АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Настоящий протокол описывает микроинъекцию зиготы CRISPR-Cas9 и донорской ДНК для эффективного получения генных кассетных и флоксированных мышей.

Аннотация

Технология CRISPR-Cas позволила быстро и без усилий создать генетически модифицированных мышей. В частности, мыши и точечные мутантные мыши легко продуцируются путем электропорации факторов CRISPR (и одноцепочечных доноров олиго-ДНК) в зиготу. Напротив, генная кассета (>1 кб) нокаутированных и флоксированных мышей в основном генерируется путем микроинъекции факторов CRISPR и двухцепочечных доноров ДНК в зиготы. Технологии редактирования генома также повысили гибкость производства генетически модифицированных мышей. В настоящее время можно ввести предполагаемые мутации в целевые области генома в ряде полезных инбредных линий мышей. Наша команда произвела более 200 линий мышей с нокаутом с генными кассетами и более 110 линий мышей с флоксированием с помощью микроинъекции зиготы CRISPR-Cas9 по запросам из нескольких стран, включая Японию. В некоторых из этих методов редактирования генома использовались инбредные штаммы BALB/c, C3H/HeJ и C57BL/6N, однако в большинстве случаев использовался C57BL/6J. В отличие от метода электропорации, редактирование генома методом микроинъекции зиготы в различных инбредных штаммах мышей не так просто. Тем не менее, нокаутированные и флоксированные мыши на одном инбредном генетическом фоне так же важны, как и генетические гуманизированные, флуоресцентные репортерные и условно-нокаутные модели мышей. Таким образом, в данной статье представлен протокол микроинъекции зиготы CRISPR-факторов и двухцепочечных доноров ДНК у мышей C57BL/6J для генерации генных кассетных и флоксированных мышей. Эта статья посвящена исключительно ядерной инъекции, а не цитоплазматической инъекции. В дополнение к микроинъекции зиготы мы намечаем график производственного процесса и периферических методов, таких как индукция суперовуляции и перенос эмбрионов.

Введение

Нокаутированные мыши, у которых предполагаемые экзогенные гены введены в целевые локусы, широко используются во многих исследованиях in vivo в качестве мышей с гуманизированным геном, флуоресцентных репортерных мышей и мышей-драйверов Cre 1,2. Когда нокаутные мутации индуцируются редактированием генома в зиготах мышей, в качестве донорской ДНКиспользуется одноцепочечная ДНК (одноцепочечные доноры олигоДНК, ssODN) или двухцепочечная ДНК (дцДНК 2,3). ssODN в основном используется для выбивания относительно коротких фрагментов генов менее 200.н. 4. С помощью длинных ssODN (lsODN)5,6 можно вбивать фрагменты ДНК длиннее 1 кб, однако их подготовка занимает много времени. При использовании доноров дцДНК можно получить генную кассету (>1 кб) мышей с нокаутом без трудоемкой подготовки донорской ДНК7.

Основное преимущество использования ssODN заключается в том, что электропорация8 может генерировать мышей с нокаутом. Однако доноры дцДНК должны быть введены непосредственно в ядро путем микроинъекции зиготы. Одновременный нокаут на двух участках требуется для создания флоксированных мышей, у которых каждая последовательность loxP выбивается вверх и вниз по течению от гена-мишени. Существует два способа получения флоксированных мышей путем редактирования генома в зиготах мышей: с использованием двух независимых ssODN, каждый из которых несет один сайт loxP, или с использованием одной дцДНК (или лсДНК) с флоксированной последовательностью; Первый очень неэффективен 9,10,11. Редактирование генома с использованием доноров дцДНК является простейшим подходом к получению генных кассетных и флоксированных мышей, если окружающая среда благоприятствует микроинъекции зиготы.

Первоначально смеси мРНК Cas9 и sgRNA или векторы ДНК, кодирующие sgRNA и Cas9, используются для редактирования генома в зиготахмышей 12,13. Поскольку высококачественные и стабильные белки Cas9 теперь доступны по низкой цене, введение рибонуклеопротеина (РНП) крРНК-тракрРНК-Cas9 в зиготымыши 14 стало популярным. В последнее время нок-ин-мыши были получены с высокой эффективностью путем введения крРНК-тракрРНК-Cas9 РНП и донорской ДНК в оба пронуклеуса зигот мышей в фазе клеточного цикла, где наиболее вероятно произойдет нокаутирование15. Таким образом, в настоящем протоколе описываются способы получения различных типов мышей с нокаутом с помощью этого способа.

Существует много полезных инбредных линий лабораторных мышей16. Генетическая модификация в рамках инбредного фона может игнорировать влияние генетического фона на фенотип. В данной статье описывается метод индуцирования нокаутных и флоксированных мутаций в зиготе наиболее часто используемой инбредной линии мышей C57BL/6J17. Кроме того, также обсуждаются сроки создания генетически модифицированных мышей и используемые периферические методы, включая индукцию суперовуляции и перенос эмбрионов.

