종양 스페로이드 모델에서 항체 의존성 세포 독성 정량화: 약물 발견을 위한 응용

요약

여기에서는 항종양 항체의 중요한 암세포 사멸 기전인 ADCC 기전을 조절하는 화합물을 확인하는 방법을 제시합니다. NK 세포의 세포독성 효과는 트라스투주맙이 있는 유방암 세포 스페로이드에서 측정됩니다. 이미지 분석은 스페로이드에서 살아있는 킬러와 죽은 킬러와 표적 세포를 식별합니다.

초록

종양 항원을 표적으로 하는 단클론 항체 기반 면역 요법은 현재 암 치료의 중심입니다. 항체의 임상적으로 관련된 작용 기전 중 하나는 항체 의존성 세포 독성(ADCC)으로, 항체가 암세포에 결합하고 면역 체계의 세포 구성 요소(예: 자연 살해(NK) 세포)와 결합하여 종양 세포를 죽입니다. 이러한 치료법의 효과는 암세포의 민감도 또는 면역 세포의 효능을 증가시키는 보조 화합물을 식별함으로써 향상될 수 있습니다. 또한, 이전 질환 또는 암 관련 증상에 대해 병용투여한 암 환자에서 발견되지 않은 약물 상호작용이 항체 치료의 성공을 결정할 수 있습니다. 따라서 이러한 원치 않는 약물 상호 작용을 제거해야 합니다. 이러한 목표를 염두에 두고 암 ADCC 모델을 만들었으며 ADCC 조절 약물을 찾기 위한 간단한 프로토콜을 설명합니다. 암세포 스페로이드와 같은 3D 모델은 항암 치료에 대한 종양의 in vivo 반응을 예측하는 데 있어 2D 배양보다 우수하기 때문에 EGFP 발현 HER2+ JIMT-1 유방암 세포와 NK92의 스페로이드 공동 배양. CD16 세포주를 설정하고 HER2 양성 유방암에 대해 임상적으로 승인된 단일클론 항체인 트라스투주맙(Trastuzumab)으로 유도했습니다. JIMT-1 스페로이드는 세포 발수성 U-바닥 96웰 플레이트에서 형성되도록 허용되었습니다. 3일째에는 NK세포와 트라스투주맙을 추가하였다. 그런 다음 스페로이드를 Annexin V-Alexa 647로 염색하여 자가사멸 세포 사멸을 측정하고, 자동 현미경으로 스페로이드의 주변 영역에서 정량화했습니다. ADCC 조절 분자를 식별하기 위한 분석의 적용 가능성은 전이성 암에 대해 FDA가 승인한 수용체 티로신 키나아제 억제제인 Sunitinib이 ADCC를 거의 완전히 폐지한다는 것을 보여줌으로써 입증되었습니다. 스페로이드 생성과 이미지 획득 및 분석 파이프라인은 암세포 스페로이드의 ADCC 조절 화합물에 대한 고처리량 스크리닝과 호환됩니다.

서문

다세포 종양 스페로이드(MCTS)는 부착 세포가 응집하는 경향으로 인해 형성되는 널리 사용되는 3차원(3D) 모델로, 암세포 생물학에 대한 기계론적 통찰력을 얻기 위한 중요한 도구입니다. 액체 기반 및 스캐폴드 기반 3D 배양과 같은 다양한 기술을 통해 광범위한 세포 유형에서 생성할 수 있습니다¹. 단층 2D 모델에 비해 가장 큰 장점은 종양 세포의 생물학적 거동, 특히 치료 탈출 및 약물 내성으로 이어지는 메커니즘을 모방하여 생체 내 종양의 주요 특징, 즉 구조적 조직 및 저산소증을 요약한다는 것입니다². 따라서 MCTS는 독성 및 약물 감수성의 예측 가능성을 향상시킬 수 있기 때문에 3D에서 암을 연구하는 데 널리 사용되며 다양한 유형의 암에 대한 효과적인 약물 개발을 향상시킬 수 있습니다³.

