Микродиссекция слоев трехстворчатых клапанных листовок для двухосной механической характеристики и микроструктурной количественной оценки

Резюме

Этот протокол описывает двухосную механическую характеристику, поляризованную пространственную частотную обработку коллагена на основе визуализации и микродиссекцию листовок трикуспидального клапана. Представленный метод разъясняет, как слои листовок способствуют целостному поведению листовок.

Аннотация

Трикуспидальный клапан (ТВ) регулирует однонаправленный поток неоксигенированной крови из правого предсердия в правый желудочек. Телевизор состоит из трех листовок, каждая из которых имеет уникальное механическое поведение. Эти различия между тремя телевизионными листовками могут быть дополнительно поняты путем изучения их четырех анатомических слоев, которые являются атриальными (A), губчатыми (S), фиброзными (F) и желудочковыми (V). Хотя эти слои присутствуют во всех трех телевизионных листовках, существуют различия в их толщине и микроструктурных составляющих, которые дополнительно влияют на их соответствующее механическое поведение.

Этот протокол включает в себя четыре шага для выяснения различий, специфичных для уровня: (i) охарактеризовать архитектурное поведение механического и коллагенового волокна неповрежденной телевизионной листовки, (ii) разделить составные слои (A / S и F / V) телевизионной листовки, (iii) выполнить те же характеристики для составных слоев и (iv) выполнить пост-hoc оценка гистологии. Эта экспериментальная структура уникально позволяет напрямую сравнивать неповрежденную телевизионную ткань с каждым из ее составных слоев. В результате с помощью этого протокола можно собирать подробную информацию о микроструктуре и биомеханической функции телевизионных листовок. Такая информация потенциально может быть использована для разработки телевизионных вычислительных моделей, которые стремятся обеспечить руководство для клинического лечения телевизионного заболевания.

Введение

Телевизор расположен между правым предсердием и правым желудочком сердца. На протяжении всего сердечного цикла телевизор регулирует однонаправленный кровоток посредством циклического открытия и закрытия передней листовки телевизора (TVAL), задней листовки TV (TVPL) и телевизионной септальной листовки (TVSL). Эти листочки сложны и имеют четыре отдельных анатомических слоя — атриальный (A), губчатый (S), фиброза (F) и желудочковый (V) — с уникальными микроструктурными компонентами. Волокна эластина в предсердиях и желудочковых помогают восстановить ткань до ее недеформированной геометрии после механической нагрузки¹. Напротив, фиброза содержит плотную сеть волнистых коллагеновых волокон, которые способствуют несущей способности листовок². В основном состоящая из гликозаминогликанов, губчатая оболочка была предложена для обеспечения сдвига между слоями листовок во время функции сердечного клапана³. Хотя все три типа листовок имеют одинаковые анатомические слои, существуют различия в толщине слоев и составляющих соотношениях, которые имеют последствия для механического поведения, специфичного для листовки.

Исследователи изучили свойства телевизионных листовок, используя планарные механические характеристики, гистоморфологические оценки и оптические характеристики архитектуры коллагенового волокна. Например, плоские двухосные механические характеристики стремятся имитировать физиологическую нагрузку путем приложения перпендикулярных перемещений к ткани и регистрации связанных сил. Полученные в результате наблюдения за силовым смещением (или напряжением-растяжением) показали, что все три телевизионные листовки демонстрируют нелинейное, специфичное для направления механическое поведение с более очевидными специфическими реакциями в направлении радиальной ткани ^4,5,6. Считается, что такое поведение, специфичное для листовок, связано с различиями в микроструктурных свойствах, наблюдаемых с использованием стандартных гистологических методов ^6,7. Кроме того, визуализация второй гармонической генерации⁶, малоугловое рассеяние света⁸ и поляризованная пространственная визуализация в частотной области⁷ (pSFDI) направлены на понимание этих микроструктурных свойств и показали специфические различия в ориентации коллагенового волокна и обжиме волокна, которые имеют последствия для наблюдаемого механического поведения на тканевом уровне. Эти исследования значительно продвинули наше понимание микроструктуры ткани и ее роли в поведении на тканевом уровне. Тем не менее, многое еще предстоит решить в экспериментальном соединении тканевой механики и лежащей в ее основе микроструктуры.