протокол

Все эксперименты на животных проводились гуманно с одобрения Институционального комитета по экспериментам на животных Университета Цукуба в соответствии с Правилами проведения экспериментов на животных Университета Цукуба и Основными руководящими принципами надлежащего проведения экспериментов на животных и связанной с ними деятельности в академических научно-исследовательских учреждениях, находящихся под юрисдикцией Министерства образования. Культура, спорт, наука и технологии Японии. В качестве донора зиготы использовали мышей C57BL/6J обоего пола в возрасте от 10 до 25 недель. В качестве мышей-реципиентов использовались мыши ICR (старше 10 недель). Мыши были получены из коммерческих источников (см. Таблицу материалов).

1. Подтверждение активности расщепления крРНК в бесклеточной системе

  1. Растворяют 2 нмоль крРНК (сухая) и 20 нмоль тракрРНК (сухая) в 25 мкл и 250 мкл воды, не содержащей РНКазы, соответственно (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Целевые последовательности CRISPR, которые, как прогнозировалось, будут иметь высокую активность расщепления и как можно меньше нецелевых объектов, отбираются с помощью CRISPOR (см. Таблицу материалов). В случае нокаута генной кассеты нацельтесь на последовательность через сайт вставки. Экзоны (экзоны), подлежащие флоксированию, были выбраны с помощью KOnezumi (см. Таблицу материалов).
  2. Амплифицировать фрагмент ДНК (примерно 0,5-1 кб), содержащий сайт-мишень, методом геномной ПЦР9. Очистите этот ампликон ПЦР с помощью обычного набора для экстракции продукта ПЦР (см. Таблицу материалов).
  3. Приготовьте 10 мкл смеси CRISPR (100 нг/мкл крРНК, 150 нг/мкл тракрРНК и 1 нг/мкл Cas9 в реакционном буфере нуклеазы Cas9, см. Таблицу материалов). Чтобы построить комплекс CRISPR-Cas9, поместите смесь CRISPR в тепловой блок при температуре 37 °C на 30 минут.
  4. Добавьте общий объем (10 мкл) смеси CRISPR к продукту ПЦР (10 мкл, 20 нг/мкл), описанному на этапе 1.2, и инкубируйте при 37 °C в течение 1 часа. Добавьте 1 мкл РНКазы (500 нг / мкл) для разложения крРНК и тракрРНК при 37 ° C в течение 30 мин, так как РНК должны отсутствовать во время электрофореза. Электрофорез вышеуказанных образцов проводят с использованием загрузочного красителя, содержащего додецилсульфат натрия (2% мас./об.).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В редких случаях наблюдаются крРНК без активности расщепления. В таких случаях рекомендуется перепроектировать дизайн редактирования генома.

2. Приготовление смеси крРНК, тракрРНК, белка Cas9 и донорской ДНК для микроинъекции зиготы

  1. Приготовьте раствор CRISPR (50 нг/мкл крРНК, 200 нг/мкл тракрРНК и 200 нг/мкл Cas9 в воде, не содержащей РНКазы). Приготовьте раствор донорской ДНК (20 нг/мкл самосконструированного вектора плазмидной ДНК).
    1. Раствор донорской ДНК фильтруют через стерильный шприцевой фильтр с размером пор 0,22 мкм. Смешайте равные объемы раствора CRISPR и отфильтрованного раствора донорской ДНК. Убедитесь, что конечная концентрация каждого из них составляет 25 нг/мкл крРНК, 100 нг/мкл тракрРНК, 100 нг/мкл Cas9 и 10 нг/мкл донорской ДНК. В дальнейшем эта смесь будет называться RNPD.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При разрезании двух участков, например, во время производства флоксированных мышей, концентрация каждой цРНК должна составлять 25 нг / мкл. Донорская ДНК представляет собой кольцевую плазмидную ДНК и может быть очищена с помощью обычного набора мини-подготовительных спиновых колонок (см. Таблицу материалов). Приготовленный раствор необходимо поместить на лед и как можно скорее использовать для микроинъекций.