모든 질병을 연구하려면 관련성 있고 편리한 모델이 매우 필요합니다. 암 면역학 연구를 위한 모델을 설정하는 것은 면역 체계가 여러 세포 유형으로 구성되어 있기 때문에 어렵습니다. 각 세포 유형에는 여러 하위 유형과 광범위한 활성화 상태가 있습니다. 이러한 다양한 면역 세포 유형은 암세포 및 기타 종양 구성 요소와 상호 작용하여 궁극적으로 질병의 결과에 영향을 미칩니다. 2D in vitro 세포 배양 방법은 번역성이 부족하고 시스템 수준(예: 조직)에서 약물의 작용을 예측할 수 없기 때문에 이러한 복잡한 세포 상호 작용을 재현하지 못합니다^4,5. 더욱이 마우스 모델은 인간과 쥐의 면역 체계 사이의 근본적인 차이로 인해 심각한 한계를 가지고 있습니다. 따라서 3D 배양 시스템은 현재 사용 가능한 모델의 격차를 메우고 대체 방법을 제공하고 암 면역학에 대한 이해를 향상시킬 수 있습니다⁶. 구체적으로, 스페로이드 모델은 면역요법을 시험하는 데 사용될 수 있는데, 이는 주로 스페로이드 표적에 대한 면역세포 침윤 및 항종양 효과를 향상시키기 위한 약물 스크리닝 및 치료용 항체의 효율성을 평가하기 위한 것이다⁷. 또한, 기질 세포(예: 림프구, 대식세포, 섬유아세포)와 암세포 간의 상호작용을 연구하고 새로운 항암 전략을 개발하기 위한 다양한 대사 및 증식 상태의 세포로 구성된 MCTS의 잠재력은 충분히 입증되었습니다⁸. 따라서 종양 미세환경의 병태생리학을 고려하여 약물 테스트 프로세스를 강화하기 위해 예측 가능하고 정확한 플랫폼을 확증할 필요가 있습니다.

유방암(BC)은 전 세계적으로 여성에게 가장 많이 진단되는 암입니다. 이 이종 질환의 임상적 분류는 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2) 단백질/종양유전자의 과발현 또는 증폭과 함께 에스트로겐(ER) 및 프로게스테론(PR) 수용체(총칭하여 호르몬 수용체, HR라고 함)와 같은 막관통 수용체의 존재를 기반으로 합니다. 이러한 수용체의 면역조직화학적 발현에 기초하여 일반적으로 루미날 A(HR+/HER2-), 루미날 B(HR+/HER2+), HER2 양성(HR-/HER2+) 및 삼중음성 유방암(HR-/HER2-)의 4가지 아형이 인식됩니다. HER2+ 그룹은 BC 증례의 10-15%를 차지하며, ER 및 PR이 없는 상태에서 HER2 발현이 높고, 내강 종양에 비해 예후가 나쁘며, HER2/neu 단백질에 대한 특정 약물이 필요한 것이 특징이다⁹.

BC 발달은 다단계 과정이며, 질병의 성공적인 치료를 위해서는 조기 진단이 필수적이다¹⁰. 그러나 최근 등장한 맞춤형 BC 치료 옵션(예: 내분비 및 항-HER2 항체 요법)에도 불구하고 BC는 계속해서 종양학자들에게 도전 과제를 안겨주고 있습니다. 수술, 화학요법 및 방사선 요법과 마찬가지로 이러한 맞춤형 치료법도 심각한 부작용을 일으킬 수 있으며 환자는 이러한 약제에 대한 내성을 갖게 될 수 있으므로 최상의 전략을 결정하는 것이 장기적으로 어려운 과제가 될 수 있다^11,12. 따라서, 종양과 미세환경 사이의 상호작용에 대한 이해의 향상이 필수적이며, 다양한 BC 아형의 특이성을 고려한 새로운 치료법의 개발을 위한 새로운 방향을 제공할 것으로 기대된다¹³. 항체 약물 접합체, 입양 T 세포 치료제, 백신 및 새로운 HER2 지향 단클론 항체(mAb)와 같은 새로운 면역 요법이 HER2 발현 종양이 있는 광범위한 환자 집단에서 연구되고 있다¹⁴.

