Эта работа была поддержана грантом GM096076 из программы ОБЛАСТЬ NIH.

1. Подготовка мух для Dissection <ol><li> Anesthetize здоровых мух желаемого генотипа (например, выразив GFP-меченых белков), что меньше, чем неделю назад. Выберите 10-15 крупных самок с закругленными кремового цвета животы. </li><li> Передача выбранного мух и несколько (3-5) самцов флакон, содержащий новые слегка дрожжевой пищи и позволяют мух для откорма в течение двух дней при температуре 25 ° C. См. Вейль и др. 6. Подробности подготовки дрозофилы. Откорм мух гарантирует, что различные этапы, особенности этапов 8-12, будет доступна для работы с изображениями. Плохо откормленных или unfattened летит обычно содержат только очень ранней стадии (1-6) и зрелые (этап 14) ооцитов. </li></ol> 2. Подготовка ооцитов для визуализации с использованием прямой микроскоп соединения <ol><li> Подготовка стандартных предметное стекло путем проставления два покровных к слайду, примерно 1 см друг от друга с помощью силиконовых greasе. Используйте только смазки достаточно, чтобы обеспечить хорошее уплотнение между покровным и слайдов. Нажатие вниз твердо на каждом покровном будет распространяться смазки тонко и равномерно. Добавьте немного масла хладон 27 (Sigma) на стыке между покровные и слайдов. Они будут служить в качестве прокладки для предотвращения ранения изолированные ооцитов в последующих шагах. № 1.5 покровные работает хорошо, со средней толщиной (0.16-0.18 мм), что соответствует, что в последнее ооцитов стадии. </li><li> Место 2-3 капли масла хладон 27 на поверхности 22 мм 2 покровное. Для получения здоровых яйцеклеток возможно, особи женского пола удаляют из пищи флакон использованием рот пипеткой и аккуратно хранение в Галокарбоновое масло без предварительного обезболивающее. </li><li> Использование резкое диссекции (таких, как Дюмон № 5), контактный лету против покровное и снять кончике живота. Удалите яичники, перетаскивая их по поверхности покровного стекла, в соответствии с маслом. Это будет способствовать adhesioп ооциты покровное. </li><li> Аккуратно дразнят друг от друга яичников, ища ооцитов, что, по крайней мере этап 10B оогенеза. Яйцеклетки на данном этапе могут быть выявлены, глядя на яйца камеры, в которых яйцеклетки занимает по крайней мере 50-60% от общего объема яйца камеры. На данный момент в оогенеза, фолликул клеток вышележащих яйцеклетки стали столбчатые, и окружающие яйцеклетку со всех сторон, за исключением небольшой области, где подключение к медсестре клетки остаются. Используйте пинцет, чтобы удалить отдельные ооциты от яйцевая трубка оболочки. </li><li> Приступить, используя 1-3 самок, пока 5-8 неповрежденных ооциты были выделены на покровное. Удалите все непригодной ткани. </li><li> Аккуратно перевернуть покровное содержащих ооциты на заранее подготовленные слайды, так что ооциты расположены между двумя распорками. Не нажимайте на перевернутую покровное так как это повредит ооцитов. Если необходимо, добавьте небольшое количество галоидоуглеводородов нефти в тОн края &quot;сэндвич&quot;, чтобы обеспечить пространство заполнено. (Дополнительно:. Пусть слайд отдыха несколько минут для оседания покровное) слайд готова к визуализации. </li></ol> 3. Подготовка ооцитов для визуализации с использованием инвертированного микроскопа соединение <ol><li> Ооциты расчлененные по существу, как описано в разделе 2, за исключением того, что маленькие чашки Петри с вставкой со стеклянным дном (Маттек, 35 мм) используется вместо покровные. Это не является необходимым для покрытия образца, и после вскрытия, ткань может быть отображена непосредственно в блюда, но необходимо соблюдать осторожность для обеспечения ооциты остаются покрыты маслом и не высыхать. </li></ol> 4. Изображений живых <ol><li> Принесите яйцеклетки в фокус с помощью DIC или оптику фазового контраста и исследовать яйцеклетку на предмет повреждений, таких как утечки из цитоплазмы, или выпячивание фолликула клетками. Изображение только ооциты, которые появляются здоровые и неповрежденные. </li><li> StreaМина может контролироваться напрямую, без необходимости для маркировки GFP, так как желток пузырьков в цитоплазме находятся аутофлуоресцентной 7. Этот сигнал может быть захвачен в FITC диапазоне масштабов, но, вероятно, потребуется большее усиление параметров, чем те, которые используются для GFP-меченых белков. </li><li> Лучшие изображения потокового получаются из оптического разделы, которые чуть ниже поверхности яйцеклетки, которые упираются в стекло покровное / Петри стекла. Здесь ооцит слегка сплюснутый, что делает для лучшего плоскости фокуса. Изображения могут быть захвачены на 200X - 1000 X. Использование договоренности, описанные здесь, воздушные цели должны быть использованы, так как покровное образует барьер между ооцитов и объективным. Это является оптимальной, поскольку это значительно снижает дрейф и перемещение образца. </li><li> После того, как область интереса находится в фокусе, выключите brighfield оптики и перейти к конфокальной микроскопии. С помощью быстрого сканирования / функция предварительного просмотра программного обеспечения, настройки фокуса и получитьпо мере необходимости. </li><li> Настройки для захвата будет варьироваться от микроскопа, чтобы микроскопом, но общие параметры таковы: Используйте возбуждения волны ~ 488 нм и длине волны излучения ~ 515 нм. Настройка Z-оси захвата, так что Z-оси остается постоянной, с отставанием в 10 секунд между кадрами. Захват тестовую последовательность из 5-10 кадров для обеспечения яйцеклетки является стационарным и плоскости фокуса является целесообразным. </li><li> Типичная последовательность промежуток времени будет фиксировать между 20 - 50 кадров, и могут быть просмотрены сразу же после завершения оценки качества видео. Этот процесс может быть повторен для других клеток в слайд или дополнительного женщин можно разрезать по мере необходимости. </li></ol> 5. Устранение неполадок и общие проблемы <ol><li> Drift - При использовании прямого микроскопа, клетки иногда могут дрейфовать в связи с распространением нефти. Это может быть сведено к минимуму, используя только достаточно нефти, чтобы покрыть площадь под покровное. Если проблема не устранена, используйте меньше силиконовые гrease, чтобы прикрепить прокладки на слайд. </li></ol> Примечание: Некоторые конфокальной программные пакеты позволяют клетке слежения, но в целом он лучше отказаться от изображения дрейфующих ооцитов и вместо этого использовать другого образца. <ol start="2"><li> Никаких признаков потокового - Если потоковых не очевидно, вполне вероятно, связано с одной из двух причин: либо фокальной плоскости для захвата изображения не является правильным (как правило, слишком глубоко внутрь яйцеклетки) или яйцеклетки повреждены. Время и практика может свести к минимуму и ошибок. </li></ol>

