저자의 실험실에서 작품은 건강 연구의 캐나다 연구소, 혁신, 자연 과학 및 공학 연구위원회와 콩코디아 대학에 대한 캐나다 재단 후원됩니다.

diploid의 변종 구축 교배에 의해 diploids 생산을위한 프로토콜 <ol><li> 필요, 하나의 식민지를 생성하는 경우 초기 종자는 YPD, 또는 선택적 매체에 밖으로 명중한다. 두 h​​aploid 계통 반대 짝짓기 유형 (예 마타와 MATα)의해야합니다. </li><li> 멸균 접종 루프를 사용하면 두 개의 haploid 변종 중 하나에서 식민지의 일부를 선택하십시오. 새로운 YPD 판 연속 루프 한번 접시에 걸쳐 직선에서. 접시의 바닥에 화살표와 함께 행진의 방향을 표시합니다. </li><li> 같은 YPD 접시에 두 번째로 부담이 단계를 반복합니다. 처음으로이 시간은 탄력 콜로니 직각을 두 번째로 첫 번째 승리를 건너. 두 번째 줄무늬의 방향을 선택하고 두 번째 승리가 먼저 교차 영역을 확인합니다. diploids이 생성됩니다 어디에이 지역은 것입니다. </li><li> 30 ° C 하룻밤에 YPD 번호판을 품어. </li><li> 복제 판 선택 새로 형성된 diploids의 성장을 허용합니다 선택적 미디어에 YPD 판. </li><li> 하나의 식민지를 생성하기 위해 같은 선택적 매체에 하나의 식민지 가능한 경우, 또는 diploid 스트 리크와 행진의 일부를 선택하십시오. </li></ol> Sporulation 및 asci의 소화 프로토콜 <ol><li> 위의 접시에서 하나의 식민지를 선택하고 (1cm X 1cm) sporulation (SPO) 접시에 패치를 작게 만들고 sporulate에 3~7일 30 ° C에서 알을 품다. </li><li> Sporulation은 가벼운 현미경으로 각 패치의 세포를보고하여 확인하실 수 있습니다. 물을 5-10 μl의 현미경 슬라이드에 삽입 세포는 비말 위에 coverslip을 배치하고, asci의 존재를 찾으십시오. asci 쉽게 발견되지 않은 경우 다음 인큐베이터에 다시 넣어. </li><li> 패치 중 하나에 효과 sporulation가있다면, tetrad 주스의 100μL와 살균 15mL 원뿔 튜브를 준비합니다. </li><li> 멸균 3mm 접종 루프 (세포가 루프의 ¼을 커버한다) 및 tetrad 주스에서 개최이 sporulation 패치의 세포를 선택하십시오. 부드럽게 소용돌이 세포 솔루션과 루프와 혼합을 떨어져 수 있도록 루프를. </li><li> 4 - 상업 중심지 (zymolyase 및 변형 자체의 농도와 활동에 따라)에 대한 tetrad 주스 (zymolyase을 포함)에 둡니다. 이것은 ascospores를 둘러싼 세포 벽 소화를 위해 수 있습니다. </li><li> YPD 접시에 inoculum 지역의 상단과 하단을 표시합니다. </li><li> 선택 사항입니다. 반응은 차가운 얼음 살균 DH 2 O.의 1mL를 추가하여 막을 수 세포 5mins에 대한 해결하실 수 있습니다. 뜨는에서 제거 1mL 다음 손으로 가볍게 섞어 얼음 계속. </li><li> 5 단계에서 소화 세포 5μL를 타고 부드럽게 장소는 미리 표시 YPD 판의 inoculum 지역에서 일렬로 방울. </li><li> 간신히 한천과 접촉하는 동안 매우 부드럽게 라인 방울 1-3 시간을 확산하기 위해 멸균 3mm 접종 루프를 사용합니다. </li><li> (7 단계가 생략되면, 이것은 외부 세포 벽의 소화가 감소하거나 중단 될 때) 한천로 흡수하는 액체를 허용합니다. 해부 현미경으로 진행합니다. </li></ol> Asci의 해부 프로토콜 다음과 같은 프로토콜 가수 MSM 시스템 200 미세 현미경에 대한 설명입니다. 이 프로토콜은 이러한 자이스 혈구 micromanipulator MR로 수동 micromanipulator를 사용하는 경우 약간의 수정을 따라 수 있습니다. <ol><li> 필드의 절반이 세포를 포함하고 절반 비어있는 접시의 지역에 중점을두고 있습니다. 천천히 그것이 필드의 빈 영역을 만지는 것과 같은 초점에 바늘을 가지고. 이것은 바늘이 이전 사용의 세포를 포함하지 않도록합니다. 바늘과 한천 사이의 연락은 서서히 초점에 와서 어두운 블랙 서클으로 여겨진다. </li><li> 위치 A1에서 매트릭스로 이동하여 다시 한천을 천공하여 표시를합니다. 이것이 완성되기 전에 현미경을 촬영하는 경우에는 접시의 방향을 결정하는 것입니다. </li><li> 검색 모드로 전환합니다. asci를 찾습니다. 가급적 세포가 잘 밖으로 보급되어 지역에 asci를 선택합니다. 셀 클러스터와 지역을 피한다. asci에서 네 가지 ascospores은 아직도 서로에게 부착해야합니다. 두 ascospores은 다른 두보다 약간 클 수 있습니다. 