Эта работа была поддержана испанский Ministerio де Educación у Ciencia (BIO 2006-11792) и Женералитата Каталонии (2005-SGR00437). Авторы хотели бы поблагодарить Марка Puigcerver и Джонатан Лукас за техническую помощь в подготовке информации. Все сотрудники Servei d&#39;Estabulari признается для содержания животных, и особенно Хуан Хосе Мартин и Хавьера Бенито для их дополнительного взноса на запись часть этого видео. НЦБ является членом португальской Fundação пункт Ciencia электронной Tecnologia и SG является членом испанской Ministerio де Educación у Ciencia.

Ухода за животными и процедуры были проведены в соответствии с руководящими принципами и положениями, утвержденными Комитетом по этике на человека и животных Исследование Universitat Автономного Барселоны, Испания. И. ооцитов коллекции <ol><li> Проверить и выбрать женский хомяков (Mesocricetus рыбки; 8-12 недели назад) Золотой сирийской напряжение на наличие толстого выделения из влагалища (постовуляторной разряд). </li><li> Вызвать выбранных самок superovulate путем внутрибрюшинного введения 40 МЕ PMSG (Беременные Маре Сыворотка гонадотропин), затем 40 МЕ ХГЧ (хорионический гонадотропин человека) 60 часов спустя. </li><li> Эвтаназии женщины хомяков 16 часов после введения ХГЧ в камеру углекислого газа. </li><li> Изолировать от яйцеводы женщины, как показано на видео и передавать их на каплю KSOM-H среды. </li><li> Сбор ооцит-кучевые комплексов, оторвав яйцевода ампула под стереоскопическим микроскопом в капле гиалуронидазы (156 ед / мл) при 37 ° C. Ооциты будет освобожден от клеток кумулюса примерно в 5 минут. </li><li> Возьмите ооцитов от гиалуронидазы и мыть их дважды в KSOM-H среды. </li></ol> Для сбора эмбрионов мыши, самки мышей (Mus мышцы; 6-8 недели назад) индуцируются на superovulate путем внутрибрюшинного введения 5 МЕ PMSG затем 5 МЕ ХГЧ 48 часов спустя, и совокуплялись с самцов мышей. Женщины жертвуют цервикальным сдвигом на 24-26, 44-46 или 54-56 часов после введения ХГЧ для obtention из пронуклеусов, 2-клетки или 4-элементный эмбрионов этапе, соответственно. Сборник пронуклеусов эмбрионов выполняется точно так, как описано для хомяка ооцитов. Эмбрионы на 2-клеток и 4-элементным этапах собираются промывки яйцеводы с KSOM-H среды [6]. Примечание: В соответствии с этим протоколом примерно от 20 до 30 яйцеклеток / эмбрионов могут быть собраны с каждой женщиной. II. Подготовка замораживания и оттаивания решения <ol><li> Подготовка решение, которое я разбавлением 0,57 мл propilenglycol в 5 мл KSOM-H (1,5 М propilenglycol). </li><li> Подготовка оттаивания решение, добавив 2 мл KSOM-H для трубы с 0,2052 г сахарозы (0,3 М сахарозы). </li><li> Подготовка замораживания решение, добавив 2 мл раствора я в трубку с 0,0684 г сахарозы (1,5 М propilenglycol и 0,1 М сахарозы). </li></ol> Примечание: Я решение и замораживания и оттаивания решения должны быть подготовлены как раз перед их использованием. Тем не менее, указанное количество сахарозы, которые будут использоваться для подготовки замораживания и оттаивания решения могут быть взвешены заранее и хранить в 3 мл трубки при комнатной температуре в течение нескольких месяцев. III. Замораживание протоколов <ol><li> Передача ооцитов / эмбрионов из KSOM-H средних каплю раствора я и инкубировать в течение 7-15 минут при комнатной температуре. </li><li> Между тем, подготовить 90 мм чашки Петри для загрузки соломкой, разместив 90 мкл капли замораживания и оттаивания решения, как это показано на видео (1 капля каждого решения / соломы). </li><li> Передача необходимое количество яйцеклеток / эмбрионов для замораживания капель