<ol>
	<li>Becalska, A. N., Gavis, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lighting+up+mRNA+localization+in+Drosophila+oogenesis.">Lighting up mRNA localization in Drosophila oogenesis.</a> Dev. 136, 2493-2503 (2009).</li><li>He, L., Wang, X., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shining+light+on+Drosophila+oogenesis:+Live+imaging+of+egg+development.">Shining light on Drosophila oogenesis: Live imaging of egg development.</a> Curr. Opin. Gen. Dev. 21, 612-619 (2011).</li><li>King, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Ovarian development Drosophila melanogaster. , (1970).</li><li>Spradling, A. C., Bate, M., Martinez-Arias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+genetics+of+oogenesis.">Developmental genetics of oogenesis.</a> The Development of Drosophila melanogaster. 1, 1-70 (1993).</li><li>Serbus, L. R., Cha, B. -. J., Theurkauf, W. E., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynein+and+the+actin+cytoskeleton+control+kinesin-driven+cytoplasmic+streaming+in+Drosophila+oocytes.">Dynein and the actin cytoskeleton control kinesin-driven cytoplasmic streaming in Drosophila oocytes.</a> Dev. 132, 3743-3752 (2005).</li><li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+Individual+Drosophila+Egg+Chambers+for+Live+Imaging.">Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging.</a> J. Vis. Exp. (60), e3679 (2012).</li><li>Theurkauf, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+microtubule-dependent+cytoplasmic+streaming+in+cappuccino+and+spire+mutant+oocytes.">Premature microtubule-dependent cytoplasmic streaming in cappuccino and spire mutant oocytes.</a> Science. 265, 2093-2096 (1998).</li><li>Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein+trap+strategy+to+detect+GFP-tagged+proteins+expressed+from+their+endogenous+loci+in+Drosophila.">A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila.</a> PNAS. 98, 15050-15055 (2001).</li><li>R&#246;per, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rtnl1+is+enriched+in+a+specialized+germline+ER+that+associates+with+ribonucleoprotein+granule+components.">Rtnl1 is enriched in a specialized germline ER that associates with ribonucleoprotein granule components.</a> J. Cell Sci. 120, 1081-1092 (2007).</li><li>Pokrywka, N. J., Payne-Tobin, A., Raley-Susman, K. M., Swartzman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules,+the+ER+and+Exu:+New+associations+revealed+by+analysis+of+mini+spindles+mutations.">Microtubules, the ER and Exu: New associations revealed by analysis of mini spindles mutations.</a> Mech. Dev. 126, 289-300 (2009).</li><li>Petri, W. H., Mindrinos, M. N., Lombard, M. F., Margaritis, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+development+of+the+Drosophila+chorion.ih+a+chemically+defined+organ+culture+medium.">In vitro development of the Drosophila chorion.ih a chemically defined organ culture medium.</a> Wilhelm Roux's Arch., Devl. Biol. 186, 351-362 (1979).</li></ol>