3. Получение зигот мышей путем естественного спаривания

  1. За 3 дня до микроинъекции подкожно вводят 5 МЕ гонадотропина сыворотки крови беременной кобылы (ПМСГ, см. Таблицу материалов) самкам мышей C57BL / 6J (10-25 недель). Примерно через 46-48 ч вводят 5 МЕ хорионического гонадотропина человека (ХГЧ, см. Таблицу материалов) внутрибрюшинно. Совместно разместите самок мышей, обработанных PMSG и ХГЧ, с самцами мышей C57BL / 6J и проверьте вагинальные пробки на следующее утро.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приблизительно 15-25 зигот могут быть получены от одной самки мыши C57BL / 6J. Временная шкала показана на рисунке 1.
  2. Подготовьте две чашки Петри диаметром 35 мм для культивирования зиготы, как показано на рисунке 2. Поместите их в инкубатор (37 °C, 5% CO2) до использования. Их можно хранить в течение ночи.
  3. Усыпьте самок мышей с подтвержденными вагинальными пробками путем вывиха шейки матки и, используя маленькие ножницы, надрежьте кожу живота и мышечный слой от средней линии нижней части живота до ребер.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте рекомендациям местного комитета по этике животных в отношении эвтаназии.
  4. Соберите яйцеводы и поместите их в 20 мкл капли среды М2, содержащей 0,75 мг/мл гиалуронидазы (см. Таблицу материалов) на крышке чашки Петри. Возьмите один яйцевод щипцами с тонким наконечником и перфузируйте около 50 мкл среды М2 с гиалуронидазой через фимбрии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В это время зиготы слабо окружены многочисленными кучевыми клетками.
  5. Через 30 с с помощью стеклянного капилляра подбирают морфологически нормальные зиготы с небольшим количеством среды и моют их, перенося на свежие капли среды М16. Переложите промытые зиготы в чашку Петри (рис. 2) для объединения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Временная шкала показана на рисунке 1. Морфологически нормальные зиготы имеют мужской и женский пронуклеус и два полярных тельца, которые не сильно нарушили сферическую форму15. Морфология зиготы значительно различается между штаммами и видами.
  6. Повторяйте шаги 3.3 и 3.4 до тех пор, пока не будут извлечены все зиготы. Около 100 зигот могут быть объединены в одну каплю M16 в чашке культуры. Храните блюдо в инкубаторе (37 °C, 5% CO2) до микроинъекции.

4. Подготовка иглы для микроинъекций

  1. Вытащите несколько стеклянных пипеток с помощью программируемого съемника пипеток (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Иглы для микроинъекций должны иметь тонкий наконечник и длинную конусность. Если у съемника есть программа для изготовления игл для интрацитоплазматической инъекции сперматозоида, эта же программа может быть использована для изготовления игл для микроинъекций.
  2. Сломайте кончик иглы для микроинъекций, ударив по стеклянному шарику, прикрепленному к наконечнику микрокузницы. Убедитесь, что размер наконечника иглы для микроинъекций составляет около 1 мкм в диаметре. Проверьте размер наконечника под микроскопом при 1000-кратном увеличении.
  3. Согните иглу для микроинъекций примерно на 2-3 мм от наконечника с помощью микрокузницы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Угол изгиба зависит от настройки микроманипулятора. Слишком сильный изгиб снизит эффективность пьезоимпульса.

