Количественная оценка антителозависимой клеточной цитотоксичности в модели сфероида опухоли: заявка на разработку лекарственного препарата

Резюме

В этой статье мы представляем метод идентификации соединений, которые модулируют механизм ADCC, важный механизм уничтожения раковых клеток противоопухолевыми антителами. Цитотоксический эффект NK-клеток измеряется в сфероидах клеток рака молочной железы в присутствии трастузумаба. Анализ изображений позволяет идентифицировать живые и мертвые клетки-убийцы и клетки-мишени в сфероидах.

Аннотация

Иммунотерапия на основе моноклональных антител, нацеленная на опухолевые антигены, в настоящее время является основой лечения рака. Одним из клинически значимых механизмов действия антител является антителозависимая клеточная цитотоксичность (ADCC), при которой антитело связывается с раковыми клетками и вовлекает клеточный компонент иммунной системы, например, естественные клетки-киллеры (NK), для уничтожения опухолевых клеток. Эффективность этих методов лечения может быть повышена путем выявления адъювантных соединений, которые повышают чувствительность раковых клеток или эффективность иммунных клеток. Кроме того, необнаруженные лекарственные взаимодействия у онкологических больных, получающих сопутствующие препараты в связи с предыдущими заболеваниями или симптомами, связанными с раком, могут определять успех терапии антителами; Поэтому такие нежелательные лекарственные взаимодействия необходимо устранить. С этими целями мы создали модель ADCC рака и описали здесь простой протокол для поиска ADCC-модулирующих препаратов. Поскольку 3D-модели, такие как сфероиды раковых клеток, превосходят 2D-культуры в прогнозировании in vivo ответов опухолей на противоопухолевую терапию, сфероидные кокультуры EGFP-экспрессирующих HER2+ JIMT-1 клеток рака молочной железы и NK92. Клеточные линии CD16 были созданы и индуцированы трастузумабом, моноклональным антителом, клинически одобренным против HER2-положительного рака молочной железы. Сфероидам JIMT-1 было позволено формироваться в клеточных репеллентных 96-луночных планшетах с U-образным дном. На 3-е сутки добавляли NK-клетки и трастузумаб. Затем сфероиды окрашивали аннексином V-Alexa 647 для измерения апоптотической гибели клеток, которую количественно определяли в периферической зоне сфероидов с помощью автоматизированного микроскопа. Применимость нашего анализа для идентификации ADCC-модулирующих молекул демонстрируется на примере того, что сунитиниб, рецепторный ингибитор тирозинкиназы, одобренный FDA против метастатического рака, почти полностью отменяет ADCC. Генерация сфероидов, а также конвейеры получения и анализа изображений совместимы с высокопроизводительным скринингом ADCC-модулирующих соединений в сфероидах раковых клеток.

Введение

Многоклеточные опухолевые сфероиды (MCTS) представляют собой широко используемые трехмерные (3D) модели, которые формируются из-за тенденции адгезивных клеток к агрегации и представляют собой важный инструмент для получения механистического понимания биологии раковых клеток. Они могут быть получены из широкого спектра типов клеток с помощью многочисленных методов, таких как 3D-культуры на основе жидкости и каркаса¹. Их основное преимущество перед монослойными 2D-моделями заключается в том, что они повторяют основные особенности опухолей in vivo, а именно структурную организацию и гипоксию, имитируя биологическое поведение опухолевых клеток, особенно механизмы, приводящие к терапевтическому бегству^{и лекарственной} устойчивости. Таким образом, поскольку MCTS могут улучшить предсказуемость токсичности и чувствительности к лекарственным препаратам, они широко используются для изучения рака в 3D и могут способствовать разработке эффективных лекарств для различных^{типов рака.}

