Ce travail a été soutenu par les Espagnols Ministerio de Educación y Ciencia (BIO 2006 à 11792) et la Generalitat de Catalunya (2005-SGR00437). Auteurs tiens à remercier Marc Puigcerver et Jonatan Lucas pour leur assistance technique dans la préparation du support. Tout le personnel de la Estabulari Servei d&#39;est reconnu pour le logement des animaux, et surtout Juan José Martin et Javier Benito, pour leur contribution supplémentaire sur l&#39;enregistrement une partie de cette vidéo. PNE est un membre de la Fundação para portugaise une Ciência e Tecnologia et SG est un fellow de l&#39;Espagne Ministerio de Educación y Ciencia.

Les soins des animaux et des procédures ont été menées selon les directives et règlements approuvés par le Comité d&#39;éthique sur la recherche animale et humaine de l&#39;Universitat Autònoma de Barcelone, en Espagne. Recueil ovocytaire I. <ol><li> Vérifier et sélectionner les hamsters femelles (Mesocricetus auratus; 8-12 semaines est vieux) de la souche d&#39;or syrien pour la présence d&#39;un écoulement épais vaginale (décharge postovulatoire). </li><li> Induire les femmes sélectionnées pour superovulate par injection intrapéritonéale de 40 UI de PMSG (Pregnant Mare Serum Gonadotropin) suivi par 40 UI de hCG (gonadotrophine chorionique humaine) 60 heures plus tard. </li><li> Euthanasier les hamsters femelles 16 heures après l&#39;administration de hCG dans une chambre de dioxyde de carbone. </li><li> Isoler oviductes des femelles, comme indiqué dans la vidéo et les transférer à une baisse de KSOM-H moyenne. </li><li> Recueillir ovocyte-cumulus complexes en déchirant l&#39;ampoule tubaire sous un microscope stéréoscopique dans une goutte d&#39;hyaluronidase (156 U / ml) à 37 ° C. Les ovocytes seront libérés par les cellules du cumulus en environ 5 minutes. </li><li> Pick up à partir d&#39;ovocytes hyaluronidase et les laver deux fois dans KSOM-H moyenne. </li></ol> Pour la collecte d&#39;embryons de souris, les souris femelles (Mus musculus; 6-8 semaines est vieux) sont amenés à superovulate par injection intrapéritonéale de 5 UI de PMSG suivie par 5 UI de hCG 48 heures plus tard et accouplées avec des souris mâles. Les femelles sont sacrifiées par dislocation cervicale p. 24-26, 44-46 ou 54-56 heures après l&#39;administration d&#39;hCG pour l&#39;obtention du pronucléaire, 2-cellules ou embryons au stade 4 cellules, respectivement. Collecte des embryons pronucléaire est réalisée exactement comme décrit pour les ovocytes de hamster. Les embryons au stade 2-cellules et 4-cellules sont collectées par rinçage des oviductes avec KSOM-H moyenne [6]. Note: Suite à ce protocole environ 20 à 30 ovocytes / embryons peuvent être recueillies auprès de chaque femme. II. Préparation du gel et de dégel des solutions <ol><li> Préparer la solution en diluant I 0,57 ml de propilenglycol dans 5 ml de KSOM-H (1,5 M de propilenglycol). </li><li> Préparer la solution de décongélation en ajoutant 2 ml de KSOM-H à un tube avec 0,2052 g de saccharose (0,3 M de saccharose). </li><li> Préparer la solution de gel en ajoutant 2 ml de solution de I à un tube avec 0,0684 g de saccharose (1,5 M de propilenglycol et 0,1 M de saccharose). </li></ol> Note: Je Solution et gel et de dégel des solutions doivent être préparées juste avant leur utilisation. Toutefois, les montants spécifiés de saccharose à être utilisé pour la préparation du gel et de dégel des solutions peuvent être pondérées à l&#39;avance et stockées dans 3 ml de tubes à température ambiante pendant plusieurs mois. III. Protocole de congélation <ol><li> Ovocytes Transfert / embryons à partir du milieu KSOM-H à une goutte de solution de I et incuber pendant 7-15 minutes à température ambiante. </li><li> Pendant ce temps, préparer une boîte de Petri de 90 mm pour charger les pailles en plaçant 90 gouttes ul du gel et de dégel des solutions comme il est montré dans la vidéo (1 goutte de chaque solution / paille). </li><li> Transférer le nombre souhaité d&#39;ovocytes / embryons aux gouttes solution de congélation. Note: Nous transfèrent habituellement entre 