Мне нечего раскрывать.

Drosophila ооциты являются универсальными модель системы для решения различных вопросов, связанных с функцией и организации клеток и субклеточных компонентов. Полное понимание функции белка требует мониторинга как пространственные, так и временные аспекты поведения белков. Достижения в обеих системах визуализации и генетических инструментов, доступных для Drosophilists сделать его возможным даже для небольших лабораторий для выполнения высоким качеством изображения экспериментов в живой ооцитов. Здесь я изложить протокол анализа поведения GFP с метками или аутофлуоресцентной белков и сооружений в середине-конце оогенеза, который может быть использован в сочетании с различным генетическим фоном для исследования функции белка. В этом протоколе я опишу процесс, посредством которого ооциты готовы для работы с изображениями и основные конфокальной параметров, которые позволят приобретение промежуток времени видео флуоресцентных белков и сооружений. Дополнительная DetaiЛ. С. О подготовке яйцеклетки описываются Вейль и др. 6. широкий спектр лету штаммов экспрессии белков, которые были эндогенно отмеченных через экзон-захвата доступны 8, и бесконечно больше вариантов белка может быть спроектирован и вновь, чтобы мухи. При работе с живой тканью, здоровье образцов имеет первостепенное значение. Яйцо камер со сцены 10B может завершить оогенеза в основном автономно 11, что делает их идеальными для краткосрочных исследованиях изображениями. Необходимо соблюдать осторожность на нескольких ключевых шагов, чтобы получить данные высокого качества. Во время рассечения важно, чтобы манипулировать яичников и ооциты как можно меньше, и свести к минимуму количество времени между вскрытие и завершения обработки изображений. В идеале, небольшая станция вскрытие должно быть расположено в том же помещении, где находится конфокальной области, и только несколько камер яйца в то время, должны быть отображены. Число рекомендуется здесь (5-8) Гарантирует, что рассечение время сведены к минимуму при максимальной вероятность получения хорошего качества изображения. Я рекомендую захватить небольшую серию фотографий для оценки качества изображения и убедиться, что захват настройки оптимизированы, прежде чем захватить больше последовательности промежуток времени. Большая часть программного обеспечения позволяет отдельным кадрам, чтобы спастись, и эти изображения могут быть проанализированы различные способы использования ImageJ 12 или другого программного обеспечения.

