Подготовьте животных к анализу на наследование РНК-интерференции, выбрав трех или четырех взрослых особей Caenorhabditis elegans под стандартными 35-миллиметровыми планшетами NGM, засеянными бактериями OP50-1. Через четыре дня смойте взрослых червей с пластин в пробирки объемом 1,5 миллилитра, используя 800 микролитров буфера M9 с добавлением Triton X-100. Повторите промывку и стяните червей в одну трубочку.
После центрифугирования червей при 1000 G в течение 1,5-2 минут аспирируйте надосадочную жидкость, оставляя 100 микролитров, не нарушая гранулы червя. В каждую трубку, содержащую гранулу червя, добавьте 650 микролитров дважды дистиллированной воды. Чтобы выделить эмбрионы C.elegans из собранной популяции, добавьте 250 микролитров свежеприготовленного отбеливающего раствора и запустите таймер.
Каждые одну-две минуты тщательно прокручивайте трубки. Через пять минут следите за деградацией взрослых червей под стереоскопом. Продолжайте вортексинг до тех пор, пока черви полностью не растворятся и не останутся только эмбрионы.
Обычно это занимает от шести до семи минут. Немедленно центрифугируйте пробирки при 1000 G в течение 1,5 минут и отсасывайте надосадочную жидкость, оставляя примерно от 50 до 100 микролитров надосадочной жидкости вместе с эмбрионами. Добавьте один миллилитр буфера М9 с добавлением Triton X-100 в зародыши и вихрь.
Центрифугируйте суспензию и повторите промывку два раза. После окончательной промывки отсадите надосадочную жидкость и оставьте в пробирке примерно 100 микролитров. Закрутите пробирки с выделенными эмбрионами и дважды нанесите пипеткой по два микролитра из каждой пробирки на предметное стекло с маркировкой.
Подсчитайте эмбрионы с помощью счетчика, чтобы оценить концентрацию эмбрионов на микролитр. Чтобы начать полусинхронизированный рост популяции, перенесите примерно 250 эмбрионов на каждую пластину РНК-интерференции NGM, содержащую бактерии E.coli HT115 с GFP или контрольными векторами РНК-интерференции. Дайте жидкости впитаться.
Инкубируйте поколение P nought, обработанное РНК-интерференцией, в течение четырех дней при температуре 21 градус Цельсия.