예를 들어, 트라스투주맙(Trastuzumab)은 HER2+ BC에 대한 효율적인 치료 방식을 나타냅니다. 작용 방식의 일환으로 트라스투주맙은 단편 결정화 가능한 감마 수용체(FcγR) 의존성 활성을 매개합니다. FcγR은 Fc 분절에 대한 친화력과 이들이 개시하는 면역 반응으로 구별됩니다. 자연살해(NK) 세포에서 FcγRIIIa(CD16A)를 활성화하는 것은 항체 의존성 세포 독성(ADCC)을 매개하는 데 중요하며, 대식세포에서 FcγRIIa(CD32A) 및 FcγRIIIa를 유발하면 항체 의존성 세포 식균작용(ADCP)을 유도합니다¹⁵. 동물 모델에 대한 연구에 따르면 FcγRI(CD64) 및 FcγRIII(CD16) 수용체가 결핍된 마우스는 종양 특이적 항원에 대한 보호 면역 반응을 시작할 수 없었으며, 이는 ADCC가 mAb Trastuzumab¹⁶의 주요 작용 기전일 가능성이 있음을 보여주었습니다.

NK 세포는 ADCC에 의한 암세포 사멸을 위해 종양 세포 결합 Abs에 의존하기 때문에 Fc 수용체의 발현은 Trastuzumab¹⁷ 의 효율적인 치료에 매우 중요합니다(그림 1). 더욱이, 이들의 작용은 활성화 및 억제 수용체, 예를 들어, 킬러 세포 면역글로불린 유사(KIR) 수용체(¹⁸)의 자극에 의해 효율적으로 균형을 이룬다.

그림 1. 항종양 반응의 맥락에서 ADCC의 메커니즘. 자연살해(NK) 세포의 Fcγ 수용체는 이전에 암세포의 표면 항원에 결합했던 항체의 Fc 영역을 인식합니다. 이 면역학적 시냅스는 NK 세포의 탈과립화로 이어지고, NK 세포는 그랜자임(granzymes)과 퍼포린(perforin)과 같은 세포독성 매개체를 방출합니다. 이 분자는 세포막의 기공 형성에 기여하고 세포 사멸 경로를 활성화하여 표적 세포의 프로그램된 세포 사멸을 유발합니다( Biorender.com 로 생성된 이미지). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

HER2+ BC에 대한 면역 요법 개발은 진화하는 분야입니다. 이 경우 면역 체계의 다양한 구성 요소 간의 상호 작용을 고려해야 합니다. 또한, 이전 간행물에서는 시너지 효과를 내는 조합을 확인하기 위해 모든 유형의 전통적 치료법, 면역 요법 또는 세포 치료법을 포함하는 병용 요법을 광범위하게 테스트했다¹⁹.

HER2+ BC의 여러 3D 모델은 이전에 신약 개발에 사용되었습니다. 예를 들어, Balalaeva 등은 HER2를 과발현하는 SKBR-3 스페로이드를 사용하여 HER2 표적 면역독소 4D5scFv-PE40의 세포 독성을 평가했습니다²⁰. 또 다른 연구에서는 트라스투주맙 및 내분비제에 대한 반응으로 세포 성장을 측정하기 위해 3D Matrigel 기반 HER2+ BC 배양 시스템을 구축했습니다²¹. 이러한 연구는 치료 반응을 임상적으로 개선하기 위한 효과적인 전략을 나타내는 데 있어 암세포를 과발현하는 HER2의 종양 스페로이드 모델의 중요성을 강조합니다²².

우리 그룹은 이전에 2D 배양 분석에서 JIMT-1 HER2+ BC 세포에서 트라스투주맙 의존성 ADCC의 억제제로 다중표적 티로신 키나아제 억제제인 Sunitinib을 확인했습니다. 이 연구는 수니티닙이 자가포식을 유도하고 NK 세포 사멸 기능을 손상시켜 HER2 발현을 하향 조절하고 JIMT-1 세포의 표면 부착을 향상시킨다는 것을 밝혔다¹⁷.