Недавно эта лаборатория выполнила механическую характеристику слоев телевизионных листовок, разделенных на два композитных слоя (A/S и F/V) с использованием метода микродиссекции⁹. Эта более ранняя работа выявила различия в механических свойствах слоев и помогла понять, как слоистая микроструктура способствует механическому поведению тканей. Хотя это исследование улучшило наше понимание микроструктуры телевизионных листовок, метод имел несколько ограничений. Во-первых, свойства композитных слоев не сравнивались напрямую с интактной тканью, что приводило к отсутствию полного понимания взаимосвязи механика-микроструктура. Во-вторых, архитектура коллагеновых волокон композитных слоев не исследовалась. В-третьих, из-за трудностей со сбором композитных слоев из двух других телевизионных листовок были исследованы только слои TVAL. Способ, описанный в настоящем описании, обеспечивает целостную структуру характеристик, которая преодолевает эти ограничения и обеспечивает полную характеристику телевизионных листовок и их составных слоев.

В этой статье описывается метод микродиссекции, который разделяет три телевизионные листовки на их составные слои (A / S и F / V) для двухосных механических и микроструктурных характеристик 10,11,12. Этот итеративный протокол включает в себя (i) двухосные механические испытания и характеристику pSFDI неповрежденной листовки, (ii) новый и воспроизводимый метод микродиссекции для надежного получения композитных телевизионных слоев и (iii) двухосные механические испытания и характеристику pSFDI композитных телевизионных слоев. Ткань подвергалась двухосной растягивающей нагрузке с различными соотношениями сил для механических испытаний. Затем pSFDI использовался для определения ориентации и выравнивания коллагенового волокна в различных конфигурациях нагрузки. pSFDI сохраняет нативную архитектуру коллагеновых волокон, позволяет проводить анализ в зависимости от нагрузки и обходит типичную необходимость фиксации или очистки ткани для анализа архитектуры коллагеновых волокон, например, при визуализации генерации второй гармоники или рассеянии света под малым углом. Наконец, ткани были подготовлены с использованием стандартных методов гистологии для визуализации микроструктуры ткани. Эта итеративная и целостная структура позволяет напрямую сравнивать механические и микроструктурные свойства телевизионной брошюры с ее составными слоями.

протокол

Все способы, описанные в настоящем документе, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию в Университете Оклахомы. Ткани животных были приобретены на скотобойне, одобренной Министерством сельского хозяйства США.