Для изучения любого заболевания существует острая потребность в актуальных и удобных моделях. Создание моделей для иммунологических исследований рака является сложной задачей, поскольку иммунная система состоит из нескольких типов клеток. Каждый тип клеток имеет несколько подтипов и широкий спектр состояний активации. Эти различные типы иммунных клеток взаимодействуют с раковыми клетками и другими опухолевыми компонентами, в конечном итоге влияя на исход заболевания. Двухмерные методы культивирования клеток in vitro не позволяют повторить эти сложные клеточные взаимодействия, поскольку им не хватает транслятивности, и они не могут предсказать действие лекарственного препарата на системном уровне (например, в тканях)^4,5. Более того, мышиные модели также имеют серьезные ограничения из-за фундаментальных различий между иммунной системой человека и мыши. Таким образом, системы 3D-культивирования могут заполнить существующие пробелы в имеющихся моделях, предоставляя альтернативный метод и улучшая наше понимание иммунологии рака^. В частности, сфероидные модели могут быть использованы для тестирования иммунотерапии, главным образом для оценки эффективности скрининга лекарственных средств и терапевтических антител для усиления инфильтрации иммунных клеток и противоопухолевых эффектов в отношении сфероидных мишеней⁷. Кроме того, потенциал MCTS, состоящего из клеток, находящихся в различных метаболических и пролиферативных состояниях, для изучения взаимодействий между клетками стромы (например, лимфоцитами, макрофагами, фибробластами) и раковыми клетками, а также для разработки новых противоопухолевых стратегий⁸. Следовательно, существует насущная необходимость в подтверждении прогностических и точных платформ для ускорения процесса тестирования лекарственных средств с учетом патофизиологии микроокружения опухоли.

Рак молочной железы (РМЖ) является наиболее частым онкологическим заболеванием, диагностируемым у женщин во всем мире. Клиническая классификация этого гетерогенного заболевания основана на наличии трансмембранных рецепторов, например, рецепторов эстрогена (ER) и прогестерона (PR) (в совокупности называемых рецепторами гормонов, HR), а также на гиперэкспрессии или амплификации белка/онкогена рецептора эпидермального фактора роста человека 2 (HER2). На основании иммуногистохимической экспрессии этих рецепторов обычно выделяют четыре подтипа: люминальный А (HR+/HER2-), люминальный B (HR+/HER2+), HER2-положительный (HR-/HER2+) и трижды негативный рак молочной железы (HR-/HER2-). Группа HER2+ составляет 10-15% случаев РМЖ и характеризуется высокой экспрессией HER2 при отсутствии ЭР и ПР, имеет худший прогноз по сравнению с люминальными опухолями и требует специфических препаратов, направленных против белка HER2/neu⁹.

Развитие РМЖ является многоступенчатым процессом, и ранняя диагностика имеет важное значение для успешного лечения заболевания¹⁰. Однако, несмотря на недавно появившиеся персонализированные варианты лечения РМЖ (например, эндокринная терапия и терапия антителами к HER2), РМЖ продолжает бросать вызов онкологам. Так же, как хирургия, химиотерапия и лучевая терапия, эти персонализированные методы лечения также могут иметь серьезные побочные эффекты, и у пациентов может развиться резистентность к этим препаратам, что делает определение наилучшей^{стратегии в} долгосрочной перспективе сложной ^{задачей.} Следовательно, улучшение понимания взаимодействия между опухолью и ее микроокружением имеет важное значение и, как ожидается, обеспечит новые направления для разработки новых методов лечения, учитывающих специфику различных подтипов РМЖ¹³. Новая волна иммунотерапии, такая как конъюгаты антител, адоптивная Т-клеточная терапия, вакцины и новые моноклональные антитела (мАТ), направленные на HER2, изучается в широкой популяции пациентов с опухолями, экспрессирующими HER2¹⁴.

Трастузумаб, например, представляет собой эффективный метод лечения HER2+ РМЖ. В рамках механизма действия трастузумаб опосредует фрагментарную кристаллизующийся гамма-рецептор (FcγR)-зависимую активность. FcγR отличаются своим сродством к Fc-фрагменту и иммунным ответом, который они инициируют. Активация FcγRIIIa (CD16A) на естественных клетках-киллерах (NK) имеет решающее значение для опосредования антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC), в то время как активация FcγRIIa (CD32A) и FcγRIIIa на макрофагах индуцирует антителозависимый клеточный фагоцитоз (ADCP)¹⁵. Исследования на животных моделях показали, что мыши, у которых отсутствовали рецепторы FcγRI (CD64) и FcγRIII (CD16), не могли инициировать защитный иммунный ответ против опухолеспецифических антигенов, что показало, что ADCC, вероятно, является основным механизмом действия mAb трастузумаба¹⁶.