раствора. Примечание: Мы обычно передачи от 5 до 30 яйцеклеток или эмбрионов / вывода. </li><li> Прикрепить соломенного до устья управляемой системы аспирации и загрузить его следующим таком порядке: решение, которое я, воздуха, замерзания капли с ооцитов, воздух, таяние капли, воздух. </li><li> После соломы загружена, сохранить аспирационных до первой капли введен (раствор I) достигает полимера на верхнем конце соломы и тюленей в этом направлении. Термо-печать другом конце соломы или печать с пластиковой заглушкой. </li><li> Включите программируемых морозильник и выберите замораживании программы. Замораживание программы, используемые в настоящем протоколе основан на скоростях охлаждения первоначально опубликовано Лассаля и др.. [7]: <ul><li> 2 ° С / мин от комнатной температуры до -7 ° C 0 ° С / мин в течение 10 мин, чтобы обеспечить равновесие температуры и индукции посева (см. ниже) </li><li> 0,3 ° С / мин от -7 ° C до -30 ° С 0 ° С / мин в течение 2 мин, чтобы обеспечить температуру равновесия </li><li> 35 ° С / мин от -30 ° С до -130 ° С </li></ul></li><li> Нагрузка на соломинки слотов владельца программируемых морозильник, убедившись, что часть соломы с каплей оттаивания решение наружу. Начать замораживание программы. </li><li> Когда температура образца достигает -7 ° С и охлаждение на удержание, произвести ручную посева: окунуться щипцов в жидкий азот, потяните держатели немного не в морозильник, чтобы выставить часть соломинки содержащие капли оттаивания решение, и сразу же коснуться этой части соломинки с щипцами. Повторите эти действия для каждого держателя, и каждый соломы в держатель, а затем пусть замораживание программы продлится до конца. </li><li> Когда программа завершится, окунуться держателей в жидком азоте. </li><li> Удалить из соломкивладельцы и передавать их на помечены gobelet. </li><li> Наконец, хранить gobelet внутри резервуар жидкого азота. </li></ol> IV. Размораживание протокола <ol><li> Удалить из соломы резервуар жидкого азота. </li><li> Поддерживать соломы при комнатной температуре в течение 40 секунд. </li><li> Замочите соломы на водяной бане при температуре 30 ° С в течение 40 секунд. </li><li> Удалить вилку из соломы или вырезать термо-запечатанном чаевые. </li><li> Пустые соломы в 35-мм чашки Петри и хорошо смешайте две капли, содержащие замораживания и оттаивания решений. </li><li> Оставьте ооцитов / эмбрионов в смеси в течение 15 минут при комнатной температуре. </li><li> Передача ооцитов / эмбрионов свежие капли KSOM-H для еще 15 минут при 37 ° C. </li><li> Ооцитов / эмбрионов теперь готовы для дальнейшей манипуляции. </li></ol> Примечание: Во время действия 6 и 7 вы увидите, что талые яйцеклеток / эмбрионов медленно раздуваются за счет регидратации. Результаты В. представитель Использование протокола криоконсервации сообщили здесь результаты в выживаемости примерно 95% для хомяка ооцитов и&gt; 90%, 85% и 80% для мыши B6CBAF1 эмбрионов на пронуклеусов, 2-клеток и 4-элементным этапах соответственно. Когда мышь эмбрионы культивировали в пробирке в KSOM после оттаивания, по крайней мере от 70 до 80% должна достичь стадии бластоцисты в оптимальных условиях культуры. Рекомендуется, чтобы вы включили контрольной группе (соломы) ооцитов / эмбрионов в каждом замораживания эксперимент, и что вы оттепель эту группу раньше остальных яйцеклеток / эмбрионов используются для дальнейших манипуляций. Если выживаемость в контрольной группе ниже, чем ожидалось, оттепель другой соломы от той же партии. Если выживаемость для этой второй группы также низко, отбросить оставшиеся соломинки из этого замораживания много.

