Микрофлюидика в оценке функции тромбоцитов

Резюме

Можно оценить функцию тромбоцитов под действием потока и смоделировать гемостатическую реанимацию с помощью микрофлюидного устройства, которое применяется в травматологии и трансфузионной медицине.

Аннотация

Микрофлюидика включает в себя физиологически значимые субстраты и потоки, которые имитируют сосудистую сеть и, следовательно, являются ценным инструментом для изучения аспектов тромбоза и гемостаза. В средах с большим сдвигом, имитирующих артериальный поток, микрофлюидный анализ облегчает изучение функции тромбоцитов, поскольку богатые тромбоцитами тромбы образуются в локализованной стенотической области проточного канала. Использование устройств, которые позволяют использовать небольшой объем образца, может дополнительно помочь в оценке функции тромбоцитов в потоке из образцов пациентов с ограниченным объемом или животных моделей. Изучение образцов пациентов с травмами или образцов после переливания тромбоцитарных продуктов может помочь в определении терапевтических стратегий для групп пациентов, у которых функция тромбоцитов имеет решающее значение. В этой модели также могут быть изучены эффекты ингибирования тромбоцитов с помощью фармакологических агентов. Целью данного протокола является создание микрофлюидной платформы, которая включает в себя физиологический поток, биологические поверхности и соответствующие гемостатические механизмы для оценки функции тромбоцитов с последствиями для изучения травматической коагулопатии и трансфузионной медицины.

Введение

Травма является одной из основных причин смерти и инвалидности во всем мире. Тяжелая травма часто осложняется уникальным эндогенным нарушением гемостаза и тромбоза, называемым травматической коагулопатией (ТИК)¹. Тромбоциты играют решающую роль при ТИК, и они были описаны как обладающие как адаптивными, так и дезадаптивными функциями². Механизмы дисфункции тромбоцитов после травмы остаются неясными, и существует острая необходимость в лучшем понимании клеточного ответа для разработки улучшенной реанимации и терапии. Еще одной неприятной проблемой, связанной с функцией тромбоцитов после травмы, является неопределенность надежности имеющихся показаний функции тромбоцитов у пациента с травмой.

Многочисленные исследования показали, что даже пациенты с легкими травмами, без известного фенотипа клинического кровотечения, имеют аномальную функцию тромбоцитов при использовании обычного тестирования функции тромбоцитов, такого как агрегометрия ^3,4. Тем не менее, ограничения в агрегометрии для оценки функции тромбоцитов в условиях травмы включают отсутствие физиологически значимой поверхности повреждения, редукционистский подход к стимуляции агонистов, разведение образцов с помощью импедансной агрегометрии цельной крови, разделение плазмы с помощью агрегометрии оптического пропускания света и оценку застойных образцов. Кроме того, остается неясным, представляет ли эта чувствительность функции тромбоцитов истинную клеточную дисфункцию или артефакт измерения, такой как повышенный исходный электрический импеданс, в условиях травмы². Таким образом, изучение соответствующих функций тромбоцитов в контексте травмы имеет решающее значение для понимания TIC, и в этой области есть значительные возможности для инноваций и улучшений.

Платформы, традиционно используемые для изучения функции тромбоцитов, не включают динамику и поток жидкости, что может иметь решающее значение для понимания дисфункции тромбоцитов, связанной с травмой и коагулопатией, вызванной травмой⁵. Механизмы гемостаза, которые зависят от потока, включают удлинение фактора Виллебранда (VWF) при высоком сдвиге, выше критической скорости сдвига, и захват тромбоцитов с помощью гликопротеина 1b ^6,7,8, который не захватывается с помощью анализа застойной функции тромбоцитов. Кроме того, тромбоциты преимущественно связываются с VWF или фибриногеном в зависимости от режима кровотока и играют дифференцированную роль в артериальном и венозном тромбозе ^9,10. Артериальные тромбы в основном состоят из тромбоцитов, в то время как венозные тромбы в основном состоят из эритроцитов, основанных, в частности, на режимах потока¹¹. Анализы, включающие режимы потока, могут помочь в выяснении дисфункций, относящихся к спектру фенотипов TIC, от гипокоагуляции и фенотипов кровотечения до гиперкоагуляции и тромботических фенотипов. Наконец, ограничения по объему забора крови в популяциях пациентов с травмами могут затруднить традиционное функциональное тестирование тромбоцитов. В то время как такие анализы, как проточная цитометрия, могут и должны использоваться в этих обстоятельствах, результаты часто отражают физическую характеристику образца, а не функциональную оценку гемостаза.