5. Микроинъекция зиготы

  1. Введите 1-1,5 см рабочей жидкости (инерционного тела, необходимого для пьезоэффекта для проделывания отверстий в качестве альтернативы ртути, см. Таблицу материалов) в центр иглы для микроинъекций и прикрепите ее к держателю ручного микроинжектора с помощью пьезопривода.
    1. Далее прикрепите удерживающую иглу к противоположному ручному держателю микроинжектора. Переместите операционную жидкость на кончик иглы для микроинъекций с постепенным нажимом. Закрепите оба ручных держателя микроинжекторов на микроманипуляторе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочую жидкость, выходящую из кончика иглы для микроинъекций, можно наблюдать под микроскопом при 50-кратном увеличении. После регулировки количества испускаемой жидкости при применении пьезоимпульсов можно наблюдать разбрызгивание жидкости, подтверждая, что пьезоимпульсы эффективны. Если это не может быть подтверждено, повторно подготовьте иглу для микроинъекций.
  2. Подготовьте инъекционную камеру с тремя каплями: (1) 10 мкл среды М2; (2) 5 мкл 12% поливинилпирролидона (ПВП) в среде М2; и (3) смесь 5 мкл крРНК, тракрРНК, белка Cas9 и раствора донорской ДНК (РНПД). Покройте капли минеральным маслом так же, как на шаге 3.2, и установите камеру впрыска на перевернутый столик микроскопа.
    1. Под перевернутым микроскопом при 50-кратном увеличении опустите пипетку для микроинъекций в 12% каплю PVP. Аспирируйте и распределите 12% PVP, чтобы очистить внутреннюю часть кончика иглы для микроинъекций и перенести ее в каплю RNPD.
  3. Поместите ручной микроинжектор под отрицательное давление и всосите раствор RNPD в иглу для микроинъекций. Подождите несколько минут, пока не будет аспирирован достаточный объем; Под микроскопом, увеличенным в 50 раз, заполните жидкостью всю внутреннюю часть иглы для микроинъекций.
    1. Прекратите впуск и дайте раствору RNPD постепенно вытесняться, установив ручной микроинжектор на положительное давление. Переместите кончик иглы для микроинъекций в масло.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поверните ручку ручного микроинжектора против часовой стрелки для вдоха. Чтобы остановить вдох, поверните ручку по часовой стрелке и постепенно увеличивайте давление, наблюдая под микроскопом. Раствор RNPD будет постепенно сливаться. Движение уровня жидкости в игле для микроинъекций позволяет подтвердить отток.
  4. Поместите 50 зигот в каплю M2 и осторожно опустите удерживающую пипетку в ту же каплю. Перенесите иглу для микроинъекций в каплю М2, содержащую зиготы. Переключитесь на 20-кратный объектив и сфокусируйтесь на кончике пипетки для микроинъекций.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите столько зигот, сколько можно ввести за 10 минут.
  5. Удерживайте зиготу и сосредоточьтесь на пронуклеусе, перемещая микроманипулятор. Вставьте иглу для микроинъекций в зиготу и поднесите кончик близко к пронуклеусу. Как только наконечник достигнет пронуклеусной мембраны, примените пьезоимпульс (интенсивность: 6-10, скорость: 1) для прокалывания.
    1. Когда игла микроинъекции прокалывает пронуклеус, вводят раствор РНПД и наблюдают за набуханием пронуклеуса. Как только пронуклеус полностью надуется, быстро вытащите иглу. Проделайте одну и ту же процедуру как на женском, так и на мужском пронуклеусе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Надувание пронуклеуса путем инъекции хорошо видно под микроскопом. Степень этой инфляции трудно описать словами, но ее можно подтвердить, обратившись к предыдущим докладам15.
  6. Переместите введенную зиготу в другое место в капле M2, чтобы идентифицировать зиготы до и после инъекции.
  7. Повторяйте шаги 5.5-5.6 до тех пор, пока не будут введены все зиготы в капле M2. После инъекции перенесите зиготы в свежую чашку М16.
  8. Выделите выжившие зиготы через 10 мин после инъекции. Удалите лизированные зиготы, которые повреждены инъекцией, и распределите выжившие зиготы по каждой капле в чашке M16. Каждая капля должна содержать 20-24 зиготы на одну псевдобеременную самку. Это сокращает время, в течение которого чашка M16 подвергается воздействию окружающей среды вне инкубатора во время переноса эмбрионов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При оптимальных условиях инъекции выживаемость составляет 90-95%. Это зависит от размера кончика иглы, силы пьезоимпульса и давления истечения раствора РНПД.

6. Перенос эмбрионов в яйцевод

  1. Для получения псевдобеременных мышей спаривайте каждую самку мыши ICR в фазе проэструса с вазолигированным самцом мыши ICR. Проверьте вилки на следующий день.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Примерно 15 псевдобеременных мышей получают из 20 спаривающихся пар.
  2. Вводят три типа смешанных анестетиков (0,2 мг / кг медетомидина, 4,0 мг / кг мидазолама и 2,5 мг / кг буторфанола, см. Таблицу материалов) подкожно псевдобеременным самкам мышей. Подтверждают соответствующую анестезию снижением частоты дыхания и исчезновением рефлексов защемления хвоста и отвода педали задних конечностей. Нанесите офтальмологическую мазь для смазывания глаз в соответствии с рекомендациями местного комитета по этике животных.
  3. После бритья бритвой спинной области мыши в положении лежа и трижды продезинфицируя операционную область, чередуя скраб на основе йода или хлоргексидина и спирт, надрежьте спинную кожу примерно на 1 см вдоль позвоночника маленькими рассекающими ножницами.
  4. Сдвиньте рану дорсального разреза в одну сторону вентрально, надрежьте мышечный слой, через который виден яичник, захватите пинцетом жир над яичником и извлеките яичник, яйцевод и матку.
    1. Закрепите жир зазубренным зажимом (см. Таблицу материалов). Положите репродуктивные ткани на стерильную марлю, чтобы избежать прямого контакта с шерстью.
  5. В следующем порядке поместите небольшое количество питательной среды (М2 или М16), несколько пузырьков воздуха в качестве маркера и зиготы в пипетку для переноса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Переносите примерно 10-12 зигот на яйцевод.
  6. Сделайте надрез с помощью микросдвига (см. Таблицу материалов) между ампулой и фимбриями яйцевода (достаточно длинный, чтобы стеклянная пипетка могла войти), введите зиготы в разрез и одновременно подтвердите, что пузырь воздуха был введен.
  7. Аналогичным образом выполните имплантацию в другой яйцевод (шаг 6.6).
  8. Зашить наружную обшивку автоклипсами (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не накладывайте швы на разрез мышечного слоя, если рана от разреза не неизбежно велика. Идеальный размер разрезаемого мышечного слоя должен быть менее 2-3 мм. Если разрез превышает 5 мм, мышечный слой следует ушивать стерилизованными шовными иглами и ниткой (см. Таблицу материалов).

