. Жесткий контроль состава питательных сред помогает обеспечить экспериментальную воспроизводимость и облегчает точную интерпретацию результатов. В этом протоколе БМДМ были получены из модели мыши с дефицитом ГТФ циклогидролазы (ГКГ). Культивирование BMDM проводили со средами, содержащими либо (i) условный LCM, либо (ii) рекомбинантный M-CSF и GM-CSF для получения минимальных артефактов при получении BH4 и NO-дефицитных условий культивирования, что позволило воспроизводить изучение NO-окислительно-восстановительной биологии и иммунометаболизма in vitro.

Введение

Макрофаги были установлены как интересный тип клеток при самых разных заболеваниях и состояниях, многие из которых, по-видимому, не связаны с их традиционной ориентацией на врожденный иммунитет. Поскольку физиология макрофагов сильно зависит от ткани или окружающей среды, в которой они находятся, возникло множество методов и моделей для изучения их функции и различных вовлеченных путей. Исторически сложилось так, что клеточные линии макрофагов, такие как RAW264.7, доминировали в этой области, но они были постепенно заменены в пользу различных моделей первичных клеток. Например, мышиные макрофаги могут быть выделены из промывания брюшины после обработки тиогликолатом. Предоставляя полезную модель для изучения ткане-резидентных клеток, было показано, что эти перитонеальные макрофаги демонстрируют более приглушенный ответ на различные внешние раздражители, тем самым ограничивая их пригодность для многих последующих применений¹.

В качестве альтернативы макрофаги, полученные из костного мозга (BMDM), полученные из миелоидных клеток-предшественников в костном мозге, стали ценной моделью для изучения различных аспектов биологии макрофагов, включая созревание и различные классические фенотипы, связанные с макрофагами, M0 (наивный, неактивированный), M1 (провоспалительный, обычно активируемый с LPS / IFN) и M2 (про-разрешение, обычно активируемое IL-4)^{2, См. 3}. Однако дифференцировка миелоидных клеток-предшественников в БМДМ зависит от наличия колониестимулирующего фактора макрофагов (M-CSF) в культуральной среде ^4,5. Это может поставляться либо в виде очищенного белка, добавленного в среду, либо из кондиционированной среды L929 (LCM). Преимущества использования BMDM (стоимость и эффективность) должны быть взвешены с ограничениями, представленными их чувствительностью к различным раздражителям (цитокинам, метаболическим промежуточным продуктам и RNS / ROS).

Предыдущие данные указывают на то, что содержание LCM плохо определено и внутренне изменчиво, что приводит к их ненадежности и непригодности для различных последующих применений, особенно тех, которые конкретно относятся к NO или окислительно-восстановительной биологии, поскольку на них может сильно влиять присутствие экзогенных соединений⁶. Таким образом, этот подробный протокол требует использования четко определенных сред DMEM: F12 с низкой вариацией партии к партии и добавлением рекомбинантных мышиных M-CSF и GM-CSF (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор). Кроме того, фетальная бычья сыворотка, обычно используемая в качестве добавки в тканевых культуральных средах, обеспечивает еще один источник плохо определенных соединений и присущей им изменчивости. Поэтому необходимо контролировать и оптимизировать использование таких добавок для обеспечения надежной культуры БМДМ. Используя определенный источник FBS с низким содержанием эндотоксина и обеспечивая оптовую закупку отдельных партий, условия культивирования надежно определяются и обеспечивается воспроизводимость. Было продемонстрировано, что протокол, описанный в настоящем описании, производит культуру макрофагов чистотой выше 95% при оценке поверхностных маркеров макрофагов CD45 и CD11b методом проточной цитометрии⁶.

протокол

Все процедуры для животных были одобрены и проведены в соответствии с этическим комитетом Оксфордского университета и Законом о животных Министерства внутренних дел Великобритании (научные процедуры) 1986 года. Все процедуры соответствовали Директиве 2010/63/ЕС Европейского парламента.

