אנו מודים על תמיכה בעבודה זו מהפרויקט "הקמת תשתיות 'בניית יכולות' במחקר ביו-רפואי (BIOMED-20)" (MIS 5047236), המיושם במסגרת הפעולה "חיזוק תשתית המחקר והחדשנות", במימון התוכנית האופרטיבית "תחרותיות, יזמות וחדשנות" (NSRF 2014-2020), ובמימון משותף של יוון והאיחוד האירופי (הקרן האירופית לפיתוח אזורי).

כל ניסויי העכברים אושרו על ידי הרשויות המקומיות (אזור יואנינה, יוון) ונערכו בהתאם להנחיות מועצת הקהילות האירופית 2010/63/EU. ניסויים נערכו ביחס לעקרונות של 3Rs. כל עכברי CD-1 ששימשו לניסויים הוחזקו במתקן בית החיות של אוניברסיטת יואנינה, יוון, בחדר עם טמפרטורה מבוקרת (22 מעלות צלזיוס) ולחות (60%) והוזנו אד ליביטום. לבית החיות רישיון להפעלת מתקן לרבייה (EL33-BIObr01), אספקה (EL33-BIOsup01) וניסויים (EL33BIO-exp01).
1. הכנת ריאגנטים
<ol><li>יש לדלל אבקת 3-איזובוטיל-1-מתיל-קסנטין (IBMX) (ראו טבלת חומרים) בדימתיל סולפוקסיד (DMSO) (ראו טבלת חומרים) לריכוז סופי של 200 מילימול. Μake 10 μL aliquots, ולאחסן ב -20 ° C. השתמש בפתרון תוך חודש. הערה: אבקת IBMX נשמרת בטמפרטורה של -20°C.</li>
	<li>הכינו את כל מאגרי האימונופלואורסנציה ואחסנו אותם ב -4 מעלות צלזיוס.<ol><li>הכינו מלח סטרילי חוצץ פוספט (PBS) על ידי דילול טבלית PBS אחת (ראו טבלת חומרים) ב-200 מ"ל של ddH2Ο.</li>
		<li>צור מאגר PHEM על ידי הוספת 80 מ"ל של ddH 2 Ο, 0.59575 גרם HEPES, 1.81422 גרם של PIPES, 0.38035 גרם של EGTA ו- 0.04066 גרם של MgCl2(ראה טבלת חומרים) תוך כדי התסיסה עם מערבל מגנטי (ראה טבלת חומרים), ובמקביל הוסף NaOH (ראה טבלת חומרים) עד שה- pH מגיע ל- 6.9 (בדוק באמצעות מד pH/ORP [ראה טבלת חומרים]). לאחר מכן, הוסף ddH2Ο לנפח סופי של 100 מ"ל.</li>
		<li>הכינו חיץ פרפורמאלדהיד-טריטון-X-100 (PFA-Tx-100) על ידי דילול אבקת PFA (ראו טבלת חומרים) במאגר PHEM תוך כדי התסיסה עם מערבל מגנטי תחת חימום בריכוז סופי של 4% PFA. לאחר מכן, סנן את המאגר באמצעות מזרק ומסנן 0.2 מיקרומטר (ראה טבלת חומרים), והוסף 0.5% Tx-100 (ראה טבלת חומרים). להכין כ 10 מ"ל של PFA-Tx-100 (0.4 גרם של PFA, 50 μL של Tx-100), וזה מספיק עבור ניסוי אחד. יש לאחסן אותו בטמפרטורה של 4°C למשך שבוע אחד לכל היותר. אזהרה: יש ללבוש כפפות לטיפול ב-PFA, ולהימנע ממגע עם העור והעיניים.</li>
		<li>הכינו את חיץ הכביסה על ידי הוספת אלבומין בסרום בקר (ריכוז סופי: 0.5% w/v BSA) (ראו טבלת חומרים) ב-PBS, והתסיסו באופן מכני. יש להוסיף חיץ 10% w/v NaN3 (נתרן אזיד) בדילול של 1:1,000 כדי למזער את הסיכון לזיהום פטרייתי וחיידקי. צור חיץ של 10% w/v NaN 3 על ידי הוספת 1 גרם של אבקת NaN3 (ראה טבלת חומרים) ל- 10 מ"ל של ddH2O; יש לאחסן את מאגר NaN3 בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>הכן את מאגר החסימה על ידי הוספת BSA (ריכוז סופי: 3% w/v) ב- PBS ותסיסה מכנית. הוסף חיץ NaN3 של 10% בדילול של 1:1,000.</li>
	</ol></li>
</ol>2. איסוף ביציות GV משחלות מנותחות והשראת DSB
הערה: כל הכלים והפתרונות צריכים להיות סטריליים. הטיפול בביציות מתבצע באמצעות פיפטה בפה תחת מיקרוסקופ סטריאו (ראו טבלת חומרים), וכל הטיפות מכוסות בשמן מינרלי (ראו טבלת חומרים ואיור 1E).