7. Восстановление животных

  1. Вводят атипамезола гидрохлорид (0,3 мг / кг) подкожно мышам.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте рекомендациям местного комитета по этике животных в отношении послеоперационной анальгезии.
  2. Затем поместите мышей в клетки и держите их в тепле на горячей плите при температуре 37 ° C.
  3. После того, как мыши проснутся, держите их в тепле около 2 часов. Убедившись, что мышей нет аномального поведения, верните клетки на стойку для разведения.

Результаты

Результаты производства мышей с нокаутом генов и флоксированных мышей, использующих этот протокол, показаны в таблицах 1 и 2. Гены-мишени не были указаны, потому что каждая линия мышей с отредактированным геномом в настоящее время используется в независимом, неопубликованном проекте. Вместо этого были описаны целевые хромосомные области.

Анализ генотипирования проводился с использованием ранее описанного метода18. В этом методе генотипирования мыши, у которых донорская ДНК вставлена в непреднамеренные хромосомные участки, не считаются положительными людьми, даже если индуцируется желаемое редактирование генома. Таким образом, была показана эффективность производства мышей-основателей, которые действительно полезны для реальных целей, а не эффективность самого редактирования генома.

Медиана продуктивной эффективности 13 независимых мышей с нокаутом генов составила 20,8%, с максимумом 39,5% и минимумом 7,9% (таблица 1). Эта эффективность была сочтена достаточно практичной. Какие-либо летальные эмбриональные гены не были нацелены во время нокаутирования генной кассеты. Медианный коэффициент рождаемости при этом нелетальном нацеливании на гены составил 34,0% (максимум 43,3% и минимум 15,9%). Поскольку это сопоставимо с рождаемостью при переносе эмбрионов без генетических манипуляций, мы посчитали, что токсичность введенных элементов редактирования генома и физическое повреждение микроинъекции зиготы вряд ли повлияют на эмбриональное развитие.

Медианная эффективность производства 10 независимых флоксированных мышей составила 7,7%, с максимумом 20,7% и минимумом 2,1% (таблица 2). Хотя функции нескольких генов-мишеней были неизвестны, медианный коэффициент рождаемости составил 30,2%, с максимумом 43,8% и минимумом 17,3%. Этот показатель был сопоставим с таковым у мышей с генной кассетой, что позволяет предположить, что операция микроинъекции оказывает незначительное влияние на эмбриональное развитие флоксированных мышей.

figure-results-2220
Рисунок 1: Хронология микроинъекции зиготы. Белый и темный цвет показывают светлый и темный цикл соответственно. Мышей поддерживали в 14-часовом светлом / 10-часовом темном цикле. ПМСГ: гонадотропин сыворотки крови беременной кобылы; ХГЧ: хорионический гонадотропин человека Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2871
Рисунок 2: Приготовление культуральных блюд . (А) Культуральная чашка для зигот перед инъекцией. Поместите две капли среды M16 (20-25 мкл на каждую) в пластиковую чашку Петри диаметром 35 мм. (B) Культуральная чашка для зигот после инъекции. Поместите 10 капель (10-20 мкл на каждую каплю) M16 в пластиковую чашку Петри диаметром 35 мм. Капли покрывают минеральным маслом (3 мл). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Целевая хромосомная областьКоличествоДлина вставки (kb)Длина плеча гомологии (kb)
ЭмбрионовНоворожденныхОбследование (отъемы)Опрокидывание без rTGrTGc
ВводятПереданы5' рука3' рука
2qE2349331114 (34,4%)a1149 (7,9%)b5 (4,4%)d1.01.01.0
2qE223121578 (36,3%)a7415 (20,3%)b23 (31,1%)d2.21.01.1
5qG228826290 (34,4%)a8119 (23,5%)b18 (22,2%)d1.62.02.0
6qB127825958 (22,4%)a4611 (23,9%)b11 (23,9%)d4.21.21.0
6qE3 [ROSA26]29527797 (35,0%)a232 (8,7%)b4 (17,4%)d6.51.13.0
6qE3 [ROSA26]24621987 (39,7%)a8322 (26,5%)b18 (21,7%)d5.81.13.0
7qF5279268116 (43,3%)a11445 (39,5%)b44 (38,6%)d1.43.11.0
11qB440535356 (15,9%)a478 (17,0%)b12 (25,5%)d1.71.00.8
11qD310294100 (34,4%)a9815 (15,3%)b76 (77,6%)d1.01.82.4
12qE36832086 (26,9%)a8412 (14,3%)b19 (22,6%)d3.41.11.3
12qF131526576 (28,7%)a7217 (23,6%)b28 (38,9%)d1.01.11.1
14qE525621548 (22,3%)a4811 (22,9%)b21 (43,8%)d3.11.00.9
14qE528728585 (29,8%)a7215 (20,8%)b19 (26,4%)d2.61.00.9