1. Выделение клеток костного мозга

1. Приносите в жертву мышей дикого типа (C57BL/6) или Gch1-дефицитных (R26-CreER^T2Gch^fl/fl) (10-16 недель) при вывихе шейки матки и собирают задние конечности.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Предпочтение ни одному из полов не отдается. Самки, соответствующие возрасту, будут немного меньше, чем их коллеги-самцы, что повлияет на первоначальный выход исходного материала.
   1. Опрыскивайте мышей 70% этанолом, чтобы снизить риск загрязнения.
   2. Сделайте небольшой разрез в животе с помощью рассеченных ножниц для удаления меха и кожи с тела. Снимите кожу, чтобы обнажить мышцы на задних конечностях.
   3. Поместите мышь на живот и вывихните задние конечности, подняв ее из коленного сустава и оказав давление на бедра. Вывих может ощущаться в тазобедренном суставе.
   4. Удалите задние ноги, аккуратно разрезав мышцу бедра, гарантируя, что бедренная кость не пострадает.
   5. Срежьте над голеностопным суставом, удалите стопу и очистите оставшуюся кожу от ноги.
   6. Поместите рассеченные ноги в трубку объемом 50 мл с 25 мл ледяного PBS (антибиотик не требуется) и поместите его на лед.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько животных могут быть препарированы, а ноги сохранены на льду.
2. В стерильных условиях в тканевом культуральном капюшоне удаляют мышцы с ног и удаляют концы костей, чтобы обнажить костный мозг.
   1. Поместите ноги в 70% этанол в течение 2 минут, чтобы уменьшить загрязнение и смыть любой мех или остатки.
   2. Переведите ноги в чистую, стерильную, бактериологическую чашку Петри. Используйте щипцы и скальпель, чтобы прочно и осторожно соскоблить вдоль костей боковой частью лезвия, чтобы удалить мышцы. Прорежьте сухожилия, чтобы облегчить процесс.
   3. Удалите эпифиз на конечности каждой кости, чтобы обнажить костный мозг. Бедренная кость разрезается на обоих концах, недалеко от соответствующих суставов.
   4. Большеберцовая кость разрезается вверху, чуть ниже коленного сустава, и внизу чуть выше точки пересечения с малоберцовой костью.
3. Промывайте костный мозг из костей PBS и соберите его в стерильную трубку объемом 50 мл.
   1. Наполните шприц объемом 10 мл 10 мл PBS и прикрепите к игле размером 25 G x 0,5 x 16 мм. Этого достаточно, чтобы промыть все кости у одной мыши.
   2. Вставьте иглу в медуллярную полость кости и осторожно промойте костный мозг 1-2 мл PBS, проводя иглу вверх и вниз через кость, чтобы убедиться, что весь костный мозг смещен.
   3. Повторите для всех костей, собрав покрасневший костный мозг в чистую чашку Петри.
   4. Используя стерильный шприц объемом 1 мл, дезагрегируйте костный мозг, втягивая суспензию внутрь и из шприца 5-10 раз, пока не будут разбиты какие-либо комочки.
   5. Соберите дезагрегированный костный мозг в шприц объемом 1 мл и пропустите его через клеточный сетчатый фильтр 70 мкМ в чистую трубку центрифуги объемом 50 мл. Поместите собранный костный мозг на лед, пока собираются дополнительные образцы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: См. схему протокола на рисунке 1 - Часть 1.

