Microinjeção de zigoto para criação de alelos knock-in e flox de gênico em camundongos

Resumo

O presente protocolo descreve a microinjeção de zigoto de CRISPR-Cas9 e DNA do doador para produzir eficientemente camundongos knock-in e floxed de gênico.

Resumo

A tecnologia CRISPR-Cas permitiu a geração rápida e sem esforço de camundongos geneticamente modificados. Especificamente, camundongos e camundongos mutantes pontuais são prontamente produzidos por eletroporação de fatores CRISPR (e doadores de DNA oligo de fita simples) no zigoto. Em contraste, camundongos knock-in e floxed de gênico (>1 kb) são gerados principalmente por microinjeção de fatores CRISPR e doadores de DNA de fita dupla em zigotos. As tecnologias de edição do genoma também aumentaram a flexibilidade da produção de camundongos geneticamente modificados. Agora é possível introduzir as mutações pretendidas nas regiões genômicas alvo em várias cepas benéficas de camundongos. Nossa equipe produziu mais de 200 linhas de camundongos knock-in de genético e mais de 110 linhagens de camundongos floxados por microinjeção de zigoto de CRISPR-Cas9 após solicitações de vários países, incluindo o Japão. Algumas dessas edições de genoma usaram linhagens BALB/c, C3H/HeJ e C57BL/6N, porém a maioria usou cepas C57BL/6J. Ao contrário do método de eletroporação, a edição do genoma por microinjeção de zigoto em várias linhagens de camundongos não é tão fácil. No entanto, camundongos knock-in e floxed de genético em fundos genéticos endogâmicos únicos são tão críticos quanto modelos genéticos humanizados, fluorescentes e camundongos nocaute condicional. Portanto, este artigo apresenta o protocolo para a microinjeção de zigoto de fatores CRISPR e doadores de DNA de fita dupla em camundongos C57BL/6J para geração de camundongos knock-in e floxed de gênico. Este artigo enfoca exclusivamente a injeção nuclear em vez da injeção citoplasmática. Além da microinjeção de zigoto, delineamos o cronograma do processo de produção e técnicas periféricas, como indução de superovulação e transferência embrionária.

Introdução

Camundongos knock-in, nos quais os genes exógenos pretendidos são introduzidos nos loci alvo, são amplamente utilizados em muitos estudos in vivo como camundongos humanizados genes, camundongos repórteres fluorescentes e camundongos condutores Cre ^1,2. Quando mutações knock-in são induzidas pela edição do genoma em zigotos de camundongos, DNA de fita simples (doadores de DNA oligo de fita simples, ssODN) ou DNA de fita dupla (dsDNA) é usado como DNA do doador ^2,3. O ssODN é usado principalmente para knock-in de fragmentos gênicos relativamente curtos de menos de 200 pb⁴. É possível derrubar fragmentos com mais de 1 kb de DNA usando ssODNs longos (lsODN)^5,6, porém sua preparação é demorada. Quando doadores de dsDNA são usados, camundongos knock-in de gênico (>1 kb) podem ser gerados sem a preparação trabalhosa do DNA do doador⁷.

A principal vantagem do uso de ssODNs é que a eletroporação⁸ pode gerar camundongos knock-in. No entanto, doadores de dsDNA devem ser introduzidos diretamente no núcleo por microinjeção de zigoto. O knock-in simultâneo em dois locais é necessário para criar camundongos floxados, nos quais cada sequência loxP é batida a montante e a jusante do gene alvo. Existem duas maneiras de gerar camundongos floxados por edição de genoma em zigotos de camundongos - usando dois ssODNs independentes, cada um carregando um único sítio loxP, ou usando um único dsDNA (ou lsDNA) com uma sequência floxed; o primeiro é muito ineficiente 9,10,11. A edição do genoma usando doadores de dsDNA é a abordagem mais simples para produzir camundongos knock-in e floxed de genético se o ambiente for propício à microinjeção de zigoto.

Inicialmente, misturas de mRNA de Cas9 e sgRNA ou vetores de DNA que codificam sgRNA e Cas9 são utilizadas para edição do genoma em zigotos de camundongos^12,13. Uma vez que proteínas Cas9 estáveis e de alta qualidade estão agora disponíveis a um baixo custo, a introdução da ribonucleoproteína (RNP) crRNA-tracrRNA-Cas9 em zigotos de camundongos¹⁴ tornou-se popular. Recentemente, camundongos knock-in foram gerados com alta eficiência pela introdução do RNP crRNA-tracrRNA-Cas9 e DNA doador em ambos os pronúcleos de zigotos de camundongos em uma fase do ciclo celular em que o knock-in é mais provável de ocorrer¹⁵. Portanto, o presente protocolo descreve técnicas para a produção de vários tipos de camundongos knock-in por este método.