5 à 30 ovocytes ou d&#39;embryons / déposer. </li><li> Attacher une paille pour un système d&#39;aspiration contrôlée bouche et le charger suivant cet ordre: la solution, je, l&#39;air, chute de la congélation des ovocytes avec, l&#39;air, chute de dégel, de l&#39;air. </li><li> Une fois que la paille est chargé, continuez jusqu&#39;à la chute de l&#39;aspiration première fois (solution I) atteint le polymère à l&#39;extrémité supérieure de la paille et les joints à cette fin. Thermo-joint l&#39;autre bout de la paille ou les sceller avec un bouchon en plastique. </li><li> Mettez le congélateur programmable et sélectionnez le programme de congélation. Le programme de congélation utilisé dans ce protocole est basé sur le taux de refroidissement initialement publié par Lassalle et al. [7]: <ul><li> 2 ° C / min de la température ambiante à -7 ° C 0 ° C / min pendant 10 min pour permettre l&#39;équilibrage de température et de l&#39;induction de l&#39;ensemencement (voir ci-dessous) </li><li> 0,3 ° C / min de -7 ° C à -30 ° C 0 ° C / min pendant 2 min pour permettre l&#39;équilibrage de température </li><li> 35 ° C / min de -30 ° C à -130 ° C </li></ul></li><li> Chargez les pailles sur les fentes de la porte du congélateur programmable, en s&#39;assurant que la partie de la paille avec la goutte de solution de décongélation est orientée vers l&#39;extérieur. Démarrez le programme de congélation. </li><li> Lorsque la température de l&#39;échantillon atteint -7 ° C et le refroidissement est en attente, effectuer le semis manuel: plonger la pince dans l&#39;azote liquide, tirez sur la porte un peu hors du congélateur pour exposer la partie de la paille contenant les gouttes de solution de dégel, et immédiatement toucher cette partie de la paille avec la pince. Répétez l&#39;opération pour chaque titulaire et chaque paillette dans le support, puis laisser le programme de congélation jusqu&#39;à la fin. </li><li> Lorsque le programme est terminé, plongent les porteurs dans l&#39;azote liquide. </li><li> Retirer les pailles de lales titulaires et les transférer à un gobelet étiqueté. </li><li> Enfin, rangez le gobelet intérieur d&#39;un réservoir d&#39;azote liquide. </li></ol> IV. Le dégel du protocole <ol><li> Retirer la paille du réservoir d&#39;azote liquide. </li><li> Maintenir la paille à température ambiante pendant 40 secondes. </li><li> Faire tremper la paille dans un bain-marie à 30 ° C pendant 40 secondes. </li><li> Enlevez le bouchon de la paille ou couper le bout thermo-scellés. </li><li> Videz la paille dans un plat de 35 mm de Pétri et mélanger délicatement les deux gouttes contenant le gel et le dégel des solutions. </li><li> Laisser ovocytes / embryons dans le mélange pendant 15 minutes à température ambiante. </li><li> Transfert des ovocytes / embryons à une baisse des frais KSOM-H pour 15 minutes supplémentaires à 37 ° C. </li><li> Ovocytes / embryons sont maintenant prêts pour d&#39;autres manipulations. </li></ol> Remarque: Pendant les étapes 6 et 7 vous devriez voir que les ovocytes décongelés / embryons lentement gonfler à cause de la réhydratation. Résultats Représentant V. L&#39;utilisation du protocole de cryoconservation rapportés ici en résulte un taux de survie d&#39;environ 95% des ovocytes de hamster et de&gt; 90%, 85% et 80% pour la souris B6CBAF1 embryons au pronucléaire, 2 cellules-étapes et 4 cellules, respectivement. Lorsque des embryons de souris sont cultivées in vitro dans KSOM après décongélation, au moins 70 à 80% devrait atteindre le stade de blastocyste dans des conditions optimales de culture. Il est recommandé d&#39;inclure un groupe témoin (paille) des ovocytes / embryons dans chaque expérience de congélation et de dégel que vous ce groupe avant que le reste des ovocytes / embryons sont utilisés pour des manipulations supplémentaires. Si les taux de survie pour le groupe contrôle sont plus faibles que prévu, décongeler une autre de paille provenant du même lot. Si les taux de survie pour ce second groupe sont également faibles, jeter le reste des pailles provenant de ce lot de gel.

<ol>
	<li>Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+mouse+embryos+frozen+to+-196+and+-269+&#176;C.">Survival of mouse embryos frozen to -196 and -269 &#176;C.</a> Science. 178, 411-414 (1972).</li><li>Wilmut, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cooling+rate,+warming+rate,+cryoprotective+agent+and+stage+of+development+on+survival+of+mouse+embryos+during+freezing+and+thawing.">The effect of cooling rate, warming rate, cryoprotective agent and stage of development on survival of mouse embryos during freezing and thawing.</a> Life Sci. 11, 1071-1079 (1972).</li><li>Parkening, T. A., Tsunoda, Y., Chang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+various+low+temperatures,+cryoprotective+agents+and+cooling+rates+on+the+survival,+fertilizability+and+development+of+frozen-thawed+mouse+eggs.">Effects of various low temperatures, cryoprotective agents and cooling rates on the survival, fertilizability and development of frozen-thawed mouse eggs.</a> J. Exp. Zool. 197, 369-374 (1976).</li><li>Schneider, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryobiological+principles+of+embryo+freezing.">Cryobiological principles of embryo freezing.</a> J. In Vitro Fert. Embryo Transf. 3, 3-9 (1986).</li><li>Vajta, G., Kuwayama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cryopreservation+systems.">Improving cryopreservation systems.</a> Theriogenology. 65, 236-244 (2006).</li><li>Duselis, A. R., Vrana, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrieval+of+mouse+oocytes.">Retrieval of mouse oocytes.</a> JoVE. 3, (2007).</li><li>Lassalle, B., Testart, J., Renard, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryo+features+that+influence+the+success+of+cryopreservation+with+the+use+of+1,2+propanediol.">Human embryo features that influence the success of cryopreservation with the use of 1,2 propanediol.</a> Fertil. Steril. 44, 645-651 (1985).</li><li>Ib&#225;&#241;ez, E., Grossmann, M., Vidal, F., Egozcue, J., Santal&#243;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+caprine+beta-lactoglobulin+transgenic+mouse+embryos.">Cryopreservation of caprine beta-lactoglobulin transgenic mouse embryos.</a> Cryobiology. 35, 290-298 (1997).</li><li>Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genotype+on+the+efficiency+of+mouse+embryo+cryopreservation+by+vitrification+or+slow+freezing.">Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing.</a> Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).</li><li>Tateno, H., Kamiguchi, Y., Mikamo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+freezing+and+thawing+method+of+hamster+oocytes+designed+for+both+the+penetration+test+and+chromosome+assay+of+human+spermatozoa.">A freezing and thawing method of hamster oocytes designed for both the penetration test and chromosome assay of human spermatozoa.</a> Mol. Reprod. Dev. 33, 202-209 (1992).</li><li>Biggers, J., McGuinnis, L. K., Raffin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+and+preimplantation+development+of+the+mouse+in+the+protein-free+KSOM.">Amino acids and preimplantation development of the mouse in the protein-free KSOM.</a> Biol. Reprod. 63, 281-293 (2000).</li></ol>

Avec ce protocole d&#39;ovocytes de hamster et d&#39;embryons de souris peuvent être cryoconservés avec succès. Une fois congelés, les ovocytes / embryons peuvent être conservés dans des cuves d&#39;azote liquide indéfiniment et récupérer à tout moment ou le lieu désiré. Ceci offre l&#39;avantage d&#39;avoir des échantillons de presque prêt à utiliser dès que nécessaire. D&#39;autre part, ce protocole peut également être utilisé pour générer cryobanques embryon à partir de souches de souris précieuses (telles que des...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>French type mini-straw 0.25 ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mini-tub</td>
<td>13407/0010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>hCG</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Farma-Lepori, Spain</td>
<td>749036.4</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>H-3884</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>KSOM-H medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ref. [11]</td>
</tr>
<tr>
<td>Liquid Nitrogen </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Air Liquide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic plugs</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mini-tub</td>
<td>19046</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PMSG</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Intervet, Spain</td>
<td>1.614/8447</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Propilenglycol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fluka</td>
<td>82280</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sucrose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Merck</td>
<td>107687</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Surgical Scissors</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Aesculap</td>
<td>BC-060R; BG-061R</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Thermo-sealer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>SIZ</td>
<td>220</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35 and 90 mm culture dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nunc</td>
<td>153066; 150350</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 ml tubes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Greiner Bio-one</td>
<td>163160</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Nitrogen tank</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>MVE, Cryogenics</td>
<td>XC 43/28</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Programmable Freezer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Planner Products Ltd.</td>
<td>Kryo-10 Series III</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Aesculap</td>
<td>BD-331R; BD-053R; OC-020R</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

collection and cryopreservation of hamster oocytes and mouse embryos

Les embryons et ovocytes ont d&#39;abord été cryoconservés avec succès plus de 30 ans, quand Whittingham<i&gt; Et al.</i&gt;<sup&gt; 1</sup&gt; Et Wilmut<sup&gt; 2</sup&gt; Décrits séparément que les embryons de souris pourrait être congelés et conservés à -196 ° C et, quelques années plus tard, Parkening<i&gt; Et al</i&gt;.<sup&gt; 3</sup&gt; Rapporté la naissance de descendants vivants résultant de la fécondation in vitro (FIV) des ovocytes cryoconservés. Depuis lors, l&#39;utilisation de techniques de cryopréservation s&#39;est propagé rapidement à devenir une composante essentielle dans la pratique de la procréation assistée et animale et à la conservation des ressources génétiques animales. Actuellement, il existe deux méthodes principales utilisées pour cryopréservation des ovocytes et des embryons: la congélation lente et la vitrification. Une grande variété d&#39;approches ont été utilisées pour tenter d&#39;améliorer à la fois techniques et des millions d&#39;animaux et des milliers d&#39;enfants sont nés à partir d&#39;embryons cryoconservés. Toutefois, d&#39;importantes lacunes liées à la cryoconservation ont encore à surmonter, puisque la formation de cristaux de glace, les effets de solution et un choc osmotique semble pas causer de plusieurs cryoinjuries en post-décongélation des ovocytes et des embryons. Congélation lente avec congélateurs programmables a l&#39;avantage d&#39;utiliser de faibles concentrations de cryoprotecteurs, qui sont généralement associés à la toxicité chimique et un choc osmotique, mais leur capacité à éviter la formation de cristaux de glace à de faibles concentrations est limitée. Congélation lente induit également des effets de surfusion qui doit être évité en utilisant le semis manuel ou automatique<sup&gt; 4</sup&gt;. Dans le procédé de vitrification, des concentrations élevées de cryoprotecteurs inhiber la formation de cristaux de glace et de conduire à la formation d&#39;un état vitreux vitrifiés dans lequel l&#39;eau est solidifiée, mais pas élargi. Toutefois, en raison de la toxicité des cyroprotectants aux concentrations utilisées, les ovocytes / embryons ne peuvent être exposées à la solution cryoprotecteur pour une période de temps très court et dans une solution de volume minimum, avant de plonger les échantillons directement dans l&#39;azote liquide<sup&gt; 5</sup&gt;. Dans la dernière décennie, la vitrification est devenu plus populaire parce qu&#39;il est une méthode très rapide dans lequel aucun équipement coûteux (congélateur programmable) est nécessaire. Cependant, la congélation lente continue à être la méthode la plus largement utilisée pour ovocyte / embryon cryoconservation. Dans cette vidéo, article, nous montrons, étape par étape, comment collecter et lentement gel des ovocytes de hamster avec des taux élevés de survie post-dégel. La même procédure peut également être appliquée avec succès gel et de dégel des embryons de souris à différents stades de développement préimplantatoire.