2. Отбор, дифференциация и стимуляция БМДМ

1. Чтобы заморозить костный мозг для последующего применения, гранулируют костный мозг центрифугированием при 1000 х г в течение 5 мин и повторно суспендируют в 2 мл низкого эндотоксина FBS, содержащего 5% диметилсульфоксида (ДМСО).
   1. Центрифугируют суспензию костного мозга при 1000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре (RT). Образуется кроваво-красная гранула.
   2. Выбросьте супернатант.
   3. Осторожно повторно суспендируют гранулы в 2 мл низкоэндотоксина FBS, содержащего 5% ДМСО, и замораживают при -80 °C на ночь перед переносом в парофазный жидкий азот для длительного хранения.
2. Чтобы немедленно использовать костный мозг, лизируйте красные кровяные клетки перед покрытием костного мозга.
   1. Центрифугируют суспензию костного мозга по 1000 х г в течение 5 мин при РТ. Образуется кроваво-красная гранула.
   2. Повторно суспендируют гранулу в 3 мл 1x буфера лизиса эритроцитов и инкубируют при RT в течение 5 мин.
   3. Добавьте 10 мл PBS и центрифугу при 1000 х г в течение 5 мин при RT. Выбросьте супернатант.
   4. Обложите ячейки для немедленного использования, перейдя к шагу 2.3.5.
3. Разморозить макрофаги и повторно суспендировать в 3 мл гальваничных сред перед гранулированием клеток.
   1. Приготовьте DMEM: F12, содержащий 5% нижнего эндотоксина FBS, 1x пенициллин/стрептомицин, L-глутамин и 25 нг/мл M-CSF.
      ПРИМЕЧАНИЕ: M-CSF и GM-CSF могут быть получены путем повторного использования высушенного белка в стерильной воде, содержащей 0,1% стерильного BSA, а аликвоты могут быть заморожены при -80 °C для последующего использования.
   2. Быстро разморозьте замороженную клеточную суспензию при 37 °C.
   3. Переложить клеточную суспензию (0,5 мл) в чистую, стерильную трубку, содержащую 3 мл подготовленной среды DMEM: F12.
   4. Гранулируйте ячейки центрифугированием при 1000 х г в течение 5 мин при РТ. Выбросьте супернатант.
   5. Повторно суспендировать гранулы в 3 мл подготовленной среды DMEM: F12.
   6. Подсчитайте ячейки предпочтительным методом.
4. День 0: Накройте ячейки.
   1. Обложите клетки пластиковой посудой без TC-покрытия в среде DMEM: F12, содержащей 5% низкого уровня эндотоксина FBS, 1x пенициллина / стрептомицина, L-глутамина и 25 нг / мл M-CSF.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Репрезентативная плотность посева описана в таблице 1. Полная пара ног от одной мыши обеспечивает 15-20 миллионов клеток-предшественников.
   2. Инкубируют клетки при 37 °C с 5% CO₂.
5. День 5: Кормите клетки.
   1. Подкармливайте клетки, добавляя 50% от исходного объема DMEM: среды F12, содержащие 5% низкого эндотоксина FBS, 1x пенициллина / стрептомицина, L-глутамина и 50 нг / мл M-CSF.
6. День 6: Стимуляция клеток с помощью GM-CSF.
   1. Добавьте приготовленный GM-CSF до конечной концентрации 50 нг/мл непосредственно в клеточную культуральную среду на клетках.
7. Замените носитель подготовленным DMEM: F12.
   1. Удалите все носители из ячеек.
   2. Промойте клетки ненадолго в предварительно подогретом PBS.
   3. Добавьте DMEM: F12 среды, содержащие 2% низкого эндотоксина FBS, 1x пенициллин/стрептомицин, L-глютамин, 25 нг/мл M-CSF и 50 нг/мл GM-CSF.
   4. Активируйте макрофаги к фенотипам M0, M1 или M2 с помощью стимуляций, описанных в шагах 2.7.5-2.7.7.
   5. M0 - Стимуляция не требуется. Инкубируйте клетки на ночь в среде.
   6. M1 - Стимулируют клетки 100 нг/мл ЛПС и 10 нг/мл IFNγ (конечные концентрации) в течение ночи.
   7. M2 - Стимуляция клеток 100 нг/мл IL-4 (конечная концентрация) в течение ночи.
8. День 8: Соберите клетки.
   1. Удалите среду из клеток (соберите среду и заморозьте при -80 °C для последующих анализов).
   2. Инкубируют клетки в ледяном PBS (50% объема среды) в течение 5 мин.
   3. Отсоедините ячейки от пластины с помощью мягкого соскабливания или повторного пипетирования.
   4. Гранулируйте ячейки центрифугированием при 2500 х г в течение 5 мин при РТ. Выбросьте супернатант.
   5. Заморозьте гранулы клеток при -80 °C для последующего использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: См. схему протокола Рисунок 1 - Часть 2.