1. Двухосная механическая характеристика

1. Подготовка тканей
   1. Достаньте листовку телевизора из морозильной камеры, бритвенные лезвия, хирургическую ручку, щипцы, пипетку с деионизированной (DI) водой и режущий коврик. Разморозьте листовку телевизора, используя 2-3 капли воды DI комнатной температуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вода DI используется вместо фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), чтобы избежать любых трудностей, вызванных PBS для микродиссекции слоя.
   2. Выложите образец плоско на режущий мат желудочковым слоем (т.е. поверхностью с вставками хорд) лицом вверх. Расположите образец так, чтобы радиальное направление совпадало с направлением Y, а окружное направление совпадало с направлением X.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Окружное направление ориентировано по окружности клапана.
   3. Исследуйте места введения хорд ткани. Определите область, в идеале ~12 x 12 мм, с наименьшим количеством больших вставок хорд, избегая при этом чрезвычайно тонких (т.е. прозрачных) областей (рисунок 1).
   4. Переверните образец так, чтобы поверхность предсердий (т.е. поверхность без хордовых вставок) была обращена вверх. Убедитесь, что окружное и радиальное направления листовок остаются выровненными с осями X и Y соответственно.
   5. Вырежьте квадратный образец размером 12 х 12 мм из ткани листочка, который позволяет избежать введения больших хорд или тонких областей, определенных на этапе 1.1.3. Удалите обрезанные части ткани листочка щипцами и поместите их в контейнер для отходов.
      1. Если нет возможности полностью избежать больших введений хорд, обрежьте ткани так, чтобы они находились по краю квадратного образца. Избегание вставки хорд важно, так как это помогает предотвратить проблемы для последующей микродиссекции.
   6. Используйте хирургическую ручку, чтобы поместить небольшую точку в правом верхнем углу, чтобы отслеживать ориентацию образца. Дайте чернилам высохнуть в течение примерно 30 с.
   7. Переверните образец желудочковой поверхностью (т.е. поверхностью с хордальными вставками) лицом вверх. Обрежьте хордальные крепления на задней части ткани, растянув хорды от листка и используя лезвие бритвы, чтобы разрезать рядом с местом его вставки. Переверните образец еще раз, чтобы поверхность предсердий (т.е. гладкая поверхность) была обращена вверх.
2. Измерение толщины
   1. Извлеките бесконтактный лазерный датчик смещения. Обнулите датчик смещения на плоском участке режущего коврика рядом с обрезанной тканью.
      ВНИМАНИЕ: Не светите лазером непосредственно в глаза.
   2. Расположите лазер над центральной областью образца. Удалите воздух, захваченный под поверхностью листовки, так как это может привести к ошибкам измерения. Чтобы выпустить захваченный воздух, либо используйте пинцет, чтобы подтолкнуть пузырь к краю ткани, либо поднимите один угол ткани.
   3. Запишите толщину, отображаемую на дисплее датчика перемещения. Повторите еще два измерения в других местах образца.
   4. Вычислите среднюю толщину листовки, используя три измерения, записанные на предыдущем шаге. Используйте это значение при создании двухосных протоколов механической характеристики.
3. Установка двухосного тестера и тканевый монтаж
   1. Подготовьте водяную баню DI при 37 °C, следуя рекомендациям системы тестирования, чтобы обеспечить температуру в физиологических условиях in vivo .
   2. Извлеките щипцы, образец ткани, монтажное оборудование, инструмент с мелким наконечником, жидкий цианоакрилатный клей и окрашенные в черный цвет стеклянные шарики (диаметр: 300-500 мкм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Монтажное оборудование включает в себя зубья, монтажный мост и монтажную резину.
   3. Установите образец ткани на систему тестирования. Убедитесь, что окружное направление ткани совпадает с X-направлением, чему может помочь точка, предварительно размещенная на шаге 1.1.6.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используемые здесь зубцы должны быть равномерно распределены по всей длине края ткани. Эффективная длина кромки составляет 10 мм для неповрежденной ткани и >3,3 мм для композитных слоев.
4. Размещение фидуциальных маркеров
   1. Определите центральную треть квадратной области смонтированной ткани. Используйте приблизительные углы этой области для размещения фидуциального маркера.
   2. Поместите стеклянные бусины в открытую весовую лодку и создайте небольшой бассейн жидкого цианоакрилатного клея в отдельной весовой лодке. Покройте верхнюю часть инструмента с тонким наконечником небольшим количеством клея. Нанесите лишний клей на борт весовой лодки.
   3. Создайте один угол центрального квадратного массива в одну треть, осторожно надавливая наконечник с клеевым покрытием на ткань. С помощью щипцов возьмите стеклянную бусину и аккуратно положите ее поверх клеевой точки. Используйте камеру двухосного испытательного устройства для помощи в размещении бусин.
   4. Повторяйте шаги 1.4.2 и 1.4.3 для трех дополнительных шариков до тех пор, пока квадратный массив не будет завершен. Убедитесь, что бусины надежно прикреплены, а их соответствующие клеевые точки не соприкасаются и не слипаются. Высушите клей перед опусканием ткани на водяную баню.
      1. Если бусины склеены, подождите, пока клей высохнет, затем используйте щипцы, чтобы аккуратно схватить бусину или клей и оторвать его от ткани.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Клей и бусины должны отрываться, что позволяет повторно укладывать бисероплетение.
5. Предварительная подготовка
   1. Создайте протокол предварительного кондиционирования с контролем силы, в котором ткань с длиной и толщиной кромки будет подвергаться шести повторениям эквибиаксиальной нагрузки до пика напряжения мембраны Т 40 Н/м с преднагрузкой 3% × Т_пиком¹⁰ и временем растяжения и восстановления 30 с каждый.