В то время как механизмы дисфункции тромбоцитов могут быть не до конца поняты при травме, моделирование дисфункции тромбоцитов in vitro, например, с антагонистами P2Y12, также может помочь в изучении терапевтических вмешательств. Гемостатическая реанимация критически важна для пациентов с травмами, когда продукты крови переливаются сбалансированным подходом для лечения шока, коагулопатии и эндотелиального повреждения либо цельной кровью, либо компонентами крови (эритроцитами, плазмой и концентратами тромбоцитов) в соотношении единиц 1:1:1 12,13,14. У пациентов с травмами раннее использование препаратов крови связано с улучшением выживаемости^15,16. Для продления срока годности все чаще изучаются тромбоцитарные продукты, хранящиеся в холоде. Исследование тромбоцитов, хранящихся в холоде, показывает повышенную гемостатическую активность, а также безопасность при переливании крови после травмы^17,18.

Эволюция реанимации тромбоцитов, хранящихся в холоде, подчеркивает необходимость проведения дополнительных тестов, чтобы понять, какой тромбоцитарный продукт наиболее эффективен при травме. Тем не менее, традиционные анализы функции тромбоцитов часто подвергаются чрезмерной или недостаточной потенциации для выявления дисфункции, возникающей как у пациента с травмой, получающего терапевтическое переливание тромбоцитов, так и у самого переливаемого продукта, наблюдаемой при повреждениях при накоплении тромбоцитов. Определение происхождения дисфункции может быть сложной задачей, учитывая ограничения в современных анализах функции тромбоцитов, в том числе статический характер большинства этих тестов. Таким образом, при изучении гемостатической реанимации in vitro платформа и методы обнаружения как реципиентных, так и продуктовых тромбоцитов имеют решающее значение для определения оптимальных терапевтических вмешательств.

Микрофлюидное тестирование предлагает профили потока и биофиделические поверхности для создания физиологически релевантного анализа для изучения тромбоцитов. Микрофлюидные устройства могут быть настроены для изучения определенной патофизиологии или типов травм, таких как пункция сосудов¹⁹ или повреждение эндотелия²⁰. Эти устройства обычно состоят из полидиметилсилоксана (PDMS), прикрепленного к предметному стеклу стеклянного микроскопа с модификациями поверхности, такими как коллаген, для имитации субэндотелия и повреждения тканей. Использование этих типов устройств на основе потока может помочь в проведении исследований дисфункции тромбоцитов, связанных с травмой, и помочь в изучении оптимальных подходов трансфузионной медицины для улучшения дисфункции тромбоцитов. Эти стратегии могут помочь прояснить существующую путаницу в отношении актуальности статических анализов тромбоцитов, таких как агрегометрия, у пациента с травмой.

протокол

Все исследования проводились в соответствии с институциональными рекомендациями. Было получено одобрение от Управления по защите исследований человека Университета Питтсбурга и получено информированное согласие от здоровых добровольцев.