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Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

Dans cette vidéo, article, nous présentons une démonstration étape par étape sur la façon de recueillir et de cryopréservation des ovocytes de hamster avec des taux élevés de survie post-dégel. La même procédure peut également être appliquée avec succès gel et de dégel des embryons de souris à différents stades de développement préimplantatoire.

Collecte et cryoconservation des ovocytes de hamster et d&#39;embryons de souris

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse ...

collection-and-cryopreservation-of-hamster-oocytes-and-mouse-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

16.8K vues.  Universitat Autonoma de Barcelona. Dans cette vidéo, article, nous présentons une démonstration étape par étape sur la façon de recueillir et de cryopréservation des ovocytes de hamster avec des taux élevés de survie post-dégel. La même procédure peut également être appliquée avec succès gel et de dégel des embryons de souris à différents stades de développement préimplantatoire.

Vidéo: Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

Nuclear Transfer into Mouse Oocytes

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying development, differentiation and aging are epigenetic rather than genetic processes. The reversibility of these processes opens exciting perspectives in basic research, and in the more distant future, in regenerative medicine. In the mouse, embryonic stem cells can be derived from cloned preimplantation stage embryos. Such embryonic stem cells have the ability to give rise to all cell types of the adult organism. Importantly, these cells are genetically identical to the donor. If applicable to human, this would allow the derivation of stem cells from a patient. These cells could then be differentiated into the affected cell type of the patient and studied in vitro, or used to replace the damaged or missing cells. The study of nuclear transfer in the mouse remains important as it can inform us about the principles of nuclear reprogramming. This movie and the accompanying protocol are intended to help learning nuclear transfer in the mouse, a method initially developed in the group of Prof. Yanagimachi (WAKAYAMA et al. 1998).

This movie and the protocol are intended to help learning nuclear transfer.

Transfert nucléaire dans des ovocytes de la souris

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying ...

Recherche

Biologie

Dissection of 6.5 dpc Mouse Embryos

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell interaction and signaling mechanisms that guide embryonic patterning. However, dissection of the mouse embryo from the decidua shortly after implantation can be a challenging procedure, and detailed step-by-step documentation of this process is lacking.

Here we demonstrate how post-implantation (6.5 dpc) embryos are isolated by first dissecting the uterus of a pregnant mouse (detection of the vaginal plug was designated day 0.5 poist coitum) and subsequently dissecting the embryo from maternal decidua. The dissection of Reichert's membrane is described as well as the removal of the ectoplacental cone.

Isolation of postimplantation-stage embryos allows one to study gene patterning and analyze cell-lineage decision making processes during embryonic development, but proper dissection of the early embryo can be challenging. This protocol describes a method for isolating early primitive-streak-stage embryos (~6.5 days post coitum [dpc]).

Dissection de 6,5 embryons de souris DPC

Analysis of gene expression patterns during early stages of mammalian embryonic development can provide important clues about gene function, cell-cell ...

Retrieval of Mouse Oocytes

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus Genetic Stock Center (http://stkctr.biol.sc.edu), we are characterizing the salient differences needed to develop this system.  A primary goal has been to optimize oocyte/early embryo retrieval.

This protocol illustrates the technique for extracting oocytes or early-stage fertilized embryos from the oviduct of mice. The ability to identify the infindibulum and insert a blunt end needle into it is essential to correctly performing the procedure.

Récupération des ovocytes de souris

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus ...

In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors lining the walls of the lateral ventricle. This technique is now widely used to study the processes involved in corticogenesis by over-expressing or knocking down genes and observing the effects on cellular proliferation, migration, and differentiation. In comparison to traditional knockout strategies, in-utero electroporation provides a rapid means to manipulate a population of cells during a specific temporal window. In this video protocol we outline the experimental methodology for preparing mice for surgery, exposing the uterine horns through laporatomy, injecting DNA into the lateral ventricles of the developing embryo, electroporating DNA into the progenitors lining the lateral wall, and caring for animals post-surgery. Our laboratory uses this protocol for surgeries on E13-E16 mice, however, it is most commonly performed at E15, as shown in this video. 