<ol>
	<li>Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+mouse+embryos+frozen+to+-196+and+-269+&#176;C.">Survival of mouse embryos frozen to -196 and -269 &#176;C.</a> Science. 178, 411-414 (1972).</li><li>Wilmut, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cooling+rate,+warming+rate,+cryoprotective+agent+and+stage+of+development+on+survival+of+mouse+embryos+during+freezing+and+thawing.">The effect of cooling rate, warming rate, cryoprotective agent and stage of development on survival of mouse embryos during freezing and thawing.</a> Life Sci. 11, 1071-1079 (1972).</li><li>Parkening, T. A., Tsunoda, Y., Chang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+various+low+temperatures,+cryoprotective+agents+and+cooling+rates+on+the+survival,+fertilizability+and+development+of+frozen-thawed+mouse+eggs.">Effects of various low temperatures, cryoprotective agents and cooling rates on the survival, fertilizability and development of frozen-thawed mouse eggs.</a> J. Exp. Zool. 197, 369-374 (1976).</li><li>Schneider, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryobiological+principles+of+embryo+freezing.">Cryobiological principles of embryo freezing.</a> J. In Vitro Fert. Embryo Transf. 3, 3-9 (1986).</li><li>Vajta, G., Kuwayama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cryopreservation+systems.">Improving cryopreservation systems.</a> Theriogenology. 65, 236-244 (2006).</li><li>Duselis, A. R., Vrana, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrieval+of+mouse+oocytes.">Retrieval of mouse oocytes.</a> JoVE. 3, (2007).</li><li>Lassalle, B., Testart, J., Renard, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryo+features+that+influence+the+success+of+cryopreservation+with+the+use+of+1,2+propanediol.">Human embryo features that influence the success of cryopreservation with the use of 1,2 propanediol.</a> Fertil. Steril. 44, 645-651 (1985).</li><li>Ib&#225;&#241;ez, E., Grossmann, M., Vidal, F., Egozcue, J., Santal&#243;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+caprine+beta-lactoglobulin+transgenic+mouse+embryos.">Cryopreservation of caprine beta-lactoglobulin transgenic mouse embryos.</a> Cryobiology. 35, 290-298 (1997).</li><li>Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genotype+on+the+efficiency+of+mouse+embryo+cryopreservation+by+vitrification+or+slow+freezing.">Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing.</a> Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).</li><li>Tateno, H., Kamiguchi, Y., Mikamo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+freezing+and+thawing+method+of+hamster+oocytes+designed+for+both+the+penetration+test+and+chromosome+assay+of+human+spermatozoa.">A freezing and thawing method of hamster oocytes designed for both the penetration test and chromosome assay of human spermatozoa.</a> Mol. Reprod. Dev. 33, 202-209 (1992).</li><li>Biggers, J., McGuinnis, L. K., Raffin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+and+preimplantation+development+of+the+mouse+in+the+protein-free+KSOM.">Amino acids and preimplantation development of the mouse in the protein-free KSOM.</a> Biol. Reprod. 63, 281-293 (2000).</li></ol>

С помощью этого протокола хомяка ооцитов и эмбрионов мыши могут быть успешно криоконсервированных. Как только замороженные, ооциты / эмбрионы могут храниться в жидком азоте танки на неопределенный срок и восстановления в любое время или место лучшего. Это дает преимущество, что образцы почти гот?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>French type mini-straw 0.25 ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mini-tub</td>
<td>13407/0010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>hCG</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Farma-Lepori, Spain</td>
<td>749036.4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H-3884</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KSOM-H medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ref. [11]</td>
</tr>
<tr>
<td>Liquid Nitrogen </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Air Liquide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic plugs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mini-tub</td>
<td>19046</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PMSG</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Intervet, Spain</td>
<td>1.614/8447</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Propilenglycol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>82280</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>107687</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Surgical Scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Aesculap</td>
<td>BC-060R; BG-061R</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Thermo-sealer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIZ</td>
<td>220</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35 and 90 mm culture dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>153066; 150350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 ml tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Greiner Bio-one</td>
<td>163160</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nitrogen tank</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MVE, Cryogenics</td>
<td>XC 43/28</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Programmable Freezer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Planner Products Ltd.</td>
<td>Kryo-10 Series III</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Aesculap</td>
<td>BD-331R; BD-053R; OC-020R</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

collection and cryopreservation of hamster oocytes and mouse embryos

Эмбрионы и ооцитов были впервые успешно криоконсервированных более 30 лет назад, когда Уиттингем<i&gt; Соавт.</i&gt;<sup&gt; 1</sup&gt; И Вильмута<sup&gt; 2</sup&gt; Отдельно рассказал, что мыши эмбрионы могут быть заморожены и храниться при температуре -196 ° C, и, спустя несколько лет, Parkening<i&gt; И др.</i&gt;.<sup&gt; 3</sup&gt; Сообщили рождения живое потомство в результате экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) криоконсервированных ооцитов. С тех пор, использование методов криоконсервации быстро распространяться, чтобы стать важным компонентом в практике человека и животных, оплодотворения и в области сохранения генетических ресурсов животных. В настоящее время Есть две основные методы, используемые для cryopreserve яйцеклеток и эмбрионов: медленное замораживание и стеклования. Широкое разнообразие подходов были использованы, чтобы попытаться улучшить оба метода и миллионы животных и тысячи детей были рождены от криоконсервированных эмбрионов. Тем не менее, серьезные недостатки, связанные с криоконсервации еще должны быть преодолены, так как лед-образования кристаллов, решение эффектов и осмотический шок, кажется, вызывают несколько cryoinjuries в пост-талого ооцитов и эмбрионов. Медленное замораживание с программируемым морозильники имеет преимущество использования низких концентраций криопротекторов, которые обычно связаны с химической токсичности и осмотический шок, но их способность избежать ледяных кристаллов образование при низких концентрациях ограничен. Медленное замораживание также вызывает переохлаждение эффектов, которых следует избегать с помощью ручного или автоматического посева<sup&gt; 4</sup&gt;. В стеклования процесса, высоких концентраций криопротекторов препятствует образованию льда кристаллов и привести к образованию стеклоподобной керамической состояние, в котором вода затвердевает, но не раскрывается. Однако из-за токсичности cyroprotectants в используемых концентрациях, ооцитов / эмбрионов может быть только подвергается криопротектора решение в течение очень короткого периода времени и в минимальном объеме раствора, перед погружением образцов непосредственно в жидком азоте<sup&gt; 5</sup&gt;. В последнее десятилетие стеклования стала более популярной, потому что это очень быстрый метод, в котором нет дорогостоящего оборудования (программируемые морозильная камера) не требуется. Тем не менее, медленное замораживание продолжает быть наиболее широко используемый метод для ооцитов / эмбрионов криоконсервации. В этом видео-статье мы покажем, шаг за шагом, как собирать и медленно заморозить хомяка ооциты с высоким после оттепели выживаемости. Аналогичная процедура может быть применен и к успешно замораживания и оттаивания эмбрионов мыши на разных этапах предимплантационной развития.

Watch this Scientific Journal Video about Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos at JoVE.com

Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

В этом видео-статье мы представляем шаг за шагом демонстрацию о том, как собирать и cryopreserve хомяка ооциты с высоким после оттепели выживаемости. Аналогичная процедура может быть применен и к успешно замораживания и оттаивания эмбрионов мыши на разных этапах предимплантационной развития.

Сбор и Криоконсервация ооцитов хомяка и мыши Эмбрионы

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse ...

collection-and-cryopreservation-of-hamster-oocytes-and-mouse-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

16.8K Views.  Universitat Autonoma de Barcelona. В этом видео-статье мы представляем шаг за шагом демонстрацию о том, как собирать и cryopreserve хомяка ооциты с высоким после оттепели выживаемости. Аналогичная процедура может быть применен и к успешно замораживания и оттаивания эмбрионов мыши на разных этапах п?...

Video: Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

Nuclear Transfer into Mouse Oocytes

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying development, differentiation and aging are epigenetic rather than genetic processes. The reversibility of these processes opens exciting perspectives in basic research, and in the more distant future, in regenerative medicine. In the mouse, embryonic stem cells can be derived from cloned preimplantation stage embryos. Such embryonic stem cells have the ability to give rise to all cell types of the adult organism. Importantly, these cells are genetically identical to the donor. If applicable to human, this would allow the derivation of stem cells from a patient. These cells could then be differentiated into the affected cell type of the patient and studied in vitro, or used to replace the damaged or missing cells. The study of nuclear transfer in the mouse remains important as it can inform us about the principles of nuclear reprogramming. This movie and the accompanying protocol are intended to help learning nuclear transfer in the mouse, a method initially developed in the group of Prof. Yanagimachi (WAKAYAMA et al. 1998).

This movie and the protocol are intended to help learning nuclear transfer.

Ядерная передача в ооциты мыши

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying ...

Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

Препарирование 6,5 Эмбрионы DPC мышь

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

Retrieval of Mouse Oocytes

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus Genetic Stock Center (http://stkctr.biol.sc.edu), we are characterizing the salient differences needed to develop this system.  A primary goal has been to optimize oocyte/early embryo retrieval.

This protocol illustrates the technique for extracting oocytes or early-stage fertilized embryos from the oviduct of mice. The ability to identify the infindibulum and insert a blunt end needle into it is essential to correctly performing the procedure.

Восстановление мыши ооцитов

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus ...

In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors lining the walls of the lateral ventricle. This technique is now widely used to study the processes involved in corticogenesis by over-expressing or knocking down genes and observing the effects on cellular proliferation, migration, and differentiation. In comparison to traditional knockout strategies, in-utero electroporation provides a rapid means to manipulate a population of cells during a specific temporal window. In this video protocol we outline the experimental methodology for preparing mice for surgery, exposing the uterine horns through laporatomy, injecting DNA into the lateral ventricles of the developing embryo, electroporating DNA into the progenitors lining the lateral wall, and caring for animals post-surgery. Our laboratory uses this protocol for surgeries on E13-E16 mice, however, it is most commonly performed at E15, as shown in this video. 

In Utero инъекций Внутрижелудочковая и электропорации E15 эмбрионов мыши

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

В естественных изображений и лечебных процедур в Ортотопическая мышиной модели рака яичников

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Cryopreservation of Preimplantation Embryos of Cattle, Sheep, and Goats

Preimplantation embryos from cattle, sheep, and goats may be cryopreserved for short- or long-term storage. Preimplantation embryos consist predominantly of water, and the avoidance of intracellular ice crystal formation during the cryopreservation process is of paramount importance to maintain embryo viability. Embryos are placed into a hypertonic solution (1.4 &#x2013; 1.5 M) of a cryoprotective agent (CPA) such as ethylene glycol (EG) or glycerol (GLYC) to create an osmotic gradient that facilitates cellular dehydration. After embryos reach osmotic equilibrium in the CPA solution, they are individually loaded in the hypertonic CPA solution into 0.25 ml plastic straws for freezing. Embryos are placed into a controlled rate freezer at a temperature of -6&deg;C. Ice crystal formation is induced in the CPA solution surrounding the embryo, and crystallization causes an increase in the concentration of CPA outside of the embryo, causing further cellular dehydration. Embryos are cooled at a rate of 0.5&deg;C/min, enabling further dehydration, to a temperature of -34&deg;C before being plunged into liquid nitrogen (-196&deg;C). Cryopreserved embryos must be thawed prior to transfer to a recipient (surrogate) female. Straws containing the embryos are removed from the liquid nitrogen dewar, held in room temperature air for 3 to 5 sec, and placed into a 37&deg;C water bath for 25 to 30 sec. Embryos cryopreserved in GLYC are placed into a 1 M solution of sucrose for 10 min for removal of the CPA before transfer to a recipient (surrogate) female. Embryos cryopreserved in EG, however, may be directly transferred to the uterus of a recipient.

Preimplantation embryos may be cryopreserved after placement into a hypertonic cryoprotective solution to cause cellular dehydration. After equilibration, ice crystal formation is induced in the solution surrounding the embryo. Further dehydration occurs as the embryo is slowly cooled to subzero temperatures before plunging into liquid nitrogen for storage.

Криоконсервация Предимплантационная Эмбрионы крупного рогатого скота, овец и коз

Preimplantation embryos from cattle, sheep, and goats may be cryopreserved for short- or long-term storage.  Preimplantation embryos consist predominantly ...

Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic modifications and the number is consistently increasing year by year. Its technical development started with slow freezing methods in the 1970s1, then followed by vitrification methods developed in the late 1980s2. Generally, the latter technique is advantageous in its quickness, simplicity, and high survivability of recovered embryos. However, the cryoprotectants contained are highly toxic and may affect subsequent embryo development. Therefore, the technique was not applicable to certain strains of mice, even when the solutions are cooled to 4&deg;C to mitigate the toxic effect during embryo handling. At the RIKEN BioResource Center, more than 5000 mouse strains with different genetic backgrounds and phenotypes are maintained3, and therefore we have optimized a vitrification technique with which we can cryopreserve embryos from many different strains of mice, with the benefits of high embryo survival after vitrifying and thawing (or liquefying, more precisely) at the ambient temperature4.
Here, we present a vitrification method for mouse embryos that has been successfully used at our center. The cryopreservation solution contains ethylene glycol instead of DMSO to minimize the toxicity to embryos5. It also contains Ficoll and sucrose for prevention of devitrification and osmotic adjustment, respectively. Embryos can be handled at room temperature and transferred into liquid nitrogen within 5 min. Because the original method was optimized for plastic straws as containers, we have slightly modified the protocol for cryotubes, which are more easily accessible in laboratories and more resistant to physical damages. We also describe the procedure of thawing vitrified embryos in detail because it is a critical step for efficient recovery of live mice. These methodologies would be helpful to researchers and technicians who need preservation of mouse strains for later use in a safe and cost-effective manner.

An ethylene glycol-based vitrification method for mouse embryos is described. It is advantageous to other methods in its simplicity and low embryonic toxicity, and therefore can be broadly applicable to many strains of mice, including inbred and gene-modified mice.

Криоконсервация эмбрионов мыши на этиленгликоля основе Витрификация

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies. Many of these valuable animals exist only as live animals, with no backup plan in case of emergency. Cryopreservation of embryos can provide this backup, but is costly, can be a lengthy procedure, and generally requires a large number of animals for success. Since the discovery that mouse sperm can be successfully cryopreserved with a basic cryoprotective agent (CPA) consisting of 18&#37; raffinose and 3&#37; skim milk, sperm cryopreservation has become an acceptable and cost-effective procedure for archiving, distributing and recovery of these valuable strains.
 Here we demonstrate a newly developed I&bull;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Sperm from five commonly-used strains of inbred mice were frozen using this kit and then recovered. Higher protection ratios of sperm motility (&gt; 60&#37;) and rapid progressive motility (&gt; 45&#37;) compared to the control (basic CPA) were seen for sperm frozen with this kit in 5 inbred mouse strains. Two cell stage embryo development after IVF with the recovered sperm was improved consistently in all 5 mouse strains examined. Over a 1.5 year period, 49 GM mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&bull;Cryo kit and later recovered by IVF.

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&amp;middot;Cryo Kit

Here we demonstrate the newly developed I&#x2022;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Two-cell stage embryo development with frozen-thawed sperm was improved consistently in 5 mouse strains with the use of this kit. Over a 1.5 year period, 49 genetically modified mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&#x2022;Cryo kit and later successfully recovered by IVF.

Мышь Криоконсервация спермы и восстановление использованием I · Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Here, we present a protocol for specific siRNA-mediated mRNA depletion followed by immunofluorescence analysis to evaluate meiotic spindle assembly and organization in mouse oocytes. This protocol is suitable for in vitro depletion of transcripts and functional assessment of different spindle and/or MTOC-associated factors in oocytes.

Мейоза шпинделя оценка в мышь ооцитов по миРНК-обеспечиваемого молчания

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a critical yet enigmatic biological event that has been historically difficult to study due to technical and ethical limitations. Implantation is initiated by the development of the trophectoderm to early trophoblast and subsequent differentiation into distinct trophoblast sublineages. Aberrant early trophoblast differentiation may lead to implantation failure, placental pathologies, fetal abnormalities, and miscarriage. Recently, methods have been developed to allow human embryos to grow until day 13 post-fertilization in vitro in the absence of maternal tissues, a time-period that encompasses the implantation period in humans. This has given researchers the opportunity to investigate human implantation and recapitulate the dynamics of trophoblast differentiation during this critical period without confounding maternal influences and avoiding inherent obstacles to study early embryo differentiation events in vivo. To characterize different trophoblast sublineages during implantation, we have adopted existing two-dimensional (2D) extended culture methods and developed a procedure to enzymatically digest and isolate different types of trophoblast cells for downstream assays. Embryos cultured in 2D conditions have a relatively flattened morphology and may be suboptimal in modeling in vivo three-dimensional (3D) embryonic architectures. However, trophoblast differentiation seems to be less affected as demonstrated by anticipated morphology and gene expression changes over the course of extended culture. Different trophoblast sublineages, including cytotrophoblast, syncytiotrophoblast and migratory trophoblast can be separated by size, location, and temporal emergence, and used for further characterization or experimentation. Investigation of these early trophoblast cells may be instrumental in understanding human implantation, treating common placental pathologies, and mitigating the incidence of pregnancy loss.

Here, we describe a method for warming vitrified human blastocysts, culturing them through the implantation period in vitro, digesting them into single cells and collecting early trophoblast cells for further investigation.

Одноклеточная коллекция трофибластных клеток в пери-имплантации этапе человеческих эмбрионов

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a ...