<ol><li>יש להזריק לעכברים תוך צפקית 7 יחידות בינלאומיות (IU) של גונדוטרופין בסרום של סוסה הרה (PMSG) (ראה טבלת חומרים) 46-48 שעות לפני הדחת העכברים על ידי פריקת צוואר הרחם. הערה: כל העכברים המשמשים צריכים להיות בני 8-12 שבועות.</li>
	<li>סנן מדיום תרבית M2 (ראה טבלת חומרים) עם מזרק ומסנן 0.2 מיקרומטר, והוסף IBMX 200 מילימטר לריכוז סופי 200 מיקרומטר בצינור עגול בעל תחתית עגולה של 14 מ"ל (ראה טבלת חומרים) כדי לשמור על הביציות נעצרות בשלב I. לאחר מכן, הכינו טיפות של מדיום M2-IBMX בכלי תרבית רקמת פלסטיק (ראו טבלת חומרים), והניחו אותו על בלוק חם (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות לפחות לפני בידוד הביציות. אחסן את M2 בטמפרטורה של 4°C.</li>
	<li>הקריבו את העכברות על ידי פריקת צוואר הרחם, נתחו את השחלות, והניחו אותן בצינור תחתון עגול של 5 מ"ל (ראו טבלת חומרים) עם M2-IBMX.</li>
	<li>להעביר את השחלות למכסה פלסטיק המכיל 1.5 מ"ל של M2-IBMX, להסיר כל רקמת שומן פרי-שחלתית או מקטעי חצוצרות, ולשחרר את COC על ידי ניקוב מכני של השחלות עם מחט 27 G (ראה טבלת חומרים ואיור 1A-C).</li>
	<li>מעבירים את COC לצלחת תרבית עם טיפות של M2-IBMX (בערך 25-30 μL כל אחד), ולהסיר את תאי הקומולוס על ידי פיפט חוזר באמצעות פיפטה פסטר זכוכית צרה (ראו טבלת חומרים ואיור 1D).</li>
	<li>בחרו ביציות בשלב SN GV, והעבירו אותן בטיפה (25 μL) של תווך M2-IBMX על בלוק חם ב-37°C המוגן מפני אור (איור 1F).<ol><li>חפשו ביציות SN בהתבסס על גודלן הגדול יותר והגרעינים הממוקמים במרכז בניגוד לביציות NSN, בהן הגרעינים ממוקמים באופן היקפי21. בכל מקרה, התבונן בתצורת ה- DNA תחת מיקרוסקופ קונפוקלי לפני קבלת ההחלטה הסופית לגבי סוג הביציות GV (SN או NSN).</li>
	</ol></li>
	<li>השראת DSB באמצעות אטופוסיד (ראה טבלת חומרים). הניחו את הביציות בשלב GV בטיפות (25 μL כל אחת) של החומר הגנוטוקסי למשך שעה אחת על הבלוק החם בטמפרטורה של 37°C בתנאים חשוכים. הערה: Etoposide הוא מעכב topoisomerase II המציג DSB ל- DNA22. שמור את etoposide ב 10 μL aliquots של 20 מ"ג / מ"ל בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור. הריכוזים שנבדקו הם 5 מק"ג/מ"ל, 20 מק"ג/מ"ל ו-50 מק"ג/מ"ל.</li>
	<li>כדי לשמור על הביציות בשלב GV עצורות לתקופה ממושכת, הניחו את הביציות בטיפות של מדיום תרבית M16 (ראו טבלת חומרים) בתוספת 400 מיקרומטר IBMX באינקובטור (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2. אחסנו את M16 בטמפרטורה של 4°C, סננו את המדיום בעזרת מזרק ומסנן 0.2 מיקרומטר, ודגרו עליו לפחות שעה אחת לפני השימוש.