En injection intraventriculaire Utero et l&#39;électroporation d&#39;embryons de souris E15

In-utero in-vivo injection and electroporation of the embryonic mouse neocortex provides a powerful tool for the manipulation of individual progenitors ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

L&#39;imagerie in vivo et des traitements thérapeutiques dans un modèle de souris orthotopique de cancer des ovaires

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Cryopreservation of Preimplantation Embryos of Cattle, Sheep, and Goats

Preimplantation embryos from cattle, sheep, and goats may be cryopreserved for short- or long-term storage. Preimplantation embryos consist predominantly of water, and the avoidance of intracellular ice crystal formation during the cryopreservation process is of paramount importance to maintain embryo viability. Embryos are placed into a hypertonic solution (1.4 &#x2013; 1.5 M) of a cryoprotective agent (CPA) such as ethylene glycol (EG) or glycerol (GLYC) to create an osmotic gradient that facilitates cellular dehydration. After embryos reach osmotic equilibrium in the CPA solution, they are individually loaded in the hypertonic CPA solution into 0.25 ml plastic straws for freezing. Embryos are placed into a controlled rate freezer at a temperature of -6&deg;C. Ice crystal formation is induced in the CPA solution surrounding the embryo, and crystallization causes an increase in the concentration of CPA outside of the embryo, causing further cellular dehydration. Embryos are cooled at a rate of 0.5&deg;C/min, enabling further dehydration, to a temperature of -34&deg;C before being plunged into liquid nitrogen (-196&deg;C). Cryopreserved embryos must be thawed prior to transfer to a recipient (surrogate) female. Straws containing the embryos are removed from the liquid nitrogen dewar, held in room temperature air for 3 to 5 sec, and placed into a 37&deg;C water bath for 25 to 30 sec. Embryos cryopreserved in GLYC are placed into a 1 M solution of sucrose for 10 min for removal of the CPA before transfer to a recipient (surrogate) female. Embryos cryopreserved in EG, however, may be directly transferred to the uterus of a recipient.

Preimplantation embryos may be cryopreserved after placement into a hypertonic cryoprotective solution to cause cellular dehydration. After equilibration, ice crystal formation is induced in the solution surrounding the embryo. Further dehydration occurs as the embryo is slowly cooled to subzero temperatures before plunging into liquid nitrogen for storage.

Cryoconservation d&#39;embryons pré-implantatoire de bovins, ovins et caprins

Preimplantation embryos from cattle, sheep, and goats may be cryopreserved for short- or long-term storage.  Preimplantation embryos consist predominantly ...

Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic modifications and the number is consistently increasing year by year. Its technical development started with slow freezing methods in the 1970s1, then followed by vitrification methods developed in the late 1980s2. Generally, the latter technique is advantageous in its quickness, simplicity, and high survivability of recovered embryos. However, the cryoprotectants contained are highly toxic and may affect subsequent embryo development. Therefore, the technique was not applicable to certain strains of mice, even when the solutions are cooled to 4&deg;C to mitigate the toxic effect during embryo handling. At the RIKEN BioResource Center, more than 5000 mouse strains with different genetic backgrounds and phenotypes are maintained3, and therefore we have optimized a vitrification technique with which we can cryopreserve embryos from many different strains of mice, with the benefits of high embryo survival after vitrifying and thawing (or liquefying, more precisely) at the ambient temperature4.
Here, we present a vitrification method for mouse embryos that has been successfully used at our center. The cryopreservation solution contains ethylene glycol instead of DMSO to minimize the toxicity to embryos5. It also contains Ficoll and sucrose for prevention of devitrification and osmotic adjustment, respectively. Embryos can be handled at room temperature and transferred into liquid nitrogen within 5 min. Because the original method was optimized for plastic straws as containers, we have slightly modified the protocol for cryotubes, which are more easily accessible in laboratories and more resistant to physical damages. We also describe the procedure of thawing vitrified embryos in detail because it is a critical step for efficient recovery of live mice. These methodologies would be helpful to researchers and technicians who need preservation of mouse strains for later use in a safe and cost-effective manner.