1. Подготовка микрофлюидных устройств

1. Чтобы изготовить часть устройства PDMS, подготовьте мастер-форму с использованием латуни с помощью микрообработки с числовым программным управлением (ЧПУ).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от размеров канала, для создания мастер-формы могут использоваться методы фотолитографии. Устройство, используемое в данном протоколе, включает в себя восемь параллельных микромеханических каналов шириной приблизительно 480 мкм, высотой 140 мкм на входе и выходе устройства и высотой 40 мкм на стенозе устройства, с длиной пандуса в/от стенозирующей области приблизительно 0,3 мм. Длина канала составляет примерно 6 мм.
2. С помощью полученной мастер-формы вылейте силиконовую эластомерную основу (полученную из набора эластомеров) в чашку для взвешивания. Добавьте силиконовый отвердитель (полученный из набора эластомеров), который способствует сшивке цепей силиконового полимера для преобразования жидкого PDMS в прочное и гибкое твердое вещество в соотношении 10:1 (базовый агент) и хорошо перемешайте смесь.
3. Поместите форму в чашку Петри и вылейте на форму неотвержденный PDMS. Поместите чашку Петри в вакуумный эксикатор на 30 минут, чтобы удалить пузырьки.
4. Завершите отверждение PDMS в мастер-форме, поместив ее в печь, настроенную на 70 °C, на 90 минут.
5. После полного отверждения PDMS вырежьте микрофлюидный слепок с помощью бритвенного лезвия или скальпеля. Пробейте отверстия по краям каналов (1,5 мм в диаметре с обеих сторон).
6. С помощью лабораторной ленты очистите поверхность предметного стекла и протравленную сторону микрофлюидного слепка. При необходимости используйте сжатый воздух для удаления оставшегося мусора.
7. Поместите предметное стекло и микрофлюидный слепок травленой стороной вверх в плазменный очиститель. Запустите вакуумный насос, загерметизируйте камеру и включите плазменный очиститель на высокую настройку. Оставьте предметное стекло и PDMS в плазменном очистителе на 30 с, затем выключите плазменный очиститель и снимите вакуум.
8. Свяжите очищенный плазмой литой материал и предметное стекло вместе, аккуратно прижав друг к другу стороны, которые были обращены вверх в плазменном очистителе. Затем поместите микрофлюидное устройство в духовку/конфорку при температуре 70 °C на 10 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикладывайте слишком большого давления при склеивании литого литья и стекла вместе, так как это может привести к потере морфологии канала.
9. Промойте каждую камеру 10-30 μл 70% этанола для стерилизации и дайте микрофлюидному устройству высохнуть на горячей плите при температуре 70 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Устройства должны быть изготовлены не менее чем за 24 часа, но могут быть изготовлены за недели или месяцы. Устройства следует хранить в герметичном контейнере или закрытой чашке Петри при комнатной температуре.
10. За день до эксперимента с микрофлюидным устройством повторно промойте каждую камеру 10-30 мкл 70% этанола для стерилизации и дайте микрофлюидному устройству высохнуть на конфорке при температуре 70 °C.
11. Покройте камеру реагентом для фибриллярного коллагена лошадей 1-го типа (1 мг/мл), разведенным в 0,9% NaCl в объемном соотношении 1:5 через назначенное выходное отверстие к назначенному входу. Убедитесь, что направленность в эксперименте сохраняется. Храните устройство в теплом, влажном закрытом контейнере, чтобы предотвратить испарение коллагена с покрытием внутри канала.
12. Через 1 час промойте фосфатно-солевым буфером (PBS), чтобы вымыть раствор коллагена. Заподлицо в направлении, противоположном нанесению покрытия. Когда устройство не используется, храните его в теплом, влажном закрытом контейнере.