한 ascospore 줄을과 ascospores의 나머지 부분에 연결되어 있지 asci을 채취하지 마십시오. </li><li> 바늘로 자낭을 선택하십시오. 천천히 접시에 바늘을 가져와. microneedle의 그림자가 보인다, 라인 자낭이 최대가 뽑힐 수 있습니다. 서클 (바늘 끝)의 검은 외곽선이 볼 때까지 다시는 바늘을 접근한다. 이 원형으로 tetrad을 터치하고 신속하게 거리에 바늘을 가져옵니다. 자낭에서 네 명 모두 ascospores가 바늘을 준수하고 추가 세포이 자낭의 일부가 아닌 microneedle에서 수집하지 않은 것을 가지고 있는지 확인합니다. </li><li> 멀리 접시에서 microneedle를 당겨와 매트릭스 (처음 자낭위한 이동로 이동위치 A1). 자낭이 이전 각 위치를 기록해 둡니다. microneedle과 접시를 감동 넷 모두 ascospores은 microneedle를 올 때까지 돌아서하여 자낭을 놓으십시오. 바늘을 암 또는 YPD 접시를 들고 플랫폼의 부드러운 감청이 단계에서 종종 유용합니다. </li><li> asci의 원하는 번호가 잡았 때까지 3-5 단계와 매트릭스에서 연속 위치에 자리 asci를 반복합니다. </li><li> 각각의 자낭에 다시 가서 부드럽게 플랫폼 또는이 둘의 조합을 도청, 바늘로 괴롭히고하여 분리 네 개의 세포를 휴식. 각각의 자낭 각 ascospore 네개가의 행을 분리 때까지 모체의 새로운 위치에 뒤에 하나를두고 세포를 선택하십시오. </li><li> ° C의 성장 패턴을 관찰하기 위해 몇 일 동안 30 인큐베이터에서 YPD 접시를 놓습니다. </li><li> 복제 플레이트 선택 매체 필요한 경우에 해부 세포. </li></ol> Zygotes의 이주 프로토콜 <ol><li> 하나의 식민지를 얻을 수있는 적절한 매체에 반대 짝짓기 유형 두 개의 haploid 종자 밖으로 승리. </li><li> 메이트이 두 계통은 위에서 설명한, 4 일에서 6 시간 (또는 야간 필요한 경우)에서 성장 수 있습니다. </li><li> 가벼운 현미경 zygotes 있는지 확인합니다. Zygotes 중 하나 또는 버드없이 아령 모양의 세포로 나타납니다. </li><li> 3mm 접종 루프 (세포가 루프의 ¼을 커버한다)와 세포를 들고 살균 DH 2 O.의 100μL에 부드럽게 장소 </li><li> YPD 접시에 inoculum 지역의 상단과 하단을 표시합니다. </li><li> 5μL 타고 부드럽게 장소는 미리 표시 YPD 판의 inoculum 지역에서 일렬로 방울. </li><li> 간신히 한천과 접촉하는 동안 매우 부드럽게 라인에 방울을 확산하기 위해 3mm 접종 루프를 사용합니다. </li><li> 액체 배지에 흡수하도록 허용합니다. 해부 현미경으로 진행합니다. </li><li> 필드의 절반이 세포를 포함하고 절반 비어있는 접시의 지역에 중점을두고 있습니다. 천천히 그것이 필드의 빈 영역을 만지는 것과 같은 초점에 바늘을 가지고. 이것은 바늘이 이전 사용의 세포를 포함하지 않도록합니다. 바늘과 한천 사이의 연락은 서서히 초점에 와서 어두운 블랙 서클으로 여겨진다. </li><li> 위치 A1에서 매트릭스로 이동하여 다시 한천을 천공하여 표시를합니다. 이것이 완성되기 전에 현미경을 촬영하는 경우에는 접시의 방향을 결정하는 것입니다. </li><li> 검색 모드로 전환합니다. 접합자를 찾습니다. </li><li> 바늘로 접합자를 선택하십시오. </li><li> 장소는 매트릭스에 개별적으로 zygotes. </li><li> zygotes 몇 일 동안 성장할 수 있습니다. </li><li> 적절한 선택 매체에 복제 판은 zygotes. </li></ol> 대표 결과 <img src="/files/ftp_upload/1146/1146fig1.jpg" alt="" /> 그림 1 : 반대 짝짓기 유형의 두 haploid 변종의 짝짓기는 diploid 변형을 생성합니다. <img src="/files/ftp_upload/1146/1146fig2.jpg" alt="" /> 그림 2 : 온도에 민감한 변형 (leu2 auxotrophy)와 야생 유형 스트레인 (LEU2) 사이에 짝짓기의 thre 결과 (A) YPD 플레이트. 소화 세포는 두 흑인 라인 사이의 두꺼운 성장을 볼 수 있습니다 왼쪽에있는 inoculum 지역에 보급하고 있습니다. 해부했습니다 Asci가 균일하게 오른쪽에 매트릭스의 간격 성장. (B) (A)의 접시는 SD - 류신 드롭 아웃 플레이트에 복제되었습니다. 확인 ascospore이 해부되었다 나타내는 LEU2 마커에 대한 2시 2분 성장을합니다. (C) (A)의 번호판은 YPD 접시에 복제와 37 ° C.에 incubated되었습니다 더 ascospore가 해부하는 것을 검증 2시 2분 성장을합니다.