      1. Создайте произвольный каталог тестирования, в котором будут временно храниться данные для будущих вычислений. Установите скорость загрузки равным 4,42 Н/м.
      2. Создайте новый набор параметров тестирования с именем Preconditioning0. Установите режимы управления по осям X и Y для принудительного и установите функции управления на шаг. Определите величину нагрузки как силу, связанную с _пиком T, т.е. _{f пик} = T_пик · L. Определите величину преднагрузки как 3% от _пика f только для первого повторения и определите как продолжительность растяжения, так и продолжительность восстановления как 30 с. Определите количество повторений как 10.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Рассчитанный пик первого напряжения Пиолы-Кирхгофа, т.е. _пик P = _пик T/t, может превышать 200 кПа для более тонких тканей, что может привести к разрыву тканей во время тестирования. В этих сценариях пиковое напряжение мембраны было скорректировано до максимального первого напряжения Пиолы-Кирхгофа в 200 кПа.
   2. Выполните протокол предварительного кондиционирования. После предварительной подготовки запишите текущие X- и Y-размеры образца для использования в протоколах двухосного тестирования.
6. Создание и выполнение протоколов двухосного тестирования
   1. Определите время, необходимое для достижения пиковой эквибиаксиальной конфигурации из пост-предусловленной конфигурации с желаемой скоростью смещения. Учитывая постоянную скорость перемещения, вычислите время загрузки для остальных коэффициентов нагрузки (т.е. T_XX:T_YY = 1:0,5 и T_XX:T_YY = 0,5:1).
   2. Вручную запускайте линейные приводы в соответствии с целевыми силами для заданного коэффициента нагрузки. Повторите этот процесс и запишите размеры листовки для всех коэффициентов загрузки.
   3. Подготовьте протокол испытаний с контролируемым смещением, который биаксиально смещает ткань из постпредупрежденной конфигурации в конфигурации, зарегистрированные на этапе 1.6.2 (т.е. T_XX:T_YY = 1:1, 1:0.5, 0,5:1) в течение времени, определенного на этапе 1.6.1. Убедитесь, что каждый протокол имеет три цикла загрузки/разгрузки для повторяемости механического поведения.
      1. Создайте каталог тестирования, в котором будут храниться данные для будущих вычислений. Убедитесь, что имя каталога совпадает с текущим образцом.
      2. Создайте новый набор параметров тестирования с именем 1:1, установите режимы управления по осям X и Y на смещение, а функции управления — на рампу. Определите величину растяжения в конфигурации, записанной на шаге 1.6.1. Определите величину преднагрузки как 3% от _пика f только для первого повторения и определите как продолжительность растяжения, так и продолжительность восстановления как время, записанное на шаге 1.6.1. Определите количество повторений как 3.
      3. Повторите этап 1.6.3.2 для остальных коэффициентов нагрузки (т.е. T_XX:T_YY = 1:0,5 и T_XX:T_YY = 0,5:1), за исключением определения величины преднагрузки как неприменимой. Убедитесь, что величина растяжения, продолжительность растяжения и продолжительность восстановления соответствуют тем, которые зафиксированы в шаге 1.6.2.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа напряжений и деформаций будут использоваться только данные заключительного (третьего) цикла.
   4. Выполняйте протоколы, контролируемые перемещением. После завершения биаксиального тестирования верните ткань к ее посткондиционным размерам.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Тест должен быть немедленно прерван, если ткань начинает разрываться.
7. Дополнительные характеристики
   1. Оставьте ткань погруженной в воду DI и установленной на двухосевой испытательной системе. Выполните визуализацию pSFDI, как описано в шагах 2.1-2.3.
   2. Размонтируйте ткань. Если это неповрежденная ткань, перейдите к микродиссекции, описанной на этапах 3.1-3.7. Если нет, соберите гистологию, следуя шагу 3.7.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Водяная баня DI может быть использована для последующих характеристик в течение того же дня.
   3. Повторите шаги 1.2-1.7 со слоями A/S и F/V, полученными после микродиссекции (шаги 3.1-3.6).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Повторение протокола тестирования для слоев позволяет напрямую сравнивать неповрежденную ткань с ее собственными слоями.
8. Процедуры постобработки данных двухосного тестирования
   1. Выполните корреляцию цифровых изображений полученных двухосных тестовых изображений для определения зависящих от времени положений маркеров. Вычислите смещения фидуциальных маркеров с помощью Eq (1). ^{5 См.}
      (1)
      При этом x_i(t), X_i и d_i(t) являются зависящим от времени местоположением, начальным (эталонным) местоположением и смещением маркера i.
   2. Вычислите градиент деформации F , рассматривая конечные маркеры как четырехузловой билинейный конечный элемент, как показано в Eq (2)⁵
      (2)
      Где B_Xi и B_Yi являются производными функций формы для узла i в X- и Y-направлениях соответственно, а u_i(t) и v_i(t) являются компонентами d_i(t): d_i(t) = [u_i(t), v_i(t)]^T.
   3. Вычислите приложенное первое напряжение Пиолы-Кирхгофа P , используя записанные силы, как в Eq (3)⁵
      (3)
      P_XX и P_YY являются X- и Y-компонентами P; L и t - длина и толщина края ткани; f_X и f_Y — силы, регистрируемые в направлениях X и Y.
   4. Определите другие меры деформации и напряжения по мере ^{необходимости13}, которые включают правильную деформацию Коши-Грина C = F^T/F, деформацию Грина-Лагранжа E = (C - I)/2, напряжение Коши σ = ^J-1PF^T и второе напряжение Пиолы-Кирхгофа S = ^F-1P.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь I — тензор идентичности второго порядка, а J = det(F) — якобиан градиента деформации F.