2. Подготовка образца крови

1. Получите образец цитратной цельной крови с помощью венепункции. Инкубируйте цицитированную цельную кровь с раствором, блокирующим рецепторы ФК (1:600).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы крови хранятся при комнатной температуре до и во время эксперимента.
2. Инкубируйте цицитированную цельную кровь с флуоресцентно-конъюгированными (с использованием флуорофора выбора) антителами к CD41 (1:600). Заморочьте на 30 минут на качалке.
3. В качестве положительного контроля ингибирования тромбоцитов добавьте Тикагрелор, антагонист рецепторов P2Y12, восстановленный в растворе 30% w/v 2-гидроксипропил-β-циклодекстрина (HP-β-CD) в PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо подготовить запасы тикагрелора до 6,4 мМ и провести дальнейшее разведение запасов тикагрелора в растворе HP-β-CD (30% HP-β-CD, растворенных в PBS) до начала эксперимента (рекомендуется 1000-кратная концентрация запаса).
4. Инкубировать цитратный образец с тикагрелором (конечная концентрация до 6,4 мкМ) в течение 30 мин для наблюдения за ингибированием тромбоцитов.
5. При смешивании продукта крови с цитратным образцом окрасьте продукт крови раствором, блокирующим рецептор ФК (1:600) и флуоресцентно-конъюгированным (с использованием отдельного флуорофора к цитратированному образцу) антителом CD41 (1:600).
   1. Смешайте объемный эквивалент единиц перелитого продукта с цитратным образцом. Например, чтобы смоделировать 2 единицы продуктов тромбоцитов, перелитых человеку с кровотечением (примерно 250 мл на продукт в общем объеме крови 5000 мл), смешайте 100 мкл продукта крови с 1000 мкл образца цитратной крови.
6. Непосредственно перед экспериментом отфильтруйте образец крови через фильтр 40 мкм в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.

3. Проверка функции тромбоцитов под действием потока (Метод 1)

1. Включите микроскоп и соответствующее программное обеспечение.
2. Установите уровень отвода шприца насосом с помощью предметного столика микроскопа. Отрегулируйте настройки на шприцевой помпе.
   1. Рассчитайте объемный расход (Q) для желаемой средней скорости сдвига стенки (γ) 3 500 ^с-1 в стенотической области канала, используя уравнения (1) и (2)²¹.
      (1)
      (2)
      Где A — площадь поперечного сечения канала, P — увлажненный периметр, λ — коэффициент формы, b — короткая сторона прямоугольника (высота), а a — длинная сторона прямоугольника (ширина).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Значение 3,500 ^с-1 выбрано из-за критического сдвига VWF и находится в артериальном режиме ^7,22,23.
3. Поместите микрофлюидное устройство на предметный столик микроскопа. Прикрепите края микрофлюидного устройства к сцене, чтобы избежать движения. Убедитесь, что выходное отверстие обращено к задней части микроскопа.
4. Подсоедините один конец трубки с внутренним диаметром 1/16 дюйма (длиной около 30 см) к локтевому соединителю, а другой конец — к шприцу объемом 10 мл с внутренним разъемом 1/16 дюйма.
5. Наполните шприц стерильным PBS и подсоедините его к шприцевому насосу.
6. Вставьте локтевый разъем в розетку устройства.
7. Подготовьте впускные трубопроводы длиной около 10 см с коленчатым соединителем на одном конце и угловым вырезом на другом конце.
8. Подсоедините входной угловой разъем к входу устройства.
9. Поместите впускную линию в пробирку для отходов микроцентрифуги на угловом держателе.
10. Используйте объектив 10x для размеров канала шириной около 500 μм и сосредоточьтесь на краях канала микрофлюидного устройства.
11. Загрунтуйте трубопроводы PBS и очистите канал от PDMS/мусора, перемещая шприцевой насос вручную. Обязательно проверьте рядом с входом и выходом канала.
12. Откройте сохраненные настройки захвата изображений или создайте процедуру захвата изображений временных рядов, снятых каждые 1–2 с с помощью светлопольного канала и флуоресцентных каналов, соответствующих флуоресцентным антителам к CD41, используемым в образце крови.
13. Возьмите отфильтрованный образец цитированной крови и смешайте с помощью пипетирования вверх и вниз непосредственно перед экспериментом. Поместите образец на угловой держатель микроцентрифуги.
14. Поместите впускную линию в образец.
15. Начните запись снимка.
16. Медленно извлеките шприц, чтобы заполнить мертвый объем в трубке. Как только кровь достигнет канала, немедленно нажмите кнопку воспроизведения на шприцевом насосе, чтобы возобновить поток с желаемой скоростью сдвига.
17. При необходимости отрегулируйте фокус.
18. Проводите эксперимент до тех пор, пока тромбоциты полностью не окклюзируют стенотическую область микрофлюидного устройства или до экспериментальной конечной точки (т.е. 10 минут).
19. Убедитесь, что входная трубка погружена в образец крови на время эксперимента.
20. После завершения эксперимента остановите захват изображения и остановите работу шприцевого насоса. Сохраните снимок.
21. Снимите впускной соединитель колена и вылейте содержимое трубки в конус для отходов. Слейте содержимое шприца и выпускных линий также в коническую для отходов.
22. При необходимости замените впускной и выпускной патрубки и трубки для последующих проб.