Таблица 1: Получение мышей с помощью микроинъекций. В таблице показана рождаемость и эффективность получения мышей, несущих предполагаемый аллель нокаута без (W/O) случайной интеграции (rTG) донорской ДНК. Во всех проектах удалось получить мышей с предполагаемым аллелем нокаута. a: Число новорожденных/количество перенесенных эмбрионов; b: Количество мышей, перенесших нокаут-ин, / количество обследованных мышей; c: нет уверенности в том, что существует предполагаемый аллель; d: Количество мышей, несущих аллель рТГ, / количество обследованных мышей; rTG: случайная интеграция донорского вектора. Б/О: без.

Целевая хромосомная областьКоличествоДлина флокса (КБ)Длина плеча гомологии (kb)
ЭмбрионовНоворожденныхОбследование (отъемы)floxed без рТГ
ВводятПереданы5' рука3' рука
3qC32531393 (29,7%)a879 (10,3%)b1.31.21.1
4qB121020036 (18,0%)a296 (20,7%)b1.61.20.9
4qC4272256112 (43,8%)a1005 (5,0%)b2.41.01.4
5qF14313740 (29,2%)a406 (15,0%)b1.81.01.1
5qF25522780 (35,2%)a762 (2,6%)b1.31.10.9
9qE3.128926180 (30,7%)a779 (11,7%)b1.21.21.2
10qB328426988 (32,7%)a783 (3,8%)b1.31.10.9
10qC124323140 (17,3%)a384 (10,5%)b2.11.01.3
14qE5390372139 (37,4%)a1355 (3,7%)b1.10.80.9
17кА3.338337499 (26,5%)a952 (2,1%)b2.10.60.8

Таблица 2: Производство флоксированных мышей путем микроинъекций. В таблице показана рождаемость и эффективность получения мышей, несущих предполагаемый аллель флокса без (W/O) случайной интеграции (rTG) донорской ДНК. Во всех проектах удалось получить мышей с предполагаемым аллелем флокса. a: Число новорожденных/количество перенесенных эмбрионов; B: Количество мышей, несущих аллель флокса/количество обследованных мышей. рТГ: случайная интеграция донорского вектора; Б/О: без.

Обсуждение

В настоящем исследовании свежие (не замороженные-размороженные) мышиные зиготы C57BL/6J, полученные в результате естественного спаривания, использовались для редактирования генома мышиного производства. Путем инъекции crRNA-tracrRNA-Cas9 и донорской ДНК (RNPD) в оба пронуклеуса этих зигот в фазе клеточного цикла, где наиболее вероятно нокаутирование, были получены мыши с кассетой генов и флоксированными мышами с высокой рождаемостью и достаточной эффективностью редактирования генома. Настоящее исследование усиливает расширяемость метода SPRINT-CRISPR15, где он обеспечивает достаточную эффективность нокаута даже в генетическом фоне C57BL / 6J и может быть применен для получения флоксированных мышей.

Электропорация является высоко обобщенным методом получения мышей с отредактированным геномом из-за низкой стоимости экспериментальных устройств и простоты изучения техники8. Кроме того, метод19 i-GONAD, в котором редактирование генома выполняется с помощью преимплантационных эмбрионов, существующих в яйцеводе, не требует мыши-реципиента. По сравнению с этими методами, представленный здесь метод является дорогостоящим и трудоемким при подготовке и обслуживании экспериментальной среды с точки зрения как аппаратного, так и программного обеспечения. Однако, как только экспериментальные установки будут созданы, сложные мыши с нокаутом генных кассет и флоксированные мыши могут быть получены только с коммерчески доступными элементами CRISPR (крРНК, тракрРНК и белок Cas9) и простым, небольшим количеством кольцевого плазмидного вектора, который будет использоваться в качестве донорской ДНК. Это означает, что многие сложные линии мышей с отредактированным геномом могут быть получены без необходимости подготовки трудоемких (или относительно дорогих) lsODN 5,6 или аденоассоциированных вирусных векторов20.