Результаты

Прежде чем продемонстрировать эффективность этого протокола в макрофагах, уровни нитритов и BH4 оценивали в средах, дополненных 10% FBS, содержащим либо 10% LCM, либо только рекомбинантные M-CSF и GM-CSF. Нитрит, хотя и рассматривается в течение длительного времени как конечный продукт метаболизма оксида азота, в настоящее время рассматривается как физиологическое хранилище оксида азота, который может быть переработан при необходимости и, таким образом, часто используется в качестве показателя биодоступности оксида азота⁷. BH4 является важным кофактором NOS для производства NO. Как показано на рисунке 2, среды, дополненные 10% FBS, имели аналогичные уровни нитритов независимо от M-CSF / GM-CSF или LCM. Однако наблюдалась большая изменчивость между различными партиями LCM. Это наблюдение также относится к измерению BH4. Фактически, одна партия LCM (партия No 3) имела значительно более высокий уровень BH4, чем две другие (партии No 1 и No 2). Кроме того, партии LCM содержали значительно больше биоптерина, чем среды, дополненные 10% FBS и рекомбинантными цитокинами. Также была измерена значительная вариабельность общего количества биоптеринов между партиями. Эти результаты демонстрируют важность использования менее переменного источника M-CSF, чем LCM.

Кроме того, носители, дополненные 10% FBS, содержали значительно более высокие уровни нитритов по сравнению со средами, содержащими либо 2%, либо 5% FBS. Разница между 10% и 5% была весьма значительной (p < 0,05) для BH4. Тем не менее, аналогичные уровни биоптеринов были количественно определены. Для сравнения, OptiMEM + 0,2% BSA был лишен нитритов и BH4, что делало его очень чистым и подходящим носителем. Однако, как описано Bailey et al., хотя OptiMEM предназначен для использования только один раз в течение ночи при стимуляции макрофагов, наблюдалась гибель клеток из-за голодания. DMEM: F12, дополненный 2% FBS, был выбран для преодоления этой проблемы, позволяя минимальное загрязнение нитритами и BH4, сохраняя при этом достаточное количество питательных веществ для получения здоровых клеток. Действительно, несмотря на обнаружение некоторых нитритов, уровни незначительны (~ 0,2 мкМ) по сравнению с макрофагами, стимулируемыми LPS / IFN WT (30-80 мкМ для 1 х 10⁶ клеток; данные не показаны).

Чтобы подтвердить этот улучшенный протокол экспериментальными данными, изоляцией и характеристикой БМДМ из новой модели мыши с дефицитом BH4, здесь представлен R26-CreER^T2Gch^fl/fl. BH4 продуцируется геном циклогидролазы GTP I (Gch1). Как показано на рисунке 3A, дефицит Gch1 приводит к потере BH4 и, как следствие, исчезновению NO и впоследствии нитритов, а также к увеличению супероксидного аниона, вызывающего окислительный стресс, как ранее было продемонстрировано McNeill et ^al.8. Хотя этот протокол уже хорошо определен и используется для культивирования других BH4-дефицитных макрофагов из различных Cre-систем, таких как модель Gch^fl/flT2C ^6,8, модель R26-CreER^T2Gch^fl/fl уникальна, поскольку она использует условную активацию системы Cre-ER^T2 для удаления гена Gch1 после обработки тамоксифеном (рисунок 3B, В). Это позволяет выбивать в различные моменты времени и использовать внутренний контроль в виде транспортного средства против обработки тамоксифеном. В этом примере клетки обрабатывали либо транспортным средством (95% этанола), либо 0,1/1,0 мкМ 4-ОН тамоксифеном в дни 1 и 3 (как транспортное средство, так и запас тамоксифена разбавляли 1:100 в среде перед добавлением 0,7/7,0 мкл к 1 мл существующего объема культуры).

Как видно на рисунке 3D, белок GTPCH отменяется после лечения тамоксифеном в клетках R26-CreER^T2Gch^fl/fl, но не в клетках Gch^fl/fl. Важно отметить, что как R26-CreER^T2Gch^fl/fl, так и Gch^fl/fl контрольные клетки по-прежнему способны продуцировать iNOS после стимуляции LPS/IFN (рисунок 3B,C). Эти изменения в экспрессии гена Gch1 и результирующее изменение белка GTPCH привели к значительному нарушению внутриклеточных уровней BH4 и ослаблению производства нитритов. Как показано на рисунке 4, BMDM, выделенные и культивируемые у мышей R26-CreER^T2Gch^fl/fl, показали значительное снижение продукции BH4 и снижение накопления нитритов в средах по сравнению с контрольными клетками GCH^fl/fl в присутствии тамоксифена. Аналогичным образом, те же клетки, культивируемые в среде LCM, также показали отмененную экспрессию Gch1; хотя эти клетки все еще продуцировали значительное количество как BH4, так и нитритов после нокаута экспрессии Gch1 с 4 OH тамоксифеном, возможно, из-за загрязнения среды и FBS BH4. Это представляет собой явное улучшение нового метода, по сравнению с культивированием клеток в L-клеточных средах.