4. Проверка функции тромбоцитов в потоке с образцами малого объема (менее 1 мл) (метод 2)

1. Повторите шаги с 1.1 по 1.4, как указано выше.
2. Пробейте выпускное отверстие диаметром 1,5 мм и входное отверстие диаметром 3 мм по краям каналов.
3. Повторите шаги с 1.6 по 3.6, как указано выше.
4. Используйте объектив 10x для размеров канала шириной около 500 μм и сосредоточьтесь на краях канала микрофлюидного устройства.
5. Очистите канал от PDMS/мусора, вручную переместив шприцевой насос и откачав доступную жидкость с помощью лабораторной салфетки. Удалите мусор с помощью лабораторной ленты в верхней части микрофлюидного устройства.
6. Вручную продвиньте насос, чтобы заполнить впускной бачок диаметром 3 мм PBS.
7. Откройте сохраненные настройки захвата изображений или создайте процедуру захвата изображений временных рядов, снятых каждые 1–2 с с помощью светлопольного канала и флуоресцентных каналов, соответствующих флуоресцентным антителам к CD41, используемым в образце крови.
8. Начните забор на шприцевом насосе (вручную или с заданной скоростью) и как только PBS будет продвигаться в канал и линия наполнения в резервуаре пойдет вниз, приостановить забор на насосе.
9. Удалите излишки PBS из резервуара с помощью пипетки.
10. Запустите захват изображения.
11. Нанесите образец крови пипеткой в резервуар (примерно 40 мкл) и немедленно запустите шприц для забора. Убедитесь, что поток запустился.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если двигатель шприцевого насоса для вывода не был заправлен на шаге 4.8, поток не начнется немедленно, и эксперимент следует повторить.
12. Пополняйте резервуар с кровью на время эксперимента, следя за тем, чтобы в канал не попадали воздушные карманы.
13. Проводите эксперимент до тех пор, пока тромбоциты полностью не окклюзируют стенотическую область микрофлюидного устройства или до экспериментальной конечной точки (т.е. через 10 минут).
14. После завершения эксперимента остановите захват изображения и остановите работу шприцевого насоса. Сохраните снимок.
15. Удалите избыток крови в резервуаре с помощью пипетирования. Вылейте содержимое отводной трубки в отработанную коническую трубку.
16. При необходимости замените соединители и трубки для последующих образцов.

5. Обеззараживание

1. Очистите входные и выходные линии от крови, промыв в 10% растворе отбеливателя.
2. Если все каналы микрофлюидного устройства были использованы, выбросьте устройство в контейнер для биологически опасных отходов Sharps.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все биологические отходы должны быть утилизированы вместе с биологически опасными отходами надлежащим образом.