2. Поляризованная пространственная визуализация частотной области

1. Подготовка системы
   ПРИМЕЧАНИЕ: При желании фидуциальные маркеры могут быть удалены из ткани до следующих этапов.
   1. Центрируйте устройство pSFDI над образцом (рисунок 2). Включите проектор и осветите образец 490 нм (голубым) светом.
   2. Откройте программное обеспечение камеры и осмотрите поле зрения камеры. Убедитесь, что образец центрирован в раме и полностью содержится в поле зрения.
   3. Если установленный образец представляет собой неповрежденный листок-вкладыш, отрегулируйте яркость проектора цифровой обработки света (DLP), чтобы ткань была полностью освещена без бликов на поверхности ткани. Не регулируйте яркость, если образец является одним из составных слоев.
   4. Вращайте поляризатор во всем диапазоне движения, чтобы обнаружить возможные блики или грязь на линзе поляризатора. Тщательно очистите линзу поляризатора салфеткой из микрофибры по мере необходимости.
2. Сбор данных
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий сбор данных может быть автоматизирован с помощью программного обеспечения, такого как LabVIEW или Python.
   1. Переместите поляризатор в его домашнее положение, идеально выровненное с одной из двухосных испытательных осей. Захватите одно изображение в градациях серого и сохраните его на компьютере с расположением поляризатора (т. Е. 0°).
   2. Поверните поляризатор на 5° и сделайте еще одно изображение в градациях серого. Повторите этот процесс, чтобы получить 37 изображений в диапазоне от 0° до 180° с шагом 5°.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения из первой последовательности визуализации pSFDI могут быть предварительно проанализированы для обеспечения желаемого оптического отклика от ткани. Инструкции см. в шаге 2.3.
   3. Повторите последовательность визуализации pSFDI для других желаемых конфигураций тканей, например, пиковых конфигураций протоколов нагрузки, рассматриваемых для двухосных механических испытаний.
3. Процедуры постобработки данных pSFDI
   ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий метод включает шаги для языка программ MATLAB. Однако вместо этого может использоваться любой предпочтительный язык (например, Python, C++).
   1. Используйте функцию MATLAB imread() для построения массивов, содержащих пиксельную интенсивность 37 полученных изображений. Для удобства расположите их как n × m × 37 трехмерного массива, где n и m — числа пикселей вдоль двух осей.
   2. Определите интересующую область ткани (ROI) с помощью определяемой пользователем функции grabit( ).
   3. Подгонка данных интенсивности и угла поляризатора для каждого пикселя ROI с помощью 3-терминального ряда Фурье, как в Eq (4):
      (4)
      Здесь I(θ) — пиксельная интенсивность в зависимости от угла поляризатора, а b_i — константы Фурье. Используйте стандартную линейную регрессию наименьших квадратов для определения b_i.
   4. Определите попиксельную ориентацию волокна как угол поляризатора, связанный с максимальным значением I(θ). Вычислите степень оптической анизотропии (DOA) через Eq (5).
      (5)
   5. Используйте plot() и histogram() для визуализации полученной ориентации волокна и значений DOA. Сохраните обработанные результаты для последующего использования.

3. Микродиссекция композитных слоев трехстворчатых клапанных листовок

1. Прикрепление тканей к восковой доске
   1. Соберите необходимые материалы: восковую доску, воду DI, пипетку, скальпель, микроножницы, тонкие щипцы, изогнутые щипцы, толстые щипцы и штифты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте только пинцет без зубов или захватов, так как щипцы этого типа могут очень легко разорвать тонкую ткань слоя A/S при выполнении рассечения.
   2. Отсоедините ткань от двухосного тестера и измерьте ее толщину с помощью лазерного датчика смещения, описанного на этапе 1.2. Поместите ткань на восковую доску.
   3. Исследуйте желудочковую сторону ткани на предмет больших вставок хорд. Обратите внимание на положение этих вставок, чтобы избежать их во время вскрытия (дополнительный рисунок S1). Сделайте фотографию для справки.
   4. Выложите ткань плоско на восковую доску атриалисом вверх. Прикрепите ткань к плате с помощью штифтов:
      1. В каждый угол ткани поместите один штифт, который находится под углом от ткани (для лучшего обзора) и слегка притягивает ткань подтянутой (рисунок 3А). Делайте это по часовой стрелке или против часовой стрелки. Убедитесь, что штифты находятся вне отверстий, созданных зубьями при монтаже ткани.
      2. Слегка отрегулируйте расположение штифта, чтобы ткань была подтянутой и в квадратной конфигурации (рисунок 3B), чтобы ткань лежала плоской и не смещалась во время микродиссекции слоя.
      3. При необходимости поместите штифты вдоль боковой стороны ткани во время рассечения, чтобы растянуть ткань больше. При размещении и ловле дополнительных штифтов имейте в виду, что они должны быть обойдены во время рассечения.
      4. Снимите стеклянные шариковые фидуциальные маркеры.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий шаг является необязательным. Добавленная вода DI помогает поддерживать гидратацию тканей и предотвращает прилипание ткани к себе на протяжении всей микродиссекции.
      5. Используя пипетку, поместите воду DI на поверхность ткани так, чтобы она полностью покрывала ткань пузырьковым образом. Пополняйте воду DI по мере необходимости на протяжении всего рассечения.
2. Сделайте начальный угол.
   1. Выберите угол закрепленного образца, чтобы начать вскрытие. Избегайте больших вставок хорд и чрезвычайно тонких областей.
   2. Сделайте разрез в слое A/S, слегка перетащив скальпель по поверхности ткани вдоль монтажных отверстий из механических испытаний (рисунок 3C). Убедитесь, что разрез имеет длину не менее 5 мм, а края разреза начинают раздвигаться, открывая слой F / V под ним.
   3. Используйте тонкие щипцы (без острого кончика), чтобы плотно потереть вдоль разреза и раздвинуть края разреза (дополнительный рисунок S2).
      1. Если разрез в слое A/S не начинает раздвигаться, слегка проведите по тому же срезу снова скальпелем, пока он не начнет это делать. Будьте осторожны, чтобы не врезаться слишком глубоко в ткань (мимо композитного слоя A / S), так как это затрудняет чистое разделение слоев.
   4. Повторите шаги 3.2 и 3.2.3, чтобы сделать второй разрез перпендикулярным первому срезу (рисунок 3D). Убедитесь, что два разреза соединены и образуют угол.
      1. Если два разреза не соединены, проведите тонкий пинцет под небольшой областью ткани, разделяющей два разреза (дополнительный рисунок S3). Затем осторожно используйте ножницы, чтобы разрезать ткань.
3. Отклейте ткань от угла.
   1. Растирайте вдоль разрезов тонкими щипцами до тех пор, пока ткань не начнет отделяться от слоя F / V. Как только небольшой кусочек ткани отделится, обхватите его пинцетом и осторожно потяните его для дальнейшего разделения композитных слоев.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда помещайте кончик тонкого пинцета мимо края ткани при захвате. В противном случае они могут случайно проткнуть отверстие в композитном слое A/S.
   2. Продолжайте отслаивать ткань и растирать шов до тех пор, пока он не достигнет конца двух разрезов, сделанных для угла. На протяжении всего этого процесса переключайтесь на более крупные пинцеты, чтобы захватить ткань для процесса шелушения, чтобы предотвратить нежелательное разрыв и разрыв композитного слоя A / S.
      1. Если первая попытка поворота имеет серьезные проблемы с разделением, попробуйте другой угол в качестве отправной точки (вернитесь к шагу 3.2).
4. Вытяните разрезы, отклейте ткань и сделайте второй угол.