<table border="1"><tbody><tr><td> Имя </td><td> Компания </td><td> Номер в каталоге </td><td> Комментарии </td></tr><tr><td> Хладон нефти 27 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H8773-100ML </td><td></td></tr><tr><td> # 5SF щипцы </td><td> Средства изобразительных наук </td><td> 11252-00 </td><td></td></tr><tr><td> Силиконовая смазка </td><td> Sigma Aldrich </td><td> Z273554-1шт </td><td></td></tr><tr><td> Стекло-дно чашки Петри </td><td> Маттек </td><td> P35G-0-20-C </td><td></td></tr></tbody></table>

live imaging of gfp-labeled proteins in drosophila oocytes

Ооцита дрозофилы была создана как универсальная система для исследования фундаментальных вопросов, таких как функция цитоскелета, клеточной организации, и органелл структуры и функции. Наличие различных GFP-меченных белков означает, что многие клеточные процессы можно наблюдать в живых клетках в течение нескольких минут или часов, и с помощью этой методики, процессы, такие как RNP транспорта, эпителиальный морфогенез, и ткань реконструкции были описаны в мельчайших подробностях в 1,2 Drosophila ооцитов. Способность выполнять видео изображения в сочетании с богатым репертуаром мутантов позволяет огромное разнообразие генов и процессов, которые будут рассмотрены в невероятных деталях. Одним из таких примеров является процесс ooplasmic поток, который инициирует в середине оогенеза 3,4. Это энергичные движения цитоплазматических пузырьках является микротрубочек и кинезин зависит от 5 и предоставляет полезную системытемпература для исследования функции цитоскелета на этих стадиях. Здесь я представляю протокол промежуток времени изображение жизни ооцитов, используя практически любые конфокальной микроскопии установки.

Визуализация GFP-меченых белков будет меняться в зависимости от того, как сильно отмеченных белок экспрессируется. В середине стадии ооцита reticulon выражения типа 1 (Rtnl-1), экзон с меткой GFP 8,9 дает сильный сигнал. Rtnl-1 представляется ко-локализуются с длинными микротрубочек присутствовать при ooplasmic потоковое 10 (рис. 1А). Rtnl-1 является хорошим маркером для наблюдения потоков, а также индикатор организации микротрубочек в конце ооцитов стадии. Ooplasmic потоковое в камере яйца дикого типа является очевидным, как заметное движение аутофлуоресцентной пузырьки желтка при использовании скорости захвата одного кадра каждые 10 секунд (рис. 1б). Максимальная проекция пять кадров могут быть получены наметить пути движущихся пузырьков. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/50044/50044fig1.jpg" /> Рисунок 1. Жить изображений и autoflлюминесцентные и GFP с метками структур.) одного покадровой образ этап 11 ооцитов выражения Rtnl1-GFP на 400X. Rtnl1-GFP волокон двигаться с волнообразным движением в потоковом ооцитов. B) пять проекции максимальной рамках этапа 10B камеру яйцо, в котором желток аутофлуоресцентной пузырьки были обследованы каждые 10 сек в течение 50 сек общем, на 400X увеличение. Шкала бар = 30 мкм

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes at JoVE.com

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Протокол для живых изображений GFP-меченных белков или аутофлуоресцентной структур в отдельных<em&gt; Drosophila</em&gt; Ооцитов описано.

Жить Визуализация GFP-меченых белков в<em&gt; Drosophila</em&gt; Ооцитов

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

live-imaging-of-gfp-labeled-proteins-in-drosophila-oocytes

Research

JoVE Journal

Biology

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

11.2K Views.  Vassar College. Протокол для живых изображений GFP-меченных белков или аутофлуоресцентной структур в отдельных Drosophila Ооцитов описано.

Video: Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

Живая изображений глиальных миграции клеток в диск дрозофилы глаз имагинальных

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

Подготовка Drosophila Эмбрионы для Live-визуализации с использованием висячей капли протокола

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Живая съемка Дрозофилы Эмбриональные миграции гемоцитов

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

Флуоресцентная маркировка COS-7 выражая SNAP-теги Белки Fusion для живых изображений сотовый

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Подготовка Разработка и взрослых Drosophila Мозги и сетчатки для живых изображений