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65494/65494fig01.jpg"> איור 1: תהליך בידוד ביציות . (A) הסרת רקמת שומן פרי-שחלתית ושאריות מקטעי חצוצרה משחלות בתווך M2 עם IBMX. התצלום מתקבל דרך עיניות המיקרוסקופ הסטריאופוני. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. (B) שחלות מבודדות בתווך M2 עם IBMX. התמונה התקבלה דרך עיניות המיקרוסקופ הסטריאופוני. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. (C) ניקוב מכני של השחלות באמצעות מחט 27 G בתווך M2 עם IBMX. התמונה התקבלה דרך עיניות המיקרוסקופ הסטריאופוני. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. (D) COC המשתחררים מהשחלות לאחר ניקוב בתווך M2 עם IBMX. התמונה התקבלה דרך עיניות המיקרוסקופ הסטריאופוני. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (E) איסוף ביציות באמצעות פיפטה בפה. (F) ביציות דנודיות, לאחר הסרת תאי הקומולוס שמסביב, בתווך M2 עם IBMX. התמונה התקבלה דרך עיניות המיקרוסקופ הסטריאופוני. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65494/65494fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
3. קיבוע ביציות ואימונופלואורסנציה
הערה: הטיפול בביציות מתבצע באמצעות פיפטה בפה תחת מיקרוסקופ סטריאו, וכל הטיפות מכוסות בשמן מינרלי.
<ol><li>הניחו את ביציות GV המטופלות בבקרה וטופוזיד בצלחות תרבית פלסטיק שונות עם חיץ PFA-Tx-100 למשך 40 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>שטפו את הביציות בשלוש טיפות שונות של חיץ כביסה (50 מיקרוליטר כל אחת) בטמפרטורת החדר. השאירו את הביציות למשך 5 דקות בכל טיפה.</li>
	<li>הניחו את הביציות בטיפות של חיץ חוסם (25 μL כל אחת) למשך שעה אחת על בלוק חם ב 37 ° C.</li>
	<li>הכינו את הנוגדן הראשוני המזהה γH2AX (ארנב פוספו-Η2ΑΧ) (Ser139) (ראו טבלת חומרים) (תמיסת מלאי: 1 מ"ג/מ"ל). השתמש דילול 1:200 בחיץ חוסם, ומניחים את הביציות בטיפות של נוגדן ראשוני (15 μL כל אחת) ב 4 ° C במשך הלילה. הערה: Phospho-Η2ΑΧ (γH2AX) הוא סמן נפוץ לגילוי DSB הן בתאים סומטיים והן בביציות GV18,23.</li>
	<li>למחרת, שטפו את הביציות בשלוש טיפות שונות של חיץ כביסה (50 מיקרוליטר כל אחת) בטמפרטורת החדר. השאירו את הביציות למשך 5 דקות בכל טיפה.</li>
	<li>הכינו את הנוגדן המשני, Alexa Fluor 488-conjugated goat goat anti-rabbit (ראו טבלת חומרים) (תמיסת מלאי: 2 מ"ג/מ"ל). השתמשו בדילול בקנ"מ 1:200 בחיץ חוסם, והניחו את הביציות בטיפות של נוגדן משני (15 מיקרוליטר כל אחת) למשך שעה אחת על בלוק חם בטמפרטורה של 37°C המוגנת מפני אור.</li>
	<li>מעבירים את הביציות לטיפות של DRAQ7 (25 μL כל אחת) (תמיסת מלאי: 0.3 מילימול; ראו טבלת חומרים), שהוא צבע דנ"א פלואורסצנטי אדום רחוק שמכתים DNA רק בתאים חדירים. יש להשתמש בדילול בקנ"מ 1:250 במאגר הכביסה למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בתנאי חושך.</li>