Existem muitas linhagens endogâmicas úteis de camundongos de laboratório¹⁶. A modificação genética dentro do fundo endogâmico pode desconsiderar a influência do background genético no fenótipo. Este artigo descreve um método para induzir mutações no gene knock-in e floxed no zigoto da linhagem de camundongos endogâmica mais comumente usada, a C57BL/6J¹⁷. Além disso, a linha do tempo para a geração de camundongos geneticamente modificados e as técnicas periféricas utilizadas também são discutidas, incluindo a indução de superovulação e transferência de embriões.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram conduzidos humanamente com aprovação do Comitê Institucional de Experimentação Animal da Universidade de Tsukuba, de acordo com os Regulamentos para Experimentos com Animais da Universidade de Tsukuba e as Diretrizes Fundamentais para a Condução Adequada de Experimentos com Animais e Atividades Relacionadas em Instituições de Pesquisa Acadêmica sob a jurisdição do Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia do Japão. Camundongos C57BL/6J de ambos os sexos, com 10-25 semanas de idade, foram utilizados como doadores de zigoto. Camundongos ICR (com mais de 10 semanas) foram usados como camundongos receptores. Os camundongos foram obtidos de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais).

1. Confirmação da atividade de clivagem do crRNA em um sistema livre de células

1. Dissolver 2 nmol de crRNA (seco) e 20 nmol de tracrRNA (seco) em 25 μL e 250 μL de água livre de RNase, respectivamente (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: As sequências-alvo CRISPR que foram previstas para ter alta atividade de clivagem e o menor número possível de alvos fora dos alvos são selecionadas usando CRISPOR (consulte Tabela de Materiais). No caso de knock-in de genético, direcione a sequência através do local de inserção. O(s) éxon(s) a ser floxado(s) foi(ram) selecionado(s) utilizando-se o KOnezumi (ver Tabela de Materiais).
2. Amplificar o fragmento de DNA (aproximadamente 0,5-1 kb) contendo o sítio alvo por PCR genômico⁹. Purifice este amplicon de PCR com o kit de extração de produto PCR comum (consulte a Tabela de Materiais).
3. Preparar 10 μL de mistura CRISPR (100 ng/μL de crRNA, 150 ng/μL de tracrRNA e 1 ng/μL de Cas9 no tampão de reação de nuclease Cas9, ver Tabela de Materiais). Para construir o complexo CRISPR-Cas9, coloque a mistura CRISPR em um bloco de calor a 37 °C por 30 min.
4. Adicionar o volume total (10 μL) da mistura CRISPR ao produto da PCR (10 μL, 20 ng/μL) descrito no passo 1.2 e incubar a 37 °C durante 1 h. Adicionar 1 μL de RNase (500 ng/μL) para degradar o crRNA e o tracrRNA a 37 °C por 30 min, pois os RNAs devem estar ausentes durante a eletroforese. Realizar eletroforese das amostras acima utilizando corante de carga contendo dodecil sulfato de sódio (2% p/v).
   NOTA: Em casos raros, crRNAs sem atividade de clivagem são observados. Nesses casos, recomenda-se redesenhar o design de edição do genoma.

2. Preparação da mistura de crRNA, tracrRNA, proteína Cas9 e DNA do doador para microinjeção de zigoto

1. Preparar solução CRISPR (50 ng/μL de crRNA, 200 ng/μL de tracrRNA e 200 ng/μL de Cas9 em água livre de RNase). Preparar uma solução de ADN do dador (20 ng/μL de vector de ADN plasmidial auto-construído).
   1. Filtrar a solução de ADN do dador através de um filtro de seringa estéril com um tamanho de poro de 0,22 μm. Misture volumes iguais de solução CRISPR e solução filtrada de DNA de doador. Certifique-se de que a concentração final de cada um seja de 25 ng/μL de crRNA, 100 ng/μL de tracrRNA, 100 ng/μL de Cas9 e 10 ng/μL de DNA do doador. Essa mistura será doravante denominada RNPD.
      NOTA: Ao cortar dois locais, como durante a produção de camundongos floxados, a concentração de cada crRNA deve ser de 25 ng/μL. O DNA do doador é um DNA plasmidial circular e pode ser purificado com um kit comum de coluna de spin de mini preparação (ver Tabela de Materiais). A solução preparada deve ser colocada no gelo e utilizada para micro-injecção o mais rapidamente possível.

3. Obtenção de zigotos de camundongos por acasalamento natural

1. Injetar 5 UI de gonadotrofina sérica de égua gestante (PMSG, ver Tabela de materiais) por via subcutânea em ratinhos fêmeas C57BL/6J (10-25 semanas de idade) 3 dias antes da microinjeção. Aproximadamente 46-48 h mais tarde, administrar 5 UI de gonadotrofina coriónica humana (hCG, ver Tabela de materiais) por via intraperitoneal. Co-alojar os camundongos fêmeas tratados com PMSG e hCG com camundongos C57BL/6J machos e verificar os tampões vaginais na manhã seguinte.
   NOTA: Aproximadamente 15-25 zigotos podem ser obtidos de um camundongo fêmea C57BL/6J. A linha do tempo é mostrada na Figura 1.
2. Preparar duas placas de Petri de 35 mm para cultura de zigoto, como mostra a Figura 2. Colocá-los na incubadora (37 °C, 5% CO₂) até à sua utilização. Estes podem ser armazenados durante a noite.
3. Eutanasiar as ratas fêmeas com tampões vaginais confirmados por deslocamento cervical e, usando pequenas tesouras, incisar através da pele abdominal e da camada muscular da linha média do abdome inferior até abaixo das costelas.
   NOTA: Siga as recomendações do comitê local de ética animal para a eutanásia.
4. Recolher os ovidutos e colocá-los numa gota de 20 μL de meio M2 contendo 0,75 mg/ml de hialuronidase (ver Tabela de Materiais) na tampa da placa de Petri. Pegar um oviduto com pinça de ponta fina e perfundir cerca de 50 μL de meio M2 com hialuronidase através das fímbrias.
   NOTA: Neste momento, os zigotos estão vagamente rodeados por numerosas células cumulus.
5. Após 30 s, pegue zigotos morfologicamente normais com uma pequena quantidade de meio usando um capilar de vidro e lave-os transferindo-os para gotículas médias M16 frescas. Transfira os zigotos lavados para uma placa de Petri (Figura 2) para pooling.
   NOTA: A linha do tempo é mostrada na Figura 1. Os zigotos morfologicamente normais possuem um pró-núcleo masculino e feminino e dois corpos polares que não comprometeram severamente a forma esférica¹⁵. A morfologia do zigoto varia consideravelmente entre cepas e espécies.
6. Repita as etapas 3.3 e 3.4 até que todos os zigotos sejam recuperados. Cerca de 100 zigotos podem ser agrupados em uma gota M16 no prato de cultura. Conservar o prato na incubadora (37 °C, 5% CO₂) até à microinjeção.

4. Preparação da agulha de microinjeção

1. Puxe algumas pipetas de vidro usando o extrator de pipeta programável (consulte Tabela de Materiais).
   NOTA: As agulhas de microinjeção devem ter uma ponta fina e conicidade longa. Se o extrator tem um programa para fazer agulhas para injeção intracitoplasmática de espermatozoides, o mesmo programa pode ser usado para fazer agulhas para microinjeção.
2. Quebre a ponta da agulha de microinjeção batendo na bola de vidro presa à ponta da microforja. Certifique-se de que o tamanho da ponta da agulha de microinjeção é de cerca de 1 μm de diâmetro. Verifique o tamanho da ponta ao microscópio com aumento de 1000x.
3. Dobre a agulha de microinjeção a cerca de 2-3 mm da ponta usando uma microforja.
   NOTA: O ângulo da curvatura depende da configuração do micromanipulador. Muita flexão reduzirá a eficácia do pulso piezo.