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

Изображениями сотовый изменения формы в живых Drosophila Эмбрионы

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, cell differentiation and organogenesis 1. Correct preparation of the experimental samples is a crucial, often neglected, step. The goal of preparation is to ensure physiological relevance and to establish optimal imaging conditions. To maintain tissue viability, it is critical to avoid dehydration, hypoxia, overheating or medium deterioration 2. 
 The Drosophila egg chamber is a well established system for examining questions relating, but not limited, to body patterning, mRNA localization and cytoskeletal organization 3,4. For early- and mid-stage egg chambers, mounting in halocarbon oil is good for survival in that it allows free diffusion of oxygen, prevents dehydration and hypoxia and has superb optical properties for microscopy. Imaging of fluorescent proteins is possible through the introduction of transgenes into the egg chamber or physical injection of labeled RNA, protein or antibodies 5-7. For example, addition of MS2 constructs to the genome of animals enables real time observation of mRNAs in the oocyte 8. These constructs allow for in vivo labeling of mRNA through utilization of the MS2 bacteriophage RNA stem loop interaction with its coat protein 9. 
 Here, we present a protocol for the extraction of ovaries as well as isolating individual ovarioles and egg chambers from the female Drosophila. For a detailed description of Drosophila oogenesis see Allan C. Spradling (1993, reprinted 2009) 10.

Preparing Individual Drosophila Egg Chambers for Live Imaging

The Drosophila egg chamber is an excellent model for studying the mechanisms of mRNA localization. In order to capture the dynamic events that underpin the processes of localization, rapid high resolution imaging of live tissue is required. Here, we present a protocol for dissection and imaging of live samples with minimal disruption.

Подготовка индивидуальных Drosophila Яйцо палат для работы с изображениями Онлайн

Live cell imaging is an important technique applied to a number of Drosophila tissues used as models to investigate topics such as axis specification, ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate mutations and chromosomal aberrations1. To prevent this trauma from catalyzing genomic instability, it is crucial for cells to detect DSBs, activate the DNA damage response (DDR), and repair the DNA. When stimulated, the DDR works to preserve genomic integrity by triggering cell cycle arrest to allow for repair to take place or force the cell to undergo apoptosis. The predominant mechanisms of DSB repair occur through nonhomologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR) (reviewed in2). There are many proteins whose activities must be precisely orchestrated for the DDR to function properly. Herein, we describe a method for 2- and 3-dimensional (D) visualization of one of these proteins, 53BP1.
The p53-binding protein 1 (53BP1) localizes to areas of DSBs by binding to modified histones3,4, forming foci within 5-15 minutes5. The histone modifications and recruitment of 53BP1 and other DDR proteins to DSB sites are believed to facilitate the structural rearrangement of chromatin around areas of damage and contribute to DNA repair6. Beyond direct participation in repair, additional roles have been described for 53BP1 in the DDR, such as regulating an intra-S checkpoint, a G2/M checkpoint, and activating downstream DDR proteins7-9. Recently, it was discovered that 53BP1 does not form foci in response to DNA damage induced during mitosis, instead waiting for cells to enter G1 before localizing to the vicinity of DSBs6. DDR proteins such as 53BP1 have been found to associate with mitotic structures (such as kinetochores) during the progression through mitosis10.
In this protocol we describe the use of 2- and 3-D live cell imaging to visualize the formation of 53BP1 foci in response to the DNA damaging agent camptothecin (CPT), as well as 53BP1's behavior during mitosis. Camptothecin is a topoisomerase I inhibitor that primarily causes DSBs during DNA replication. To accomplish this, we used a previously described 53BP1-mCherry fluorescent fusion protein construct consisting of a 53BP1 protein domain able to bind DSBs11. In addition, we used a histone H2B-GFP fluorescent fusion protein construct able to monitor chromatin dynamics throughout the cell cycle but in particular during mitosis12. Live cell imaging in multiple dimensions is an excellent tool to deepen our understanding of the function of DDR proteins in eukaryotic cells.

This protocol describes a method for visualizing a DNA double-strand break signaling protein activated in response to DNA damage as well as its localization during mitosis.

Двух-и трехмерных изображений живых клеток ДНК, белков реакции на повреждения

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

Живая съемка апоптоза клеток во время акции<em&gt; Drosophila</em&gt; Эмбриогенеза

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Прижизненные микроскопия для визуализации субклеточных структур в живых мышей, экспрессирующих флуоресцентные белки

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...