В отличие от оригинального метода SPRINT-CRISPR15, использовались свежие (замороженные-размороженные) зиготы. При получении свежих зигот путем естественного спаривания можно игнорировать технические ошибки, которые могут возникнуть при экстракорпоральном оплодотворении или замораживании и размораживании. Кроме того, процесс манипуляций с эмбрионом может быть завершен примерно за полдня (рис. 1) в соответствии с текущим подходом. С другой стороны, некоторые ограничения настоящего способа включают в себя требования к большому количеству мышей-самцов, свободный контроль времени оплодотворения и ограниченную способность полностью предсказывать количество зигот для микроинъекций. По сравнению с оригинальным методом SPRINT-CRISPR, этот метод может иметь более высокий уровень рождаемости (табл. 1). Несмотря на это, нельзя сделать вывод, что данный метод лучше с точки зрения рождаемости из-за различий в проводниках эксперимента, генах-мишенях, генетических фонах и сроках подтверждения эмбрионов.

Как показано в таблице 1, большое количество мышей в большинстве проектов нокаутирования генных кассет имели случайные аллели интеграции. Случайная интеграция должна быть устранена, потому что она может привести к непреднамеренному нарушению эндогенных генов и эктопической экспрессии трансгенов. Задача на будущее состоит в том, чтобы найти экспериментальные условия, которые уменьшат количество случайных событий интегрирования, сохраняя при этом достаточную эффективность докаутирования.

Почти все редактирование генома зиготы мыши с использованием эффекторов редактирования генома, которые приводят к двухцепочечным разрывам ДНК, вероятно, индуцирует непреднамеренные мутации на целевых участках 9,21. Результаты этих непреднамеренных мутаций-мишеней здесь не описаны, потому что мы не находимся в ситуации, в которой можно управлять следующим поколением мышей, чтобы представить четкие доказательства их существования. Лучший способ исключить беспокойство по поводу путаницы, вызванной непреднамеренным мутагенезом на мишени, - это получить следующее поколение мышей путем спаривания основателей с мышами дикого типа, а не путем скрещивания основателей. В принципе, мыши N1, полученные в результате этого скрещивания, относятся к дикому типу (WT) на одной стороне аллеля, поэтому, если обнаружен предполагаемый аллель нокаута (KI), они гетерозиготны WT/KI. Таким образом, целевой мутагенез не является критической проблемой у лабораторных мышей, которые имеют относительно быстрый жизненный цикл и являются плодовитым животным. Тем не менее, дальнейшее совершенствование будет необходимо, когда эта технология будет применена к относительно крупным млекопитающим.

Было подтверждено, что эта технология может производить мышей с нокаутом генов в инбредных штаммах, отличных от C57BL / 6J, но достаточное количество проектов не защищено, и данные сильно варьируются. По этой причине данная информация не включена в настоящее исследование. Считается, что дальнейшие исследования по этому вопросу будут необходимы для продвижения генетики мышей и исследований моделей заболеваний.

Раскрытие информации

Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана научными исследованиями (B) (19H03142: к SM), научными исследованиями (A) (20H00444: к FS), научными исследованиями (A) (21H04838: к SM) и научными исследованиями по инновационным направлениям «Платформа поддержки передовых моделей животных» (16H06276: к ST) от Министерства образования, культуры, спорта, науки и технологий. Спонсоры не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи. Мы благодарны Рёити Мори за его полезную дискуссию о дизайне редактирования генома.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Atipamezole HydrochlorideZENOAQ-
Autoclip Wound ClipBD427631
Autoclip Wound Clip ApplierBD427630
ButorphanolMeiji Seika Pharma-
C57BL/6J miceJackson Laboratory Japan-older than 10 weeks old
Calibrated Pipet, 100ulDrummond Scientific Company2-000-100for collecting zygote and embryo transfer
Cas9Thermo Fisher ScientificA36499
Cas9 Nuclease Reaction BufferNEBB7203
CellTram 4r  oilEppendorf5196000030
CRISPORhttp://crispor.tefor.net/web tool for genome editing experiments with the CRISPR-Cas9 system
crRNAIDT-
Gel/PCR Extraction KitFastGeneFG-91302
hCGASKA Animal Health-
HyaluronidaseMerck Sigma-AldrichH3884
ICR miceJackson Laboratory Japan-older than 10 weeks old, weight 28 G or more
Inverted microscopeLeica
KOnezumihttps://www.md.tsukuba.ac.jp/LabAnimalResCNT/KOanimals/konezumi.htmla web application for automating gene disruption strategies to generate knockout mice
M16 mediumMerck Sigma-AldrichM7292
M2 mediumMerck Sigma-AldrichM7167
MedetomidineZENOAQ-
Micro shearsNatsume SeisakushoMB-54-1
MicroforgeNarishigeMF-900for fire polishing of holding pipette and bending the microinjection needle
Micromanipulator unitsNarishige
Micropipette pullerSutter InstrumentP-1000programmable pipette puller
MidazolamMaruishi Pharmaceutical-
MILLEX-GV 0.22 µm filterMerck MilliporeSLGV033R
Mineral oilNacalai26114-75for zygote culture and injection chamber
Petri dish (35mm, untreated)Iwaki1000-035for zygote culture
PIEZO micromanipulatorPRIME TECHPMM-150
Plasmid Mini KitFastGeneFG-90502mini prep spin column kit
PMM Operation LiquidPRIME TECHKIT-Aoperation liquid for microinjection
PMSGASKA Animal Health-
PolyvinylpyrrolidoneMerck Sigma-AldrichP5288
RNaseQIAGEN19101
RNase Free WaterIDT-tracrRNA Accessory Reagents
Serrefine clampNatsume SeisakushoC-18
Sodium dodecyl sulfateSIGMA151-21-3
Suture needle with threadNatsume SeisakushoC11-60B2
Thin wall borosilicate glass
without filament		Sutter InstrumentB100-75-10for microinjection needle and holding pipette
tracrRNAIDT-