   1. Вытяните два разреза, сделанных для первого угла, поместив кончик скальпеля в нижнюю часть каждого разреза и слегка проведя его по поверхности ткани (рисунок 4А). Убедитесь, что все удлинительные разрезы имеют размер не менее 5 мм, а удлинители разрезов соединяются с исходными разрезами и продолжают следовать за отверстиями для швов или швов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если удлинительный срез слишком глубокий, то необходимо тщательно контролировать предстоящее отслаивание, чтобы гарантировать, что участки фиброзы не разделены композитным слоем A/S (рисунок 5A).
   2. Продолжайте расширять разрезы и отслаивать верхний композитный слой A/S обратно, протирая шов до тех пор, пока одна сторона не будет закончена. Обратите внимание, что ткань будет отделена полностью вдоль одного разреза; убедитесь, что шов между композитными слоями A/S и F/V является прямым (рисунок 4B).
   3. Повторите инструкции на шагах 3.2 и 3.3, чтобы создать второй угол перпендикулярно концу полностью отслаиваемой стороны (рисунок 4C).
5. Полностью разделите слой A/S.
   1. Вытяните оставшиеся разрезы, избегая больших вставок хорд. Продолжайте разделять слои A/ S и F / V, используя методы трения и вытягивания, используемые для первого угла. Запишите несколько соображений или проблем, которые могут возникнуть в ходе этого процесса:
      1. Исключайте вставки хорд из зоны разделения A/S (рис. 5B) только в том случае, если это исключение позволит получить образец A/S, достаточно большой для экспериментальных характеристик (>3,3 мм).
      2. Если ткань разрывается или образуется отверстие, немедленно прекратите отделение ткани. Чтобы предотвратить попадание пинцета, поместите ножницы в любое отверстие, которое образуется, и отрежьте ткань от центра. Если дефект образуется вдоль шва разделения, то начинают отделять ткань вдоль другого края для предотвращения дальнейшего разрыва (рисунок 5С).
      3. Ищите межслойные соединения, которые могут появляться при отделении ткани и предотвращайте дальнейшее разделение ткани без высокого риска разрыва (рисунок 5D). Обратите внимание, что это тонкие, но прочные пряди, которые необходимо аккуратно разрезать ножницами. Избегайте создания отверстия в слое A/S или разрезания вниз слоя F/V, так как это приведет к неравномерному разделению.
      4. Продолжайте этот процесс до тех пор, пока не будет отделен как можно больший выборочный слой A/S. Отметьте ориентацию образца с помощью хирургической ручки (рисунок 6А).
6. Закончите рассечение.
   1. Ножницами разрезать вдоль шва отделения оставшийся край ткани (рисунок 6B). Убедитесь, что этот срез находится как можно ближе к шву разделения.
   2. Поместите отдельный композитный слой A/S ровно на режущий мат. При необходимости используйте скальпель для выпрямления краев ткани и создания квадратной формы ткани, подходящей для двухосного механического испытания. Поместите слой A/S в воду DI до тех пор, пока он не будет готов к тестированию.
   3. Отметьте ориентацию слоя F/V, оставшегося на восковой доске. Вырежьте максимально возможный квадрат из области, где был удален слой A/S (рисунок 6C), затем поместите его в воду DI.
7. Гистология
   1. Иссечение двух полосок ткани, выровненных с окружным и радиальным направлениями, для использования в гистологии. Используйте разные протоколы для неповрежденных и составных слоев (например, A/S и F/V).
      1. Для неповрежденного слоя возьмите образцы из ткани, которая остается прикрепленной к восковой доске. Используйте ткань вне отверстий для швов, так как эта часть ткани не была рассечена и будет представлять собой неповрежденный листок.
      2. Для композитных слоев A/S и F/V собирайте гистологические образцы только после полного завершения их тестирования и визуализации. Смонтируйте образец из двухосной испытательной системы, положите ткань на режущий мат и иссейте кольцевые и радиальные полоски с помощью лезвия бритвы.
   2. Поместите иссеченные полоски в тканевые кассеты и погрузите кассеты в 10% формалин.
   3. Отбросьте оставшуюся ткань. Очистите инструменты для рассечения с помощью чистящего состава (см. Таблицу материалов).
   4. После 24-48 ч фиксации переведите кассеты на этанол, где их можно хранить неопределенно долго до гистологической обработки и окрашивания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот гистологический анализ может подтвердить, что микродиссекция прошла успешно. ВНИМАНИЕ: 10% формалин вызывает раздражение кожи и серьезные повреждения глаз. Это также может вызвать аллергическую реакцию или рак через вдыхание. При обращении носите соответствующие средства индивидуальной защиты, такие как перчатки, очки и лабораторный халат, и используйте только в хорошо проветриваемых помещениях, например, в вытяжном шкафу. Когда контейнер не используется, убедитесь, что контейнер для хранения плотно закрыт.