여기에서 우리는 고처리량 스크리닝 응용 분야에 사용할 새로운 3D 스페로이드 ADCC 모델(NK.92.CD16+Trastuzumab+JIMT-1-EGFP 암세포)을 확립했으며, 위에서 언급한 결과를 검증하기 위해 Sunitinib을 모델 화합물로 사용했습니다. 먼저, JIMT-1 세포를 발현하는 EGFP를 생성하고,^이들 세포로부터 스페로이드를 성장시켰다. ADCC는 트라스투주맙과 함께 NK 세포에 의해 유도되었으며, 스페로이드는 시험 화합물의 유무에 관계없이 24시간 동안 배양된 상태로 유지되었습니다(그림 2). ADCC의 정량화는 High-Content Analysis 시스템을 사용한 자가사멸 암세포 사멸(Annexin V 염색) 검출을 기반으로 합니다.

그림 2. 3D 스페로이드 공동 배양 시스템의 ADCC. 당사의 실험 설정은 2D 모델에 비해 생체 내 미세환경을 더 정확하게 모델링할 수 있는 3D 스페로이드 시스템을 기반으로 합니다. JIMT-1 EGFP 유방암 세포를 오목한 세포 퇴치제 바닥에 파종하여 스페로이드라고 하는 둥근 모양의 세포 클러스터를 형성했습니다. 그런 다음 NK92를 추가하여 ADCC를 시작했습니다. CD16 자연살해세포(E:T 비율 = 20:1) 및 항-HER2 단클론 항체인 트라스투주맙. 실험 모델은 ADCC 변형 테스트 화합물( Biorender.com 로 생성된 이미지)의 식별에 효율적이고 쉽게 적용할 수 있는 것으로 입증되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

우리는 이러한 방식으로 데이터를 수집할 수 있으며 암 약물 발견에서 high-content 스크리닝에 사용하기 위해 통계적으로 견고하다는 것을 입증했습니다. 중요한 것은 이 모델을 사용하면 더 큰 화합물 세트에 대한 확장된 검증이 가능하며 관심 있는 여러 분석에 적용할 수 있다는 것입니다.

프로토콜

1. JIMT-1-강화 형광 단백질(EGFP) 스페로이드 모델 설정

1. U자형 세포 발수성 바닥을 형성하려면 96웰 플레이트를 0.5% 아가로스-PBS 용액(30μL/웰)으로 코팅합니다. 플레이트를 실온에서 약 30-45분 동안 배양합니다.
2. JIMT-1-EGFP 세포를 2mL의 멸균 PBS로 2회 세척합니다(JIMT1-EGFP 세포주의 생성은 이전 간행물¹⁷에서 보고됨). 세포 배양을 위해 T25 조직 배양 플라스크 및 JIMT-1 배지(20% 소 태아 혈청(FBS), 0.3U/mL 인슐린(100IU/mL, Humulin R) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM/F-12 배지)를 사용합니다.
3. 플라스크에 트립신-EDTA 2mL를 넣고_CO2 인큐베이터에서 10분 동안 배양합니다.
4. 플라스크를 탭하여 배양 시간 후에 JIMT-1 세포가 분리되었는지 확인합니다.
5. 2mL의 JIMT-1 배지를 사용하여 분해를 중지하고 세포 현탁액을 15mL 튜브에 수집합니다.
6. 0.4% 트리판 블루(염료 80μL + 세포 현탁액 20μL)로 Bürker 챔버에서 세포를 계수하고 세포 수를 20,000세포/mL로 조정합니다.
7. 셀 현탁액(2000 cells/well)의 100μL를 96웰 플레이트의 각 웰에 피펫팅합니다(1.1에 표시된 대로 0.5% 아가로스-PBS 용액으로 사전 코팅됨).
8. CO3 인큐베이터에서 37°C에서 2일 동안 배양 기간 동안 세포가 뭉치도록 합니다.
9. 도립 현미경으로 스페로이드의 크기와 모양을 정기적으로 확인하십시오.

2. HCS 플레이트의 코팅

참고: JIMT-1-EGFP 스페로이드가 플레이트의 유리 표면에 부착되는 것을 방지하려면 HCS(High-Content Screening) 플레이트를 코팅하는 것이 중요합니다(그렇지 않으면 High-Content 분석이 불가능함).