Дальнейшая характеристика этой модели не демонстрирует существенных различий в морфологии между неактивированными (M0) Gch^fl/fl и R26-CreER^T2Gch^fl/fl BMDM на 8-й день после различных концентраций тамоксифена. Как показано на фиг.5, обе модели демонстрируют одинаковое количество адгезивных клеток, выполненных круглой формы с удлиненными конечностями, как правило, черты, ожидаемые от нестимулированных макрофагов⁹.

Взятые вместе, эти результаты демонстрируют, что этот метод выделения и культивирования БМДМ обеспечивает чистую популяцию клеток, пригодных для культуры мышиных макрофагов. Этот метод позволяет проводить культивирование мышиных макрофагов без вмешательства экзогенных соединений, присутствующих в некоторых средах состава.

Рисунок 1: Принципиальная схема, иллюстрирующая выделение клеток костного мозга (часть 1) для отбора, дифференцировки и стимуляции БМДМ (часть 2). (А) В стерильных условиях рассеченные ноги помещают в чистую бактериологическую чашку Петри после промывки в 70% этаноле. (B) Мышцы осторожно удаляются с помощью щипцов и скальпеля, соскобленных вдоль костей. (C) Затем конечности костей отрезаются, чтобы обнажить костный мозг. (D) Костный мозг смывается с костей с помощью шприца объемом 10 мл, заполненного 10 мл PBS, путем введения иглы в просвет кости. (E) Игла проводится вверх и вниз через кость, чтобы обеспечить смещение всего костного мозга. На этом этапе кость должна казаться белой и прозрачной, а смещенный костный мозг собран в чашке Петри. (Ф-Г) Повторите для всех костей, собрав дезагрегированный костный мозг в шприц объемом 1 мл, и пропустите его через клеточный сетчатый фильтр 70 мкм в чистую 50-литровую центрифужную трубку. Открутите и повторно суспендируйте клетки в морозильной среде для последующего использования. Часть 2 показывает выбор, дифференциацию и стимуляцию БМДМ Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Уровни нитритов и BH4 в DMEM: F12 + GM-CSF + M-CSF или DMEM: F12+ L-клеточные среды. (A) Уровни нитритов в различных средах измеряли с использованием метода анализа Грисса. (B) Уровни BH4 и биоптеринов измерялись в различных средах путем количественной оценки ВЭЖХ с использованием стандарта BH4. Данные выражаются как среднее (n = 3) ± SD. Данные анализировались с использованием одностороннего ANOVA путем множественных сравнений. Символы представляют p < 0,05 между группами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Введение в модель R26CreERT2. (A) Схема, иллюстрирующая роль BH4 как кофактора NOS в окислительно-восстановительной биологии. (B) Схема с подробным описанием иссечения критических экзонов (2 и 3) в Gch1 из-за фланкирующих участков loxP и условной активации Cre-ERT2 с тамоксифеном в этой мышиной модели. (C) ПЦР (представитель n = 3 независимых животных), демонстрирующий иссечение критического экзона при обработке БМД тамоксифеном. Мыши WT производят продукт ПЦР 1030 bp, в то время как в присутствии Cre производится продукт 1392 bp, подтверждающий иссечение критических экзонов. (D) Иммуноблот iNOS, GCH и B-тубулина (представитель n = 3 независимых животных). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Характеристика дефицита BH4 в макрофагах. (А,Б) qRT-PCR подтверждает потерю экспрессии Gch1 в модели R26-CreER^T2Gch^fl/fl, обработанной тамоксифеном. Синий = новый метод MCSF, зеленый = классический метод LCM. (С,Г) Анализ внутриклеточного BH4 методом ВЭЖХ показывает, что 0,1 мкМ и 1,0 мкМ достаточны для значительного снижения уровня BH4. (Е, Ф) Измерение нитритов в средах с использованием анализа Griess показывает, что нестимулированные БМДМ не производят обнаруживаемых уровней нитритов, тогда как Gch^fl/fl и R26-CreER^T2Gch^fl/fl BMDM производят нитрит в присутствии LPS/IFNγ. Примечательно, что обработка тамоксифеном R26-CreER^T2Gch^fl/fl значительно снижает уровни нитритов в стимулируемых BMDM. Данные выражены как среднее значение (n = 3) ± SD. Данные анализировались с использованием одностороннего ANOVA путем многократных сравнений. Символы представляют p < 0,05 между группами. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Сравнение морфологии БМДМ. Фотографии, полученные методом оптической микроскопии БМДМ на 8 день с различной обработкой тамоксифеном. Масштаб указан на изображении. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Культурное блюдо	Объем носителей	Плотность высева
Блюдо из 12 лунок	1 мл	500 000 ячеек
Блюдо из 6 лунок	2 мл	1 000 000 ячеек
Тарелка 100 мм	10 мл	3 000 000 ячеек
75 см2 колбы	15 мл	5 000 000 ячеек

Таблица 1: Репрезентативная плотность посева.

Обсуждение

Этот протокол культуры BH4- и NO-дефицитных BMDM был разработан для исследования NO-окислительно-восстановительной биологии в первичных макрофагах путем восстановления тетрагидробиоптерина (BH4) и других интерферирующих артефактов с целью повышения надежности и воспроизводимости результатов, полученных из этих экспериментальных моделей.

Критические шаги включают использование правильной пластиковой посуды. Предшественники макрофагов являются адгезивными клетками и очень липкими; поэтому использование пластин, обработанных нетканевыми культурами (ТС), имеет решающее значение при выборе и изоляции их от других клеток-предшественников, которые в противном случае могли бы прикрепляться и уменьшать чистоту. В день сбора урожая отделение макрофагов от пластин требует ледяного PBS, но использование ЭДТА или даже соскоб клеток очень мягко может быть выполнено в зависимости от последующего применения (например, эксперимент с лизированными и живыми клетками). Особое внимание следует также уделять загрязнению. При промывке костного мозга может произойти потенциальное перекрестное загрязнение бактериями или вирусными частицами из оставшегося меха и кожи. Тогда важно быть как можно более осторожным и стерильным; следовательно, рекомендуется погружение рассеченных ног в 70% этанол в течение нескольких минут. Аналогичным образом, использование антибиотиков при выращивании макрофагов настоятельно рекомендуется.

Другое ограничение этого протокола связано с плотностью покрытия клеток на 0-й день. Покрасневший костный мозг содержит множество клеток, которые могут быть ошибочно подсчитаны и включены в качестве предшественников макрофагов, что приводит к ложному общему числу клеток. Чтобы избежать последующей и потенциальной изменчивости, изолированные макрофаги могут быть осторожно промыты с использованием теплого PBS на 7-й день и повторно покрыты при правильной плотности в 2% FBS DMEM: F12 по крайней мере за 1 ч до стимуляции, чтобы обеспечить приверженность.

Наконец, проверка уровней нитритов с помощью анализа Грисса с использованием сред из выращенных макрофагов необходима для анализа данных. С положительной стороны, этот анализ быстро и недорого выполняется.

Как показано в настоящем описании, этот настраиваемый протокол является более определенной и улучшенной альтернативой более распространенному протоколу, используемому для изоляции и культивирования макрофагов с использованием L-клеточных кондиционированных сред (LCM). Действительно, одной из основных проблем, связанных с использованием LCM при изучении БИОЛОГИи NO-окислительно-восстановительных систем, является значительное количество обнаруженных биоптеринов, что приводит к потенциальным метаболическим изменениям¹⁰. Например, экзогенный BH4 может быстро пополнять дефицитные модели и выступать в качестве кофактора для iNOS, что приводит к нежелательному производству оксида азота. Еще один недостаток использования LCM заключается в его производстве - LCM представляет собой смесь колониестимулирующих факторов, цитокинов и других побочных продуктов, секретируемых непосредственно клетками L-929, которые могут влиять на физиологию макрофагов⁶. Несмотря на большое количество M-CSF, необходимое для пролиферации и выживания макрофагов, вариации каждого компонента от партии к партии увеличивают риск изменчивости в экспериментах.

Для решения обеих проблем этот новый протокол использует четко определенную среду DMEM: F12, содержащую низкие уровни биоптеринов, к которым добавляется контролируемое количество очищенных M-CSF и GM-CSF. Оба цитокина помогают в дифференцировке и росте макрофагов. M-CSF особенно приводит к генерации BMDM из клеток-предшественников костного мозга, обеспечивая дифференцировку гемопоэтических стволовых клеток в макрофаги¹¹. Кроме того, было показано, что GM-CSF повышает выработку воспалительного цитокина и NO при добавлении до стимуляции, что является реальным преимуществом при изучении NO-окислительно-восстановительной биологии^12,13.

Другим основным фактором, который учитывает этот новый метод, является FBS, обычно используемый в качестве источника питательных веществ, необходимых для хорошего здоровья и роста клеток. Подобно LCM, FBS содержит значительные уровни биоптерина. В то время как полное сывороточное голодание клеток перед стимуляцией первоначально рассматривалось с использованием OptiMEM + 0,2% BSA, макрофаги показали признаки отслоения, свидетельствующие о снижении жизнеспособности клеток, как описано Bailey et ^al.6. Однако, поскольку макрофаги продемонстрировали абсолютную потребность в сыворотке, был выбран Ultra-Low Endotoxin FBS от BioWest. Партии были протестированы на биоптерины и предварительно отобраны перед оптовой закупкой, чтобы обеспечить надежные и четко определенные поставки. Чтобы пойти дальше в целях сокращения загрязняющих источников биоптеринов, были протестированы пониженные концентрации FBS. Вместо использования 10% сыворотки, как обычно используется в клеточной культуре, уровень FBS поддерживается до 5% в течение 7-дневной дифференцировки костного мозга в макрофаги и далее снижается до 2% во время ночной стимуляции в последний день. Это обеспечивает незначительные уровни обнаруженных биоптеринов, но достаточно питательных веществ для хорошего здоровья и приверженности макрофагов. Хотя этот недавно оптимизированный протокол с использованием рекомбинантного M-CSF приводит к более контролируемой среде для культивирования и активации первичных макрофагов, основным ограничением является то, что этот метод дороже, чем использование метода LCM.

Принимая во внимание все эти факторы, эти два метода были затем непосредственно сопоставлены. Важно отметить, что недавно модифицированный протокол, представленный в настоящем описании с использованием рекомбинантных M-CSF и GM-CSF, привел к созданию более воспроизводимой системы, в которой среда была лишена загрязняющего BH4. Последствия этого были двоякими; Клеткам с дефицитом BH4 действительно не хватало BH4, что приводило к минимальному обнаруживаемому накоплению нитритов в средах после стимуляции до статуса M1 с помощью LPS. Это контрастировало с теми же клетками BMDM, культивируемыми в LCM, где были обнаружены значительные BH4 и нитриты.

В заключение, сила этого метода заключается в усилиях по контролю уровня биоптеринов путем тщательной оценки каждого параметра, который может повлиять на NO и окислительно-восстановительную передачу сигналов в макрофагах. В частности, это обеспечивает максимальную воспроизводимость и стандартизацию в области биологии NO-окислительных систем.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL syringe	Terumo	SS+01T1	1mL 6% LUER syringe
10 mL plastic syringe	Fisher scientific	14955453
6 well plate sterile non-treated	CytoOne	CC7672-7506	Flat bottom
DMEM/F-12 (1:1) (1x)	Gibco, Life Technologies	21331-020
DMSO sterile	Sigma-aldrich	D2650-100ML
Easy flask 260 mL	Thermo Scientific	156800
L-Glutamine Solution 200 mM	Sigma-aldrich	G7513-100ML
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4	Sigma-aldrich	L4391-1MG
Mutlidish 12 sterile non-treated	Thermo Scientific	150200	Flat bottom
Needle 25G, 0.5 x 16 mm	BD Microlance 3	300600
PBS (pH7.4, 1x)	Gibco, Life Technologies	10010-015
Penicillin-Streptomycin	Sigma-aldrich	P0781-100ML
petri dish 100 x15 mm sterile	Falcon, Corning incorporated	351029
Recombinant murine GM-CSF	PEPROTECH	315-03
Recombinant murine IFN-γ	PEPROTECH	315-05
Recombinant murine M-CSF	PEPROTECH	315-02
Scalpel n23	Swann-Morton	0510
Ultra-low endotoxin FBS	Biowest	S1860-500
VWR cell strainers 70 µm nylon	VWR	732-2758