5. Microinjeção de zigoto

1. Injete 1-1,5 cm do líquido de operação (corpo de inércia que é necessário para o efeito piezo fazer furos como uma alternativa ao mercúrio, ver Tabela de Materiais) no centro da agulha de microinjeção e conecte-o ao suporte manual do microinjetor com o atuador piezo.
   1. Além disso, conecte a agulha de fixação ao suporte manual oposto do microinjetor. Mova o líquido de operação para a ponta da agulha de microinjeção com pressão gradual. Fixe ambos os suportes manuais do microinjetor no micromanipulador.
      NOTA: O líquido de operação que sai da ponta da agulha de microinjeção pode ser observado ao microscópio em aumento de 50x. Após o ajuste da quantidade de líquido emitido, pode-se observar respingos de líquido quando os pulsos piezo são aplicados, confirmando que os pulsos piezo são eficazes. Se isso não puder ser confirmado, reprepare a agulha de microinjeção.
2. Preparar uma câmara de injeção com três gotículas: (1) 10 μL de meio M2; (2) 5 μL de polivinilpirrolidona (PVP) a 12% em meio M2; e (3) uma mistura de 5 μL de crRNA, tracrRNA, proteína Cas9 e solução de DNA do doador (RNPD). Cubra as gotículas com óleo mineral da mesma forma que o passo 3.2 e coloque a câmara de injeção no estágio do microscópio invertido.
   1. Sob o microscópio invertido em um aumento de 50x, abaixe a pipeta de microinjeção para a gota de PVP de 12%. Aspirar e dispensar PVP a 12% para limpar o interior da ponta da agulha de microinjeção e transferi-lo para a gota RNPD.
3. Coloque o microinjetor manual sob pressão negativa e sugue a solução de RNPD para a agulha de microinjeção. Aguarde alguns minutos até que um volume suficiente seja aspirado; Sob um microscópio ampliado 50x, preencha todo o interior da agulha de microinjeção com líquido.
   1. Pare a ingestão e permita que a solução RNPD seja expelida gradualmente, ajustando o microinjetor manual à pressão positiva. Mova a ponta da agulha de microinjeção para dentro do óleo.
      NOTA: Gire o botão do microinjetor manual no sentido anti-horário para inalação. Para parar a inalação, gire o botão no sentido horário e aumente gradualmente a pressão enquanto observa sob um microscópio. A solução RNPD será drenada gradualmente. O movimento do nível de líquido na agulha de microinjeção permite a confirmação do fluxo de saída.
4. Coloque 50 zigotos na gota M2 e abaixe suavemente a pipeta de retenção na mesma gota. Transfira a agulha de microinjeção para a gota M2 contendo zigotos. Mude para uma objetiva de 20x e concentre-se na ponta da pipeta de microinjeção.
   NOTA: Coloque quantos zigotos podem ser injetados em 10 min.
5. Segure um zigoto e concentre-se no pró-núcleo movendo o micromanipulador. Insira a agulha de microinjeção no zigoto e aproxime a ponta do pró-núcleo. Uma vez que a ponta atinge a membrana do pró-núcleo, aplique o pulso piezo (intensidade: 6-10, velocidade: 1) para perfurar.
   1. Quando a agulha de microinjeção punciona o pró-núcleo, injete a solução de RNPD e observe o inchaço do pró-núcleo. Uma vez que o pró-núcleo está totalmente inflado, puxe rapidamente a agulha. Realizar o mesmo procedimento nos pró-núcleos feminino e masculino.
      NOTA: A insuflação do pró-núcleo por injeção pode ser claramente vista sob o microscópio. O grau dessa inflação é difícil de verbalizar, mas pode ser confirmado consultando relatos anteriores¹⁵.
6. Mova o zigoto injetado para outro local dentro da gota M2 para identificar os zigotos antes e depois da injeção.
7. Repita os passos 5.5-5.6 até que todos os zigotos na gota M2 tenham sido injetados. Após a injeção, transfira os zigotos para um prato M16 fresco.
8. Selecione os zigotos sobreviventes 10 minutos após a injeção. Remova os zigotos lisados que são danificados pela injeção e distribua os zigotos sobreviventes para cada gotícula na placa M16. Cada gota deve conter 20-24 zigotos para uma fêmea pseudográvida. Isso reduz o tempo que a placa M16 fica exposta ao ambiente fora da incubadora durante a transferência de embriões.
   NOTA: Sob condições ideais de injeção, a taxa de sobrevivência é de 90%-95%. Isso depende do tamanho da ponta da agulha, da força do pulso piezo e da pressão de saída da solução RNPD.

6. Transferência de embriões para o oviduto

1. Para a obtenção de camundongos pseudogestantes, acasalar cada camundongo ICR fêmea na fase de proestro com um camundongo ICR macho vasoligado. Verifique os plugues no dia seguinte.
   NOTA: Aproximadamente 15 camundongos pseudogestantes são obtidos de 20 pares de acasalamento.
2. Administrar três tipos de agentes anestésicos mistos (0,2 mg/kg de medetomidina, 4,0 mg/kg de midazolam e 2,5 mg/kg de butorfanol, ver Tabela de Materiais) por via subcutânea às ratas pseudográvidas. Confirme a anestesia apropriada por meio da diminuição da frequência respiratória e do desaparecimento dos reflexos de retirada do pedal da cauda e do membro posterior. Aplique pomada oftálmica para lubrificar os olhos de acordo com as recomendações do comitê de ética animal local.
3. Após raspar a região dorsal do camundongo em decúbito ventral e desinfetar a área cirúrgica três vezes, alternando entre uma esfoliação à base de iodo ou clorexidina e álcool, incisar a pele dorsal aproximadamente 1 cm ao longo da coluna vertebral com uma pequena tesoura dissecante.
4. Desloque a ferida da incisão dorsal para um lado ventralmente, incise a camada muscular através da qual o ovário pode ser visto, agarre a gordura acima do ovário com uma pinça e retire o ovário, o oviduto e o útero.
   1. Fixe a gordura com uma braçadeira serrefine (ver Tabela de Materiais). Coloque os tecidos reprodutivos em gaze estéril para evitar o contato direto com a pelagem.
5. Na ordem seguinte, coloque uma pequena quantidade de meio de cultura (M2 ou M16), algumas bolhas de ar como marcador e os zigotos em uma pipeta para transferência.
   NOTA: Transferir aproximadamente 10-12 zigotos por oviduto.
6. Faça uma incisão usando um microcisalhamento (ver Tabela de Materiais) entre a ampola e as fímbrias do oviduto (apenas o tempo suficiente para permitir a entrada da pipeta de vidro), introduza os zigotos na incisão e, simultaneamente, confirme que a bolha de ar foi introduzida.
7. Realizar a implantação no outro oviduto da mesma forma (passo 6.6).
8. Sutura a pele externa com autoclipes (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: Não suture a camada muscular incisada a menos que a ferida da incisão seja inevitavelmente grande. O tamanho ideal da camada muscular incisada deve ser inferior a 2-3 mm. Se a incisão for maior que 5 mm, a camada muscular deve ser suturada com agulha e fio de sutura esterilizados (ver Tabela de Materiais).

7. Recuperação de animais

1. Administrar cloridrato de atipamezol (0,3 mg/kg) por via subcutânea a camundongos.
   NOTA: Siga as recomendações do comitê de ética animal local para analgesia pós-operatória.
2. Em seguida, coloque os ratos em gaiolas e mantenha-os aquecidos em uma placa quente a 37 °C.
3. Depois que os ratos forem acordados, mantenha-os aquecidos por cerca de 2 h. Após a confirmação de que não houve comportamento anormal dos camundongos, devolva as gaiolas ao criadouro.

Resultados

Os resultados de produção de camundongos knock-in e floxed usando esse protocolo são mostrados na Tabela 1 e na Tabela 2. Os genes-alvo não foram declarados porque cada linhagem de camundongo editada pelo genoma está sendo usada atualmente em um projeto independente e inédito. Em vez disso, as regiões cromossômicas alvo foram descritas.

As análises de genotipagem foram realizadas por método previamente^relatado18. Neste método de genotipagem, camundongos nos quais o DNA do doador é inserido em sítios cromossômicos não intencionais não são contados como indivíduos positivos, mesmo que a edição desejada do genoma seja induzida. Assim, a eficiência de produção dos ratos fundadores que são verdadeiramente úteis para fins reais foi mostrada, em vez da eficiência da edição do genoma em si.

A mediana da eficiência de produção de 13 camundongos knock-in de genéticos independentes foi de 20,8%, com um máximo de 39,5% e um mínimo de 7,9% (Tabela 1). Esta eficiência foi considerada suficientemente prática. Quaisquer genes embrionários letais não foram visados durante o knock-in do genético. A mediana da taxa de natalidade sob esta condição de alvo genético não letal foi de 34,0% (máximo de 43,3% e mínimo de 15,9%). Uma vez que isso é comparável à taxa de natalidade na transferência de embriões sem manipulação genética, consideramos que a toxicidade dos elementos de edição do genoma introduzidos e os danos físicos da microinjeção de zigoto eram improváveis de afetar o desenvolvimento embrionário.

A mediana da eficiência de produção dos 10 camundongos independentes floxados foi de 7,7%, com máximo de 20,7% e mínimo de 2,1% (Tabela 2). Embora as funções de vários genes-alvo fossem desconhecidas, a mediana da taxa de natalidade foi de 30,2%, com um máximo de 43,8% e um mínimo de 17,3%. Essa taxa foi comparável à de camundongos knock-in de genético, sugerindo que a operação de microinjeção tem um efeito insignificante no desenvolvimento embrionário de camundongos floxed.

Figura 1: Linha do tempo da microinjeção de zigoto. As cores branca e escura mostram o ciclo claro e escuro, respectivamente. Os camundongos foram mantidos sob um ciclo claro/10 h escuro de 14 h. PMSG: gonadotrofina sérica de égua gestante; hCG: gonadotrofina coriônica humana Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Preparo dos pratos de cultura. (A) Prato de cultura para os zigotos antes da injeção. Coloque duas gotas do meio M16 (20-25 μL para cada) em uma placa de Petri plástica de 35 mm. (B) Placa de cultura para os zigotos após a injeção. Coloque 10 gotas (10-20 μL para cada gota) de M16 em uma placa de Petri plástica de 35 mm. As gotas são cobertas com óleo mineral (3 mL). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Região cromossômica alvo	Número de						Comprimento de inserção (kb)	Comprimento do braço de homologia (kb)
	Embriões		Recém-nascidos	Examinado (desmame)	Knock-in sem rTG	rTGc
	injetado	transferido						5' braço	3' braço
2qE2	349	331	114 (34,4%)a	114	9 (7,9%)b	5 (4,4%)d	1.0	1.0	1.0
2qE2	231	215	78 (36,3%)a	74	15 (20,3%)b	23 (31,1%)d	2.2	1.0	1.1
5qG2	288	262	90 (34,4%)a	81	19 (23,5%)b	18 (22,2%)d	1.6	2.0	2.0
6qB1	278	259	58 (22,4%)a	46	11 (23,9%)b	11 (23,9%)d	4.2	1.2	1.0
6qE3 [ROSA26]	295	277	97 (35,0%)a	23	2 (8,7%)b	4 (17,4%)d	6.5	1.1	3.0
6qE3 [ROSA26]	246	219	87 (39,7%)a	83	22 (26,5%)b	18 (21,7%)d	5.8	1.1	3.0
7qF5	279	268	116 (43,3%)a	114	45 (39,5%)b	44 (38,6%)d	1.4	3.1	1.0
11qB4	405	353	56 (15,9%)a	47	8 (17,0%)b	12 (25,5%)d	1.7	1.0	0.8
11qD	310	294	100 (34,4%)a	98	15 (15,3%)b	76 (77,6%)d	1.0	1.8	2.4
12qE	368	320	86 (26,9%)a	84	12 (14,3%)b	19 (22,6%)d	3.4	1.1	1.3
12qF1	315	265	76 (28,7%)a	72	17 (23,6%)b	28 (38,9%)d	1.0	1.1	1.1
14qE5	256	215	48 (22,3%)a	48	11 (22,9%)b	21 (43,8%)d	3.1	1.0	0.9
14qE5	287	285	85 (29,8%)a	72	15 (20,8%)b	19 (26,4%)d	2.6	1.0	0.9

Tabela 1: Produção de camundongos knock-in por microinjeção. A tabela mostra a taxa de natalidade e a eficiência da produção de camundongos que carregam o alelo knock-in pretendido sem integração aleatória (RTG) do DNA do doador. Foi possível obter camundongos com o alelo knock-in pretendido em todos os projetos. a: Número de recém-nascidos/Número de embriões transferidos; b: Número de alelos knock-in portadores de camundongos/número de camundongos examinados; c: não é certo se há um alelo pretendido; d: Número de camundongos portadores do alelo rTG/número de camundongos examinados; rTG: integração aleatória do vetor doador. W/O: sem.

Região cromossômica alvo	Número de					Comprimento floxed (KB)	Comprimento do braço de homologia (kb)
	Embriões		Recém-nascidos	Examinado (desmame)	floxed W/O rTG
	injetado	transferido					5' braço	3' braço
3qC	325	313	93 (29,7%)a	87	9 (10,3%)b	1.3	1.2	1.1
4qB1	210	200	36 (18,0%)a	29	6 (20,7%)b	1.6	1.2	0.9
4qC4	272	256	112 (43,8%)a	100	5 (5,0%)b	2.4	1.0	1.4
5qF	143	137	40 (29,2%)a	40	6 (15,0%)b	1.8	1.0	1.1
5qF	255	227	80 (35,2%)a	76	2 (2,6%)b	1.3	1.1	0.9
9qE3.1	289	261	80 (30,7%)a	77	9 (11,7%)b	1.2	1.2	1.2
10qB3	284	269	88 (32,7%)a	78	3 (3,8%)b	1.3	1.1	0.9
10qC1	243	231	40 (17,3%)a	38	4 (10,5%)b	2.1	1.0	1.3
14qE5	390	372	139 (37,4%)a	135	5 (3,7%)b	1.1	0.8	0.9
17qA3.3	383	374	99 (26,5%)a	95	2 (2,1%)b	2.1	0.6	0.8

Tabela 2: Produção de camundongos floxados por microinjeção. A tabela mostra a taxa de natalidade e a eficiência da produção de camundongos portadores do alelo flox pretendido sem integração aleatória (rTG) do DNA do doador. Foi possível obter camundongos com o alelo flox pretendido em todos os projetos. a: Número de recém-nascidos/número de embriões transferidos; B: Número de camundongos portadores do alelo Flox/número de camundongos examinados. rTG: integração aleatória do vetor doador; W/O: sem.

Discussão

No presente estudo, zigotos frescos (não congelados) de camundongos C57BL/6J, obtidos de acasalamento natural, foram usados para edição do genoma de camundongos. Ao injetar crRNA-tracrRNA-Cas9 e DNA do doador (RNPD) em ambos os pronúcleos desses zigotos em uma fase do ciclo celular em que o knock-in é mais provável de ocorrer, camundongos knock-in e floxed foram gerados com uma alta taxa de natalidade e eficiência suficiente de edição do genoma. O presente estudo fortalece a extensibilidade do método SPRINT-CRISPR¹⁵, onde garante eficiência suficiente de knock-in mesmo no background genético C57BL/6J, e pode ser aplicado à produção de camundongos floxed.

A eletroporação é um método altamente generalizado de produção de camundongos editados pelo genoma devido ao baixo custo dos dispositivos experimentais e à facilidade de aprendizado da técnica⁸. Além disso, o método i-GONAD¹⁹, no qual a edição do genoma é feita com embriões pré-implantacionais existentes no oviduto, não requer um camundongo receptor. Comparado a esses métodos, o presente método aqui apresentado é caro e demorado na preparação e manutenção de um ambiente experimental em termos de hardware e software. No entanto, uma vez que as instalações experimentais são montadas, camundongos complexos de gênico knock-in e floxed podem ser produzidos apenas com elementos CRISPR comercialmente disponíveis (crRNA, tracrRNA e proteína Cas9) e uma quantidade simples e pequena de vetor plasmidial circular para ser usado como DNA do doador. Isso significa que muitas linhagens complexas de camundongos editadas pelo genoma podem ser produzidas sem a necessidade de preparação de vetores de vírus lsODN ^5,6 ou adenoassociados²⁰ demorados (ou relativamente caros).

Ao contrário do método original SPRINT-CRISPR¹⁵, zigotos frescos (congelados-descongelados) foram usados. Na obtenção de zigotos frescos por acasalamento natural, podem ser ignorados os erros técnicos que podem ocorrer durante a fertilização in vitro ou congelamento e descongelamento. Além disso, o processo de manipulação embrionária pode ser concluído em aproximadamente meio dia (Figura 1) seguindo a abordagem atual. Por outro lado, algumas limitações do presente método incluem a exigência de muitos camundongos machos, o controle frouxo do tempo de fertilização e a capacidade limitada de prever completamente o número de zigotos para microinjeção. Em comparação com o método SPRINT-CRISPR original, este método pode ter uma taxa de natalidade mais elevada (Tabela 1). Apesar disso, não se pode concluir que o presente método seja melhor em termos de taxa de natalidade devido às diferenças nos condutores do experimento, genes-alvo, antecedentes genéticos e tempo de confirmação do embrião.

Como mostrado na Tabela 1, um grande número de camundongos na maioria dos projetos de knock-in de genético apresentou alelos de integração aleatória. A integração aleatória deve ser eliminada, pois pode levar à ruptura não intencional de genes endógenos e à expressão ectópica de transgenes. O desafio para o futuro é encontrar condições experimentais que reduzam o número de eventos de integração aleatória, mantendo eficiência suficiente.

Quase toda a edição do genoma do zigoto de camundongo usando efetores de edição do genoma que resultam em quebras de fita dupla do DNA provavelmente induz mutações não intencionais em locais no alvo ^9,21. Os resultados dessas mutações não intencionais no alvo não são descritos aqui porque não estamos em uma situação em que a próxima geração de camundongos possa ser manejada para apresentar evidências claras delas. A melhor maneira de descartar a preocupação de confusão causada por mutagênese não intencional no alvo é obter a próxima geração de camundongos acasalando fundadores com camundongos selvagens em vez de cruzar fundadores. Em princípio, os camundongos N1 resultantes desse cruzamento são selvagens (WT) em um lado do alelo, portanto, se o alelo knock-in pretendido (KI) for detectado, eles são heterozigotos WT/KI. Portanto, a mutagênese no alvo não é um problema crítico no camundongo de laboratório, que tem um ciclo de vida relativamente rápido e é um animal prolífico. No entanto, serão necessárias melhorias adicionais quando esta tecnologia for aplicada a mamíferos relativamente grandes.

Confirmou-se que esta tecnologia pode produzir camundongos knock-in de genético em linhagens diferentes de C57BL/6J, mas um número suficiente de projetos não é assegurado, e os dados são altamente variáveis. Por esse motivo, essa informação não está incluída no presente estudo. Acredita-se que mais estudos sobre este assunto serão necessários para avançar na pesquisa em genética de camundongos e modelos de doenças.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Atipamezole Hydrochloride	ZENOAQ	-
Autoclip Wound Clip	BD	427631
Autoclip Wound Clip Applier	BD	427630
Butorphanol	Meiji Seika Pharma	-
C57BL/6J mice	Jackson Laboratory Japan	-	older than 10 weeks old
Calibrated Pipet, 100ul	Drummond Scientific Company	2-000-100	for collecting zygote and embryo transfer
Cas9	Thermo Fisher Scientific	A36499
Cas9 Nuclease Reaction Buffer	NEB	B7203
CellTram 4r  oil	Eppendorf	5196000030
CRISPOR		http://crispor.tefor.net/	web tool for genome editing experiments with the CRISPR-Cas9 system
crRNA	IDT	-
Gel/PCR Extraction Kit	FastGene	FG-91302
hCG	ASKA Animal Health	-
Hyaluronidase	Merck Sigma-Aldrich	H3884
ICR mice	Jackson Laboratory Japan	-	older than 10 weeks old, weight 28 G or more
Inverted microscope	Leica
KOnezumi		https://www.md.tsukuba.ac.jp/LabAnimalResCNT/KOanimals/konezumi.html	a web application for automating gene disruption strategies to generate knockout mice
M16 medium	Merck Sigma-Aldrich	M7292
M2 medium	Merck Sigma-Aldrich	M7167
Medetomidine	ZENOAQ	-
Micro shears	Natsume Seisakusho	MB-54-1
Microforge	Narishige	MF-900	for fire polishing of holding pipette and bending the microinjection needle
Micromanipulator units	Narishige
Micropipette puller	Sutter Instrument	P-1000	programmable pipette puller
Midazolam	Maruishi Pharmaceutical	-
MILLEX-GV 0.22 µm filter	Merck Millipore	SLGV033R
Mineral oil	Nacalai	26114-75	for zygote culture and injection chamber
Petri dish (35mm, untreated)	Iwaki	1000-035	for zygote culture
PIEZO micromanipulator	PRIME TECH	PMM-150
Plasmid Mini Kit	FastGene	FG-90502	mini prep spin column kit
PMM Operation Liquid	PRIME TECH	KIT-A	operation liquid for microinjection
PMSG	ASKA Animal Health	-
Polyvinylpyrrolidone	Merck Sigma-Aldrich	P5288
RNase	QIAGEN	19101
RNase Free Water	IDT	-	tracrRNA Accessory Reagents
Serrefine clamp	Natsume Seisakusho	C-18
Sodium dodecyl sulfate	SIGMA	151-21-3
Suture needle with thread	Natsume Seisakusho	C11-60B2
Thin wall borosilicate glass without filament	Sutter Instrument	B100-75-10	for microinjection needle and holding pipette
tracrRNA	IDT	-