An ethylene glycol-based vitrification method for mouse embryos is described. It is advantageous to other methods in its simplicity and low embryonic toxicity, and therefore can be broadly applicable to many strains of mice, including inbred and gene-modified mice.

Cryoconservation d&#39;embryons de souris par base d&#39;éthylène glycol vitrification

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies. Many of these valuable animals exist only as live animals, with no backup plan in case of emergency. Cryopreservation of embryos can provide this backup, but is costly, can be a lengthy procedure, and generally requires a large number of animals for success. Since the discovery that mouse sperm can be successfully cryopreserved with a basic cryoprotective agent (CPA) consisting of 18&#37; raffinose and 3&#37; skim milk, sperm cryopreservation has become an acceptable and cost-effective procedure for archiving, distributing and recovery of these valuable strains.
 Here we demonstrate a newly developed I&bull;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Sperm from five commonly-used strains of inbred mice were frozen using this kit and then recovered. Higher protection ratios of sperm motility (&gt; 60&#37;) and rapid progressive motility (&gt; 45&#37;) compared to the control (basic CPA) were seen for sperm frozen with this kit in 5 inbred mouse strains. Two cell stage embryo development after IVF with the recovered sperm was improved consistently in all 5 mouse strains examined. Over a 1.5 year period, 49 GM mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&bull;Cryo kit and later recovered by IVF.

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&amp;middot;Cryo Kit

Here we demonstrate the newly developed I&#x2022;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Two-cell stage embryo development with frozen-thawed sperm was improved consistently in 5 mouse strains with the use of this kit. Over a 1.5 year period, 49 genetically modified mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&#x2022;Cryo kit and later successfully recovered by IVF.

Cryoconservation du sperme de souris et de récupération utilisant les I · Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Here, we present a protocol for specific siRNA-mediated mRNA depletion followed by immunofluorescence analysis to evaluate meiotic spindle assembly and organization in mouse oocytes. This protocol is suitable for in vitro depletion of transcripts and functional assessment of different spindle and/or MTOC-associated factors in oocytes.

Meiotic évaluation de la broche dans la souris ovocytes par silençage siRNA médiation

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

Single Cell Collection of Trophoblast Cells in Peri-implantation Stage Human Embryos

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a critical yet enigmatic biological event that has been historically difficult to study due to technical and ethical limitations. Implantation is initiated by the development of the trophectoderm to early trophoblast and subsequent differentiation into distinct trophoblast sublineages. Aberrant early trophoblast differentiation may lead to implantation failure, placental pathologies, fetal abnormalities, and miscarriage. Recently, methods have been developed to allow human embryos to grow until day 13 post-fertilization in vitro in the absence of maternal tissues, a time-period that encompasses the implantation period in humans. This has given researchers the opportunity to investigate human implantation and recapitulate the dynamics of trophoblast differentiation during this critical period without confounding maternal influences and avoiding inherent obstacles to study early embryo differentiation events in vivo. To characterize different trophoblast sublineages during implantation, we have adopted existing two-dimensional (2D) extended culture methods and developed a procedure to enzymatically digest and isolate different types of trophoblast cells for downstream assays. Embryos cultured in 2D conditions have a relatively flattened morphology and may be suboptimal in modeling in vivo three-dimensional (3D) embryonic architectures. However, trophoblast differentiation seems to be less affected as demonstrated by anticipated morphology and gene expression changes over the course of extended culture. Different trophoblast sublineages, including cytotrophoblast, syncytiotrophoblast and migratory trophoblast can be separated by size, location, and temporal emergence, and used for further characterization or experimentation. Investigation of these early trophoblast cells may be instrumental in understanding human implantation, treating common placental pathologies, and mitigating the incidence of pregnancy loss.

Here, we describe a method for warming vitrified human blastocysts, culturing them through the implantation period in vitro, digesting them into single cells and collecting early trophoblast cells for further investigation.

Collection à cellule unique de cellules trophoblastiques dans les embryons humains de stade de péri-implantation

Human implantation, the apposition and adhesion to the uterine surface epithelia and subsequent invasion of the blastocyst into the maternal decidua, is a ...