<ol>
	<li>Sherman, F., Hicks, J., Guthrie, C., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micromanipulation+and+Dissection+of+Asci.">Micromanipulation and Dissection of Asci.</a> Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. , 21-37 (1991).</li></ol>

효모 해부 원하는 마커 새로운 변종을 선택하는 유용한 도구입니다. 네 ascospores의 이론적인 성장 패턴을 결정할 때 그것은 식물 세포의 유전자형 보는 것이 중요합니다. 플라스미드가 있으면이 ascospore (들)은 플라스미드를 받고 조작되는 변종에 대한 예측과 결론에 영향을 미칠 수있는 영향을 줄 수로가 하나의 낮은 또는 높은 복사하는 경우, 하나는 알고 있어야합니다. 일?...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Singer MSM System 200</td>
<td>Microscope</td>
<td>Singer Instruments</td>
<td>NA</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-sorbitol</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>SOR508</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>TRS001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Zymolyase 100T</td>
<td>Reagent</td>
<td>Seikagaku Corporation</td>
<td>120493</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast extract</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>YEX401</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Peptone</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>PEP 403</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-glucose</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>GLU501</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Yeast nitrogen base</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>YNB406</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bio-tryptone</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>TRP402</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium chloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>SOD002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Potassium acetate</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>POA 301</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Agar</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>AGR003</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Adenine sulfate</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>ADS201</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-uracil</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>URA 241</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-tryptophan</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>TRP 100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-histidine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>HIS 200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-arginine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Amresco</td>
<td>0877-100G</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-methionine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>MET 222</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-tyrosine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>TYR 333</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-isoleucine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>ISO 910</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-valine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>VAL 201</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-lysine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>LYS 101</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-phenylalanine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>PHA 302</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-glutamic acid</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>GLU 202</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-threonine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>THR002</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L-leucine</td>
<td>Reagent</td>
<td>BioShop</td>
<td>LEU 222</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

dissection of saccharomyces cerevisiae asci

효모는 다양한 세포 과정을 연구하는 데 사용되는 매우 다루기 쉬운 모델 시스템입니다. 일반적인 실험실 변형<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; haploid 또는 diploid 상태 중 하나에 존재합니다. 이 haploids에서 대립 유전자를 조합하는 능력과 게놈에 수정을 소개하는 능력은 asci의 생산과 절개를 필요로합니다. haploid 세포에서 Asci 생산 diploid의 변형을 만들어 호환 짝짓기 형식의 두 개의 효모 haploid의 종자의 짝짓기와 함께 시작됩니다. 이것은 고체 매체에 또는 액체 중 여러 가지 방법으로 수행할 수 있습니다. 그것은 선택적으로 haploid 변종 중 하나에 비해 자신의 성장을 촉진 매체 diploids을 선택에 유리합니다. diploids 그러면 asci, diploid의 meiotic 복제로 인한 사 haploid 딸 세포의 번들 형태로 영양분이 가난한 매체에 sporulate 수 있습니다. 식물 세포와 asci의 혼합물은 다음 asci의 ascospores를 둘러싼 막 색 멀리 소화 효소 zymolyase로 처리됩니다. 한 개인 asci를 선택하고 네 개의 ascopores 분리 및 재배치 수있는 해부 현미경 아래 microneedle과 미세 조작을 사용합니다. 해부 asci은 며칠 동안 성장하고 적절한 선택 매체에 복제 도금에 의해 관심의 표시 또는 대립 유전자에 대한 검사를하고 있습니다.