	<li>שטפו את הביציות בשלוש טיפות שונות של חיץ כביסה (50 מיקרוליטר כל אחת) בטמפרטורת החדר. השאירו אותם למשך 5 דקות בכל טיפה, ואז העבירו אותם לטיפות קטנות (כ-5 מיקרוליטר כל אחת) של חיץ כביסה בצלחת פטרי בקוטר 35 מ"מ עם תחתית זכוכית (ראו טבלת חומרים) למיקרוסקופ קונפוקלי (איור 2A). הערה: שטיפת כתם הדנ"א והנוגדן המשני מתבצעת בו זמנית.</li>
</ol>4. מיקרוסקופ קונפוקלי
הערה: יש לבצע מיקרוסקופ קונפוקלי באופן מיידי כדי למנוע את הירידה בעוצמת הפלואורסצנטיות לאחר מיקום הביציות בכלים בעלי תחתית זכוכית. נדרשת גישה למיקרוסקופ קונפוקלי (ראה טבלת חומרים) עם במה ממונעת.
<ol><li>הגדרת מיקרוסקופ<ol><li>במערכת הקונפוקלית הפעילו את בקר הלייזר, את הלייזרים, את בקר המיקרוסקופ, את המנורות עבור האור המשודר ואת המחשב האישי (איור 2B, D).</li>
		<li>פתח את תוכנת confocal, ובחר עדשת שמן 40x.</li>
		<li>הניחו את המנה במחזיק הדגימה, ונסו להתמקד בביציות על-ידי הזזת הבמה על צירי XY ו-Z באמצעות הג'ויסטיק (איור 2C).</li>
	</ol></li>
	<li>סריקת הביציות<ol><li>הגדר את עוצמת הלייזר, את הרווח ואת גודל חור הסיכה בנפרד עבור כל ניסוי על מנת למזער כל רוויה.</li>
		<li>עבור כל ביצית, הגדר את אזור העניין, במיוחד בגרעין באזור ה- DNA. הגדירו את גבולות אזור הדנ"א והתאימו את גודל צעד z ל-3 מיקרומטר. לאחר מכן, התחל בסריקה.</li>
		<li>שמרו את התמונות לכל תא בתיקייה שנבחרה.</li>
		<li>בסיום הסריקה, צא מהתוכנה, כבה את המחשב וכבה את בקר הלייזר, את הלייזרים, את בקר המיקרוסקופ ואת המנורות עבור האור המשודר.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65494/65494fig02.jpg"> איור 2: מיקרוסקופ קונפוקלי. (A) ביציות קבועות לאחר ביצוע פרוטוקול אימונופלואורסנציה וצביעת דנ"א, שנמצאות בטיפות נפרדות של חיץ כביסה, מכוסות בשמן מינרלי, מונחות בכלי עם תחתית זכוכית ומוכנות להדמיית מיקרוסקופ קונפוקלי. כל טיפה מכילה קטגוריה ניסיונית אחרת. התמונה התקבלה דרך עיניות המיקרוסקופ הסטריאופוני. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ/100 מיקרומטר עבור החלק המוגדל. (B) פלטה בעלת תחתית זכוכית המונחת על במת המיקרוסקופ הקונפוקלי. (C) תמונת שדה בהיר של ביציות המתקבלת באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (D) מערכת המיקרוסקופ הקונפוקלי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65494/65494fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
5. ניתוח הדמיה
<ol><li>הורד את Fiji ImageJ-win64 בדפדפן (https://imagej.net/software/