1. 스페로이드 유도 후 3일째에 96웰 고함량 스크리닝 플레이트에 Pluronic-F127(DMSO에서 0.5%, 50μL/웰)을 코팅하고 플레이트를 실온에서 45분 동안 배양합니다.
2. 코팅 용액을 흡인하고 DMEM/F-12-무혈청 배지(100μL/well)로 웰을 두 번 세척합니다.

3. HCS 플레이트로 스페로이드 이송

1. 1mL 피펫을 사용하여 스페로이드를 유리 바닥 96웰 HCS 플레이트에 세 번 옮깁니다.

4. JIMT-1 EGFP 스페로이드를 시험 화합물로 전처리

1. 10μL/웰을 피펫팅하여 테스트 화합물(예: 40μM 농도로 DMSO에 희석된 Sunitinib)을 추가하고 대조군(CTL) 웰에 10μL의 신선한 JIMT-1 배지를 추가합니다.
2. 플레이트를 37°C의 CO₂ 인큐베이터에서 1시간 동안 배양합니다.

5. effector cell을 추가하여 ADCC 유도

참고: CD16.176V.NK92 세포(이하 NK 세포라고 함)는 20% FBS, 1% MEM-NEAA, 1% Na-피루브산, 1% 글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 100IU/mL의 IL-2가 보충된 α-MEM에서 배양되었습니다.

1. 플라스크의 NK 세포를 15mL 튜브에 모읍니다. 트리판 블루(염료 80μL + 세포 현탁액 20μL)로 세포를 계수하고 세포 밀도를 20:1 이펙터 대 표적(E:T) 비율(40,000 NK 세포/웰)로 조정합니다.
2. 10μM Cell Tracker Blue(CTB, α-MEM NK 배지 1mL에 1μL)로 NK 세포를 염색하고 37°C의 CO₂ 인큐베이터에 1시간 동안 넣습니다.
3. NK 세포를 실온에서 150 x g 에서 3분 동안 2회 원심분리하여 1mL의 α-MEM 배지로 과잉 염료를 세척합니다.
4. NK 세포 펠릿을 1mL의 신선한 JIMT-1 배지에 재현탁시킵니다.
5. JIMT-1 배지에서 CTB 염색 NK 세포 55μL/웰 및 10μg/mL Ab 55μL/웰을 피펫팅하여 항-HER2 항체(Ab)(트라스투주맙, 멸균 증류 H_2O에 용해됨)와 함께 염색된 NK 세포를 표적 JIMT-1 스페로이드에 추가합니다(ADCC에 추가된 처리의 총 부피는 110μL/웰이고 최종 수니티닙 농도는 20μM).
   참고: Ab 농도 및 E:T 비율의 선택을 위해 이전 간행물¹⁷에 의존했습니다. 스페로이드에서 ADCC를 유도하는 데 가장 효과적인 것을 평가하기 위해 Trastuzumab의 다양한 E:T 비율과 농도로 예비 실험을 수행했습니다(보충 그림 S1).
6. 110μL/웰의 신선한 JIMT-1 배지를 대조군(CTL) 웰에 추가합니다.
7. 37°C의 CO₂ 인큐베이터에서 24시간 동안 플레이트를 배양합니다.
   참고: NK92 세포는 비특이적 세포독성 기능을 발휘하는 것으로 알려져 있으므로 대조군의 경우 JIMT-1 세포를 NK 세포 단독으로 또는 동형 대조군 또는 F(ab')₂ Ab와 함께 공동 배양합니다. 여기서, F(ab')₂-트라스투주맙(TR-F(ab')₂)을 음성 CTL로 사용하였다. TR-F(ab')₂ 단편은 Tóth et ^al.19 에 의해 보고된 바와 같이 제조되었으며, 5.5에 기술된 바와 같이 NK 세포와 함께 Trastuzumab과 동일한 부피로 첨가되었습니다. 농도는 Trastuzumab²³으로 등몰 농도에 해당하는 6.6μg/mL로 조정되었습니다.