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Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

효모 세포의 미세 조작은 diploid의 zygotes을 선택 meiotic 유전 분석 또는 필요합니다. 이러한 micromanipulations은 해부 현미경의 microneedle를 사용하여 수행됩니다. microneedle는 세포를 재배치하는 데 사용됩니다 및 자동화의 다양한 학위와 함께 사용할 수 있습니다 micromanipulator에 의해 제어됩니다.

의 해부 Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

dissection-of-saccharomyces-cerevisiae-asci

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

18.5K 조회수.  Concordia University. 효모 세포의 미세 조작은 diploid의 zygotes을 선택 meiotic 유전 분석 또는 필요합니다. 이러한 micromanipulations은 해부 현미경의 microneedle를 사용하여 수행됩니다. microneedle는 세포를 재배치하는 데 사용됩니다 및 자동화의 다양한 학위와 함께 사용할 수 있습니다 micromanipulator에 의해 제어됩니다.

비디오: Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

지방산의 정량 Phosphoproteomics은 자극 Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

연구

생물학

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray 분석을위한 Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

효모에서 모니터링 Mitophagy을위한 형광 현미경 분석 Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

의 낭성 섬유증의 Transmembrane의 전도성 조절 단백질의 표현과 정제 Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

의 모니터링 단백질 접힘에 대한 결합 분석 실험<em&gt; 사카 cerevisiae의</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

로 표현 낭포 성 섬유증 막 횡단 전도력 규칙 단백질의 정제<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비시 애</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to identify and quantify the cofactors in their detectable redox state.
The technique is complementary to direct electrochemistry (voltammetry) approaches, as it does not offer information on electron transfer rates, but does establish the identity and redox state of the cofactors in the protein under study. The technique is widely applicable to any protein containing an electron paramagnetic resonance (EPR) detectable cofactor.
A typical titration requires 2 ml protein with a cofactor concentration in the range of 1-100 &#181;M. The protein is titrated with a chemical reductant (sodium dithionite) or oxidant (potassium ferricyanide) in order to poise the sample at a certain potential. A platinum wire and a Ag/AgCl reference electrode are connected to a voltmeter to measure the potential of the protein solution. A set of 13 different redox mediators is used to equilibrate between the redox cofactors of the protein and the electrodes. Samples are drawn at different potentials and the Electron Paramagnetic Resonance spectra, characteristic for the different redox cofactors in the protein, are measured. The plot of the signal intensity versus the sample potential is analyzed using the Nernst equation in order to determine the midpoint potential of the cofactor.

EPR Monitored Redox Titration of the Cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1

The goal of this protocol is to use electron paramagnetic resonance (EPR) monitored redox titrations to identify different cofactors of Saccharomyces cerevisiae Nar1. Redox titrations offer a very robust way to obtain midpoint potentials of different redox active cofactors in enzymes and proteins.

EPR은의 보조 인자 (cofactor)의 산화 환원 적정​​을 모니터링<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em&gt; Nar1

Electron Paramagnetic Resonance (EPR) monitored redox titrations are a powerful method to determine the midpoint potential of cofactors in proteins and to ...

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the correct amount of protein is synthesized for the cell&#8217;s specific growth conditions. One approach for measuring mRNA decay rates is inhibiting transcription and subsequently monitoring the disappearance of the already present mRNA. The rate of mRNA decay can then be quantified, and an accurate half-life can be determined utilizing several techniques. In S. cerevisiae, protocols that measure mRNA half-lives have been developed and include inhibiting transcription of mRNA using strains that harbor a temperature sensitive allele of RNA polymerase II, rpb1-1. Other techniques for measuring mRNA half-lives include inhibiting transcription with transcriptional inhibitors such as thiolutin or 1,10-phenanthroline, or alternatively, by utilizing mRNAs that are under the control of a regulatable promoter such as the galactose inducible promoter and the TET-off system. Here, we describe measurement of S. cerevisiae mRNA decay rates using the temperature sensitive allele of RNA polymerase II. This technique can be used to measure mRNA decay rates of individual mRNAs or genome-wide.

Measurement of mRNA Decay Rates in Saccharomyces cerevisiae Using rpb1-1 Strains

The steady state level of specific mRNAs is determined by the rate of synthesis and decay of the mRNA. Genome-wide mRNA degradation rates or the decay rates of specific mRNAs can be measured by determining mRNA half-lives. This protocol focuses on measurement of mRNA decay rates in Saccharomyces cerevisiae.

mRNA의 붕괴 요금의 측정에<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em사용&gt;<em&gt; rpb1-1</em&gt; 균주

mRNA steady state levels vary depending on environmental conditions. Regulation of the steady state accumulation levels of an mRNA ensures that the ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

화학 유전자 상호 작용의 신속한 식별<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

진화 방법에 감독<em&gt; 사카로 마이 세스 세레 비지에</em&gt; : 돌연변이 라이브러리 생성 및 검사

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...