Поскольку NK-клетки прибегают к связанным с опухолевыми клетками Abs для уничтожения раковых клеток с помощью ADCC, экспрессия Fc-рецепторов имеет решающее значение для эффективного лечения трастузумабом¹⁷ (рис. 1). Кроме того, их действие эффективно уравновешивается стимуляцией активирующих и тормозящих рецепторов, например, иммуноглобулиноподобных рецепторов клеток-киллеров (KIR)¹⁸.

Рисунок 1. Механизм ADCC в контексте противоопухолевого ответа. Рецептор Fcγ естественной клетки-киллера (NK) распознает Fc-участок антитела, который ранее связывался с поверхностным антигеном на раковой клетке. Этот иммунологический синапс приводит к дегрануляции NK-клетки, которая высвобождает цитотоксические медиаторы, такие как гранзимы и перфорин. Эти молекулы способствуют образованию пор в клеточной мембране и активируют апоптотические пути, вызывая запрограммированную гибель клетки-мишени (изображение, созданное с помощью Biorender.com). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Разработка иммунотерапии HER2+ BC представляет собой развивающуюся область. При этом следует учитывать взаимодействия между различными компонентами иммунной системы. Кроме того, в предыдущих публикациях проводилось всестороннее тестирование комбинированной терапии, включающей все виды традиционной, иммунной или клеточной терапии, для выявления синергетических комбинаций¹⁹.

Несколько 3D-моделей HER2+ BC ранее использовались для разработки новых лекарственных препаратов. Например, Балалаева и др. использовали сфероиды SKBR-3, гиперэкспрессирующие HER2, для оценки цитотоксичности HER2-таргетного иммунотоксина 4D5scFv-PE40²⁰. В другом исследовании была создана 3D-система культивирования HER2+ BC на основе Matrigel для измерения роста клеток в ответ на трастузумаб и эндокринные агенты²¹. Эти исследования подчеркивают важность опухолевой сфероидной модели гиперэкспрессии раковых клеток HER2 в представлении эффективной стратегии клинического улучшения терапевтических ответов²².

Наша группа ранее идентифицировала сунитиниб, многоцелевой ингибитор тирозинкиназы, в качестве ингибитора трастузумаб-зависимого ADCC в клетках JIMT-1 HER2+ BC в 2D-культуральном анализе. Исследование показало, что сунитиниб индуцирует аутофагию и нарушает функцию уничтожения NK-клеток, подавляя экспрессию HER2 и усиливая поверхностное прикрепление клеток JIMT-1¹⁷.

Здесь мы создали новую 3D-модель сфероида ADCC (раковые клетки NK.92.CD16+Трастузумаб+JIMT-1-EGFP), которая будет использоваться для высокопроизводительного скрининга, а для подтверждения вышеупомянутых результатов в качестве модельного соединения был использован сунитиниб. Во-первых, мы сгенерировали EGFP, экспрессирующий клетки JIMT-1¹⁷ , и вырастили сфероиды из этих клеток. ADCC индуцировали NK-клетками вместе с трастузумабом, а сфероиды хранили в культуре в присутствии или отсутствии исследуемых соединений в течение 24 ч (рис. 2). Количественная оценка ADCC основана на выявлении апоптотической гибели раковых клеток (окрашивание Annexin V) с помощью системы High-Content Analysis.

Рисунок 2. ADCC в системе кокультивирования 3D сфероидов. Наши экспериментальные установки основаны на 3D-сфероидной системе, которая может более точно моделировать микроокружение in vivo по сравнению с 2D-моделями. Клетки рака молочной железы JIMT-1 EGFP были высеяны на вогнутое клеточное репеллентное дно, чтобы сформировать клеточный кластер круглой формы, называемый сфероидом. Затем был инициирован ADCC путем добавления NK92. CD16 естественные клетки-киллеры (соотношение E:T = 20:1) и моноклональное антитело против HER2, трастузумаб. Экспериментальная модель оказалась эффективной и легко применимой для идентификации ADCC-модифицирующих испытуемых соединений (изображение, полученное с помощью Biorender.com). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Мы продемонстрировали, что получение данных таким образом может быть выполнено в режиме реального времени и является статистически надежным для использования в скрининге с высоким содержанием при разработке лекарств от рака. Важно отметить, что эта модель позволяет проводить расширенную валидацию большего набора соединений и может быть применена к нескольким анализам, представляющим интерес.