Результаты

Микродиссекция даст образцы A/S и F/V относительно равномерной толщины, которые могут быть установлены на (коммерческом) двухосном испытательном устройстве. Гистологический анализ неповрежденного листочка и двух рассеченных слоев проверит, правильно ли ткань была разделена вдоль грани...

Обсуждение

Критические этапы для протокола включают: (i) микродиссекцию слоя, (ii) крепление ткани, (iii) размещение фидуциального маркера и (iv) установку pSFDI. Микродиссекция соответствующего слоя является наиболее важным и сложным аспектом способа, описанного в настоящем описании. Прежде чем начать р?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% Formalin Solution, Neutral Buffered	Sigma-Aldrich	HT501128-4L
Alconox Detergent	Alconox		cleaning compound
BioTester - Biaxial Tester	CellScale Biomaterials Testing		1.5 N Load Cell Capacity
Cutting Mat	Dahle	B0027RS8DU
Deionized Water	N/A
Fine-Tipped Tool	HTI INSTRUMENTS	NSPLS-12
Forceps - Curved	Scientific Labwares	16122
Forceps - Thick	Scientific Labwares	161001078
Forceps - Thin	Scientific Labwares	16127
LabJoy	CellScale Biomaterials Testing	Version 10.66
Laser Displacement Sensor	Keyence	IL-030
Liquid Cyanoacrylate Glue	Loctite	2436365
MATLAB	MathWorks	Version 2020a
Micro Scissors	HTI Instruments	CAS55C
Pipette	Belmaks	360758081051Y4
Polarized Spatial Frequency Domain Imaging Device	N/A		Made in-house using a digital light projector, linear polarizer, rotating polarizer mount, and charge-coupled device camera. See doi.org/10.1016/j.actbio.2019.11.028 (PMCID: PMC8101699) for more details.
Scalpel	THINKPRICE	TP-SCALPEL-3010
Single Edge Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel)	VWR International	H3515541105024
Surgical Pen	LabAider	LAB-Skin-6
T-Pins	Business Source	BSN32351
Wax Board	N/A		Made in-house using modeling wax and baking tray
Weigh Boat	Pure Ponta	mdo-azoc-1030