Ссылки

  1. Suzuki, H., et al. Generation of bicistronic reporter knockin mice for visualizing germ layers. Experimental Animals. 68 (4), 499-509 (2019).
  2. Le, H. T., et al. Generation of B6-Ddx4(em1(CreERT2)Utr) , a novel CreERT2 knock-in line, for germ cell lineage by CRISPR/Cas9. Genesis. 58 (7), 23367 (2020).
  3. Osawa, Y., et al. EXOC1 plays an integral role in spermatogonia pseudopod elongation and spermatocyte stable syncytium formation in mice. Elife. 10, 59759 (2021).
  4. Funato, H., et al. Forward-genetics analysis of sleep in randomly mutagenized mice. Nature. 539 (7629), 378-383 (2016).
  5. Yoshimi, K., et al. ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes. Nature Communications. 7, 10431 (2016).
  6. Miura, H., Gurumurthy, C. B., Sato, T., Sato, M., Ohtsuka, M. CRISPR/Cas9-based generation of knockdown mice by intronic insertion of artificial microRNA using longer single-stranded DNA. Scientific Reports. 5, 12799 (2015).
  7. Murata, K., et al. Efficient induction of proximity-dependent labelling by biotin feeding in BMAL1-BioID knock-in mice. The Journal of Biochemistry. 170 (4), 453-461 (2021).
  8. Kaneko, T., Mashimo, T. Simple genome editing of rodent intact embryos by electroporation. PLoS One. 10 (11), 0142755 (2015).
  9. Kuno, A., et al. DAJIN enables multiplex genotyping to simultaneously validate intended and unintended target genome editing outcomes. PLOS Biology. 20 (1), 3001507 (2022).
  10. Miyasaka, Y., et al. CLICK: one-step generation of conditional knockout mice. BMC Genomics. 19 (1), 318 (2018).
  11. Gurumurthy, C. B., et al. Reproducibility of CRISPR-Cas9 methods for generation of conditional mouse alleles: a multi-center evaluation. Genome Biology. 20 (1), 171 (2019).
  12. Yang, H., et al. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
  13. Hasegawa, Y., et al. Generation of CRISPR/Cas9-mediated bicistronic knock-in ins1-cre driver mice. Experimental Animals. 65 (3), 319-327 (2016).
  14. Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16, 87 (2015).
  15. Abe, T., Inoue, K. I., Furuta, Y., Kiyonari, H. Pronuclear Microinjection during S-phase increases the efficiency of CRISPR-Cas9-assisted knockin of large DNA donors in mouse zygotes. Cell Reports. 31 (7), 107653 (2020).
  16. Lilue, J., et al. Sixteen diverse laboratory mouse reference genomes define strain-specific haplotypes and novel functional loci. Nature Genetics. 50 (11), 1574-1583 (2018).
  17. Birling, M. C., et al. A resource of targeted mutant mouse lines for 5,061 genes. Nature Genetics. 53 (4), 416-419 (2021).
  18. Mizuno-Iijima, S., et al. Efficient production of large deletion and gene fragment knock-in mice mediated by genome editing with Cas9-mouse Cdt1 in mouse zygotes. Methods. 191, 23-31 (2021).
  19. Ohtsuka, M., et al. i-GONAD: a robust method for in situ germline genome engineering using CRISPR nucleases. Genome Biology. 19 (1), 25 (2018).
  20. Mizuno, N., et al. Intra-embryo gene cassette knockin by CRISPR/Cas9-mediated genome editing with adeno-associated viral vector. iScience. 9, 286-297 (2018).
  21. Burgio, G., Teboul, L. Anticipating and identifying collateral damage in genome editing. Trends in Genetics. 36 (12), 905-914 (2020).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

184CRISPR Cas9

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены