Забор ооцитов зародышевых везикул из яичников мышей с CD-1 и индукция двухцепочечных разрывов ДНК

Для начала приготовьте капли M2 IBMX Medium в пластиковой чашке для культуры тканей и поместите чашку на горячий блок при температуре 37 градусов Цельсия не менее чем за 30 минут до выделения ооцитов. Препарируйте яичники усыпленных мышей и поместите их в пятимиллилитровую пробирку с круглым дном с M2 IBMX. Переложите яичники в пластиковую крышку, содержащую 1,5 миллилитра M2 IBMX.

Удалите всю периовариальную жировую ткань или сегменты фаллопиевых труб и освободите кумулюсные комплексы ооцитов путем механической перфорации яичников иглой 27 калибра. Перенесите кумулюсные комплексы ооцитов в чашку для культуры с каплями M2 IBMX. И удаляют кумулюсные клетки путем повторного пипетирования с помощью узкой стеклянной пастбищной пипетки.

Выберите окруженное ядро зародышевого везикулы или ооциты стадии GV, и перенесите их в каплю среды M2 IBMX на горячий блок при температуре 37 градусов Цельсия в защищенном от света месте. После индуцирования двухцепочечных разрывов с помощью этопозида поместите ооциты стадии GV в капли генотоксического агента на один час на горячий блок в темноте. Добавьте капли питательной среды M16 с добавлением 400 микромоляров IBMX в ооциты, чтобы они были задержаны в течение длительного периода времени.

Поместите ооциты в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.