6. 스페로이드의 Annexin V-647 염색

1. 자가사멸 세포 사멸을 측정하려면 50μL/웰을 피펫팅하여 JIMT-1 배지(1:100)에서 1시간 동안 Annexin V-Alexa Fluor 647 conjugate로 스페로이드를 염색합니다.

7. 이미징

참고: 플레이트는 NK effector cell을 target cell에 추가한 후 24시간 후에 촬영됩니다. 이미징에는 High-Content Analyzer와 이미지 분석 소프트웨어가 사용됩니다.

1. 플레이트 유형(Plate Type) 옵션을 사용하여 플레이트 목록에서 마이크로플레이트 유형을 선택합니다. 96웰 HCS(High-Content Screening) 플레이트를 사용하십시오.
2. 각각 Autofocus 및 Objective 옵션을 사용하여 0.3개의 개구수(NA)를 가진 10x 대물렌즈가 있는 플레이트에서 분석이 수행되므로 Two Peak 자동 초점을 선택합니다. 옵션 모드(Opt. Mode) 옵션을 사용하여 공초점 모드를 선택하고 비닝(Binning) 옵션을 사용하여 비닝 2(Binning 2)를 적용합니다.
3. 스페로이드를 이미징하려면 Channel Selection 옵션을 사용하여 적절한 채널을 선택합니다. EGFP transduced JIMT-1 세포를 검출하려면 EGFP(통합 시간 200ms, 레이저 출력 50%, 스택 높이 2.0μm, 예: 488nm em: 500-550nm)를 선택하고 자가사멸 세포를 검출하려면 Alexa 647(통합 시간 100ms, 레이저 출력 50%, 스택 높이 10.0μm, 예: 640nm em: 650-760nm)을 선택합니다. 스페로이드 내의 NK 세포를 시각화하려면 DAPI(통합 시간 100ms, 레이저 출력 50%, 스택 높이 2.0μm, 예: 405nm em: 435-480nm) 채널을 선택합니다.
4. Layout Selection 옵션에서 스페로이드의 세포가 현미경의 다른 초점면에 있는 경향이 있으므로 Z-stack을 선택합니다. 10개의 평면(거리 10μm)은 전체 스페로이드 영역을 덮기에 충분합니다. 첫 번째 평면과 마지막 평면의 값을 각각 0μm와 90μm로 설정합니다.
   알림: 측정을 시작하기 전에amp올바른 설정을 확인하기 위해 스냅샷 기능으로 이미지를 촬영할 수 있습니다.
5. Define Layout 옵션을 사용하여 이미징을 위한 웰과 필드의 개수를 설정합니다.

8. 고함량 분석(HCA)

알림: Harmony 소프트웨어로 이미지를 분석하거나 선호하는 타사 소프트웨어를 사용하여 분석을 위해 이미지를 내보냅니다. ADCC 효율 분석을 위해 Annexin V 647의 형광 강도를 측정합니다. ADCC에 의해 사멸된 표적 세포는 스페로이드의 주변 영역에 나타납니다. 따라서 Annexin V 양성 세포는 이 스페로이드 "고리"에서 측정됩니다. 이 방법을 검증하기 위해 어떤 것이 가장 신뢰할 수 있고 최상의 결과를 산출하는지 평가하기 위해 다양한 매개변수로 분석을 수행했습니다(보충 그림 S2). 이미지 분석 프로세스를 단계별로 시연하기 위해 ADCC 웰이 비디오에 나와 있습니다.

1. Find Texture Regions 옵션을 사용하여 JIMT-1 세포의 EGFP 형광으로 스페로이드를 식별하고 크기별로 필터링합니다(> 25,000μm²).
2. Select Population 옵션으로 경계 객체를 제거합니다.
3. Annexin V 양성(자가사멸) 세포는 스페로이드의 주변부에 나타나기 때문에 자가사멸 세포 사멸을 결정하기 위해 영역 선택 옵션(외부 테두리 -90%)으로 선택한 이 자가사멸 '고리'에서 Annexin 강도를 측정합니다.
4. Annexin V 강도 값을 평균 강도로 표현합니다.