протокол

1. Создание модели сфероида JIMT-1-усиленного флуоресцентного белка (EGFP)

1. Чтобы сформировать U-образное дно, отталкивающее клетки, покройте 96-луночную пластину 0,5% раствором агарозы-PBS (30 мкл/лунка). Инкубируйте планшет при комнатной температуре примерно 30-45 мин.
2. Промыть клетки JIMT-1-EGFP дважды 2 мл стерильного PBS (о генерации клеточной линии JIMT1-EGFP сообщалось в предыдущей публикации¹⁷). Для культивирования клеток используют колбы для тканевых культур T25 и среду JIMT-1 (среда DMEM/F-12 с добавлением 20% фетальной бычьей сыворотки (FBS), инсулина в дозе 0,3 ед/мл (100 МЕ/мл, Хумулин R) и 1% пенициллина-стрептомицина).
3. Добавьте в колбу 2 мл трипсина-ЭДТА и инкубируйте в течение 10 мин в инкубаторе_СО2 .
4. Коснитесь колбы, чтобы проверить, отделились ли клетки JIMT-1 после инкубационного времени.
5. Используйте 2 мл среды JIMT-1, чтобы остановить пищеварение, и соберите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл.
6. Подсчитайте количество клеток в камере Бюркера с 0,4% трипановым синим (80 мкл красителя + 20 мкл клеточной суспензии) и отрегулируйте количество клеток до 20 000 клеток/мл.
7. Пипетку 100 мкл клеточной суспензии (2000 клеток/лунку) в каждую лунку 96-луночного планшета (предварительно покрытого 0,5% раствором агарозы-PBS, как указано в 1.1).
8. Дайте клеткам слипаться в течение 3-дневного инкубационного периода при 37 °C в инкубаторе_CO2 .
9. Регулярно проверяйте размер и форму сфероидов с помощью инвертированного микроскопа.

2. Покрытие пластины HCS

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить прикрепление сфероидов JIMT-1-EGFP к стеклянной поверхности пластины, покрытие пластины с высоким содержанием (HCS) имеет решающее значение (в противном случае анализ с высоким содержанием был бы невозможен).

1. На 3-й день после индукции сфероидов покройте 96-луночный скрининговый планшет с высоким содержанием Pluronic-F127 (0,5% в ДМСО, 50 мкл/лунка) и инкубируйте планшет в течение 45 мин при комнатной температуре.
2. Отсасывайте раствор для покрытия и дважды промывают лунки свободной средой DMEM/F-12 (100 мкл/лунка).

3. Перенос сфероидов на пластину HCS

1. С помощью пипетки объемом 1 мл перенесите сфероиды в трех экземплярах на 96-луночную пластину HCS со стеклянным дном.

4. Предварительная обработка сфероидов JIMT-1 EGFP исследуемыми соединениями

1. Добавьте испытуемое соединение (например, сунитиниб, разбавленный в ДМСО в концентрации 40 мкМ) путем пипетирования 10 мкл/лунку и добавьте 10 мкл свежей среды JIMT-1 в контрольные лунки (CTL).
2. Инкубируют планшет в течение 1 ч в инкубаторе_СО2 при температуре 37 °C.

5. Индукция ADCC путем добавления эффекторных клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки CD16.176V.NK92 (далее именуемые NK-клетки) культивировали в α-MEM с добавлением 20% FBS, 1% MEM-NEAA, 1% Na-пирувата, 1% глутамина, 1% пенициллина-стрептомицина и 100 МЕ/мл IL-2.