6. Анализ изображений

1. Экспортируйте изображения из кинетических экспериментов с помощью программного обеспечения, нажав «Файл» | Экспорт/Импорт | Экспорт.
2. Выберите следующие параметры: тип файла: Tagged Image File Format (TIFF); компрессия: LZW; проверить исходные данные и сдвинуть пиксель; снимите флажок Применить кривую отображения и цвет канала; отметьте Определить подмножество (Область, Прямоугольная область и выберите область канала с сохранением измерения ширины и высоты между условиями). Экспортируйте в нужную папку и отметьте галочкой «Создать папку».
3. Обратите внимание на следующие экспериментальные значения в программном обеспечении: запуск кадра , когда кровь поступает в канал; частота кадров (информация, временные ряды).
4. Измерьте нормализованную среднюю интенсивность флуоресценции каждого кадра в эксперименте с использованием кода Matlab, предоставленного в качестве дополнительного файла 1, изменяя следующие входные данные для каждого эксперимента: начальный кадр/конечный кадр в зависимости от длины эксперимента (убедитесь, что длина эксперимента сохраняется между условиями); название эксперимента/название папки; обрезка параметров X, Y, H и W. Запустите код один раз для флуоресцентного канала тромбоцитов получателя и один раз для флуоресцентного канала тромбоцитов продукта. Отчет о нормализованных значениях MFI (столбец 2) и нормализованных значениях AUC (нормализованных к начальному кадру). Вычтите значение длины эксперимента из нормализованного значения AUC.

Результаты

Микрофлюидные эксперименты после использования этого метода должны показать образование богатых тромбоцитами тромбов в области стеноза проточного канала (рис. 1). На рисунке 1А показаны репрезентативные результаты, когда функциональ?...

Обсуждение

Вышеуказанный протокол включает в себя некоторые важные шаги для обеспечения надежности и воспроизводимости экспериментов. Во-первых, следует тщательно рассмотреть вопрос о флуоресцентных антителах. Антитела, используемые для обнаружения тромбоцитов в образце, не ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipments
Axio Observer	Zeiss	491917-0001-000
Bel-Art Space Saver Vacuum Desiccators	Fisher Scientific	08-594-15A
Fisherbrand Isotemp Digital Hotplate Stirrer	Fisher Scientific	FB30786161
Nutating Mixer	Fischer Scientific	88-861-043
OHAUS Scout Balance Scale	Uline	H-5852
Oven	Fisher Scientific	15-103-0520
Plasma cleaner	Harrick	PDC-32G (115V)
Syringe Pump (PHD ULTRA CP, I/W PROGRAMMABLE)	Harvard Apparatus	883015
Zen 3.4	Zeiss	Blue edition	Software
Material
1/16 inch ID - Barbed Elbow Connectors	Qosina	11691
10 mL syringe	Fischer Scientific	14-955-459
2-Hydroxypropyl-β-cyclodextrin	Cayman Chemicals	16169	30% Dissolved in Phosphate buffered saline
40-micron filters	Fischer Scientific	NC1469671
CD41 antibody	Novus Biologicals	NB100-2614	1:600 Ratio in Whole Blood
Chrono-Par Collagen Reagent	Chrono Log Corporation	385	1:5 Ratio in 0.9% Saline
Electron Microscopy Sciences Miltex Biopsy Punch with Plunger, 3.0 mm	Fisher Scientific	NC0856599
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge SafeLock Tubes, 1.5 mL	Fisher Scientific	05-402-25
Essendant 121oz. Clorox Germicidal Bleach	Fischer Scientific	50371500
Ethanol	Fisher Scientific	07-678-005	70%
Falcon Safety Dust Off DPSXLRCP Compressed Gas	Supra	1381978
Human TruStain	Biolegend	422302	1:600 Ratio in Whole Blood
LevGo smartSpatula Disposable Polypropylene Spatula	Fisher Scientific	18-001-017
Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-A3
Phosphate buffered saline	Gibco	10010-023
Safety Scalpel	Fisher Scientific	22-079-718
Saline	Millipore	567442	0.90%
Sartorius Polystyrene Weighing Boats	Fisher Scientific	13-735-744
Superslip Cover Slips - Superslip No. 1.5	Fisher Scientific	12-541-055
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	Fisher Scientific	NC9285739	Polydimethylsiloxane (PDMS)
Ticagrelor	Cayman Chemicals	15425
Tygon PVC Clear Tubing 1/16" ID, 1/8" OD, 50 ft length	McMaster-Carr	6516T11
Ultra-Machinable 360 Brass Bar	McMaster-Carr	8954K721	For master mold fabrication
Vacutainers	BD	363083
World Precision Instrument Reusable Biopsy Punch, 1.5mm	Fisher Scientific	NC1215626