결과

JIMT-1 세포를 발현하는 EGFP를 생성하고, 이들 세포로부터 스페로이드를 성장시켰다. 수니티닙은 이전에 ADCC¹⁷의 과정에 영향을 미치는 것으로 나타났기 때문에 시험 화합물로 사용되었습니다. 스페로이드는 72시간 동안 뭉치도록 허용되었습니다. 3일째에, 10μg/mL의 트라스투주맙(또는 등몰 6.6μg/mL TR-F(ab')₂¹⁹) 및 NK 세포(20:1)를 20μM Sunitinib(1시간 전처리)의 ?...

토론

지난 수십 년 동안 BC 치료가 크게 개선되었음에도 불구하고 환자들은 여전히 정기적으로 약물 내성을 일으키거나 부작용을 경험한다²⁴. BC주와 관련된 높은 이환율과 사망률은 치료제 개발에 사용할 수 있는 새로운 분자를 식별하기 위한 강력한 스크리닝 플랫폼과 마찬가지로 근본적인 분자 메커니즘에 대한 지속적인 연구를 요구한다²⁵. 이러한 전략에는 세포 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well glass bottom Cell Carrier Ultra microplates	PerkinElmer, Waltham, MA, USA	LLC 6055302	for spheroids measurements
96-well tissue culture plates	TPP	92096	for cell seeding
α-MEM medium	Sigma	M8042	in NK medium
Agarose	Sigma	A9539	for spheroids seeding
Annexin V-Alexa Fluo 647 conjugate	Invitrogen-ThermoFisher Scientific	A23204	for apoptosis measurement with HCS
CD16.176 V.NK-92 cells	Dr. Kerry S. Campbell (the Fox Chase Cancer Center, Philadelphia, PA on behalf of Brink Biologics, Inc. San Diego, CA)	ATCC CRL-2407	for cell culture
Cell Tracker Blue	Invitrogen-Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)	C2110	for staining of NK cells
DMEM/F-12 medium	Sigma	D8437	in JIMT1-EGFP medium
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418	for coating HCS plate before transfering the spheroids
Fetal bovine serum (FBS)	Biosera	FB-1090/500	JIMT-1-EGFP and NK medium
Glutamine	Gibco	35,050–061	in NK medium
GraphPad Prism 8.0.1	GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA		for statistical analysis
Harmony software	PerkinElmer, Waltham, MA, USA		for HCA
IL-2	Proleukin, Novartis Hungária Kft., Budapest, Hungary	PHC0026	in NK medium
Insulin (Humulin R)	Eli Lilly	HI0219	JIMT-1-EGFP medium
JIMT-1 breast cancer cells			for cell culture
MEM Non-essential Amino Acids (MEM-NEAA)	Gibco	11,140–050	in NK medium
Na-pyruvate	Lonza	BE13-115E	in NK medium
Opera Phenix High-Content Analysis equipment	PerkinElmer, Waltham, MA, USA	HH14001000	for HCA
PBS (Posphate buffered saline)	Lonza	BE17-517Q	for washing the cells
Penicillin-Streptomycin	Biosera	LM-A4118	JIMT-1-EGFP and NK medium
pLP-1, pLP-2, pLP-VSV-G, pWOXEGFP	Invitrogen, (Prof. József Tzsér, University of Debrecen)		for JIMT-1-EGFP cell line
Pluronic-F127	Sigma	P2443	for coating HCS plate before transfering the spheroids
Sunitinib malate	SigmaAldrich	PZ0012	for treatments
Trastuzumab Ab (humanized anti-HER2 monoclonal antibody)	Herzuma®, EGIS Pharmaceuticals, Budapest, Hungary	NDC-63459-303-43	for treatments
Trastuzumab-F(ab')2	Gift from Prof. György Vereb and Árpád Ször	Department of Biophysics and Cell Biology, University of Debrecen	for treatments
Trypan blue 0.4% solution	Sigma	T8154	for cell counting
Trypsin-EDTA 1X in PBS	Biosera	LM-T1706	for cells detachment