1. Соберите NK-клетки в колбе в пробирку объемом 15 мл. Подсчитайте клетки с трипановым синим (80 мкл красителя + 20 мкл клеточной суспензии) и отрегулируйте плотность клеток до соотношения эффектор-мишень (E:T) 20:1 (40 000 NK-клеток/лунка).
2. Окрасьте NK-клетки 10 мкМ Cell Tracker Blue (CTB, 1 мкл в 1 мл среды α-MEM NK) и поместите их в инкубатор CO₂ при 37 °C на 1 ч.
3. Центрифугируют NK-клетки при 150 х г в течение 3 мин при комнатной температуре дважды, чтобы смыть излишки красителя 1 мл среды α-MEM.
4. Ресуспендант гранулы NK-клеток в 1 мл свежей среды JIMT-1.
5. Добавляют окрашенные NK-клетки вместе с антителом к HER2 (Ab) (трастузумаб, растворенный в стерильном дистиллированном_H2O) к целевым сфероидам JIMT-1 путем пипетирования 55 мкл/лунку NK-клеток, окрашенных CTB, и 55 мкл/лунку 10 мкг/мл Ab в среде JIMT-1 (общий объем обработки, добавленной для ADCC, составляет 110 мкл/лунку, а конечная концентрация сунитиниба составляет 20 мкМ).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для выбора концентрации Ab и соотношения E:T мы опирались на нашу предыдущую публикацию¹⁷. Предварительные эксперименты были проведены с различными соотношениями E:T и концентрациями трастузумаба, чтобы оценить, какой из них является наиболее эффективным в индуцировании ADCC в сфероидах (дополнительный рисунок S1).
6. Добавьте 110 мкл/лунку свежей среды JIMT-1 в контрольные лунки (CTL).
7. Инкубируйте планшет в течение 24 ч в инкубаторе CO₂ при температуре 37 °C.
   Примечание: Поскольку известно, что клетки NK92 выполняют неспецифические цитотоксические функции, для контроля используют клетки JIMT-1, инкубированные как с NK-клетками в отдельности, так и с контролем изотипа или F(ab'₎₂ Ab. Здесь F(ab'₎2-трастузумаб (TR-F(ab'₎₂) использовали в качестве отрицательного CTL. Фрагмент TR-F(ab'₎₂ готовили, как сообщают Tóth et ^al.19 , и добавляли в том же объеме, что и трастузумаб, вместе с NK-клетками, как описано в 5.5. Концентрацию доводили до 6,6 мкг/мл, что соответствует эквимолярной концентрации при применении трастузумаба²³.

6. Аннексин В-647 для окрашивания сфероидов

1. Для измерения апоптотической гибели клеток сфероиды окрашивают конъюгатом Annexin V-Alexa Fluor 647 в течение 1 ч в среде JIMT-1 (1:100) путем пипетирования 50 мкл/лунка.

7. Визуализация

ПРИМЕЧАНИЕ: Пластина визуализируется через 24 ч после добавления NK-эффекторных клеток к клеткам-мишеням. Для визуализации используется анализатор высокого содержания и программное обеспечение для анализа изображений.

1. Выберите тип микропластины из списка пластин с помощью параметра «Тип пластины ». Используйте 96-луночный экранирующий планшет с высоким содержанием (HCS).
2. Выберите автофокусировку Two Peak, так как анализ проводится на планшетах с 10-кратным объективом с числовой апертурой 0,3 (NA) с использованием опций Autofocus и Objective соответственно. Выберите конфокальный режим с опцией Opt. Mode и примените Биннинг 2 с помощью параметра Биннинг .
3. Для получения изображений сфероидов выберите соответствующие каналы с помощью параметра «Выбор канала ». Для детектирования EGFP-трансдуцированных клеток JIMT-1 выберите EGFP (время интеграции 200 мс, мощность лазера 50%, высота стека 2,0 мкм; например: 488 нм em: 500-550 нм), а для обнаружения апоптотических клеток используйте Alexa 647 (время интеграции 100 мс, мощность лазера 50%, высота стека 10,0 мкм; например: 640 нм em: 650-760 нм). Для визуализации NK-клеток внутри сфероидов выберите следующий канал: DAPI (время интегрирования 100 мс, мощность лазера 50%, высота стека 2,0 мкм; например: 405 нм em: 435-480 нм).
4. В опции Layout Selection выберите Z-стеки, так как ячейки в сфероидах имеют тенденцию находиться в разных фокальных плоскостях микроскопа. 10 плоскостей (с расстоянием 10 мкм) достаточно, чтобы покрыть всю область сфероида. Установите значения первой и последней плоскостей на 0 мкм и 90 мкм соответственно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом измерения можно сделать снимки образцов с помощью функции моментального снимка, чтобы проверить правильность настроек.
5. Задайте количество лунок и полей для визуализации с помощью параметра Определить компоновку .

8. Анализ высокого содержания (HCA)

ПРИМЕЧАНИЕ: Проанализируйте изображения с помощью программного обеспечения Harmony или экспортируйте изображения для анализа с помощью предпочтительного стороннего программного обеспечения. Для анализа эффективности ADCC измеряется интенсивность флуоресценции Annexin V 647. Клетки-мишени, убитые ADCC, появляются в периферической области сфероидов. Поэтому в этом сфероидном «кольце» измеряются положительные клетки Аннексина V. Для валидации этого метода был проведен анализ с различными параметрами, чтобы оценить, какой из них является наиболее надежным и дает наилучшие результаты (дополнительный рисунок S2). На видео показана скважина ADCC, чтобы продемонстрировать пошаговый процесс анализа изображений.

1. Идентификация сфероидов по флуоресценции EGFP клеток JIMT-1 с помощью опции Find Texture Regions и фильтрация по размеру (> 25 000 мкм2).
2. Удаление объектов границ с помощью параметра Выбрать население .
3. Поскольку на периферии сфероидов появляются положительные (апоптотические) клетки Annexin V, измерьте интенсивность Аннексина в этом апоптотическом «кольце», выбранном опцией Select Region (внешняя граница -90%), чтобы определить гибель апоптотических клеток.
4. Выразите значения интенсивности Annexin V как среднюю интенсивность.

Результаты

Были получены EGFP, экспрессирующие клетки JIMT-1, и из этих клеток были выращены сфероиды. В качестве тестового соединения использовали сунитиниб, так как ранее было показано, что он влияет на течение ADCC¹⁷. Сфероидам было позволено слипаться в течение 72 ч. На 3-е сутки к сфероидам ...

Обсуждение

Несмотря на значительные улучшения в лечении РМЖ за последние несколько десятилетий, у пациентов по-прежнему регулярно развивается лекарственная устойчивость или возникают негативные^{побочные} эффекты. Высокая заболеваемость и смертность, связанные с РМЖ, требуют продол?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well glass bottom Cell Carrier Ultra microplates	PerkinElmer, Waltham, MA, USA	LLC 6055302	for spheroids measurements
96-well tissue culture plates	TPP	92096	for cell seeding
α-MEM medium	Sigma	M8042	in NK medium
Agarose	Sigma	A9539	for spheroids seeding
Annexin V-Alexa Fluo 647 conjugate	Invitrogen-ThermoFisher Scientific	A23204	for apoptosis measurement with HCS
CD16.176 V.NK-92 cells	Dr. Kerry S. Campbell (the Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, PA on behalf of Brink Biologics, Inc. San Diego, CA)	ATCC CRL-2407	for cell culture
Cell Tracker Blue	Invitrogen-Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)	C2110	for staining of NK cells
DMEM/F-12 medium	Sigma	D8437	in JIMT1-EGFP medium
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418	for coating HCS plate before transfering the spheroids
Fetal bovine serum (FBS)	Biosera	FB-1090/500	JIMT-1-EGFP and NK medium
Glutamine	Gibco	35,050–061	in NK medium
GraphPad Prism 8.0.1	GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA		for statistical analysis
Harmony software	PerkinElmer, Waltham, MA, USA		for HCA
IL-2	Proleukin, Novartis Hungária Kft., Budapest, Hungary	PHC0026	in NK medium
Insulin (Humulin R)	Eli Lilly	HI0219	JIMT-1-EGFP medium
JIMT-1 breast cancer cells			for cell culture
MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA)	Gibco	11,140–050	in NK medium
Na-pyruvate	Lonza	BE13-115E	in NK medium
Opera Phenix High-Content Analysis equipment	PerkinElmer, Waltham, MA, USA	HH14001000	for HCA
PBS (Posphate buffered saline)	Lonza	BE17-517Q	for washing the cells
Penicillin-Streptomycin	Biosera	LM-A4118	JIMT-1-EGFP and NK medium
pLP-1, pLP-2, pLP-VSV-G, pWOXEGFP	Invitrogen, (Prof. József Tzsér, University of Debrecen)		for JIMT-1-EGFP cell line
Pluronic-F127	Sigma	P2443	for coating HCS plate before transfering the spheroids
Sunitinib malate	SigmaAldrich	PZ0012	for treatments
Trastuzumab Ab (humanized anti-HER2 monoclonal antibody)	Herzuma®, EGIS Pharmaceuticals, Budapest, Hungary	NDC-63459-303-43	for treatments
Trastuzumab-F(ab')2	Gift from Prof. György Vereb and Árpád Ször	Department of Biophysics and Cell Biology, University of Debrecen	for treatments
Trypan blue 0.4% solution	Sigma	T8154	for cell counting
Trypsin-EDTA 1X in PBS	Biosera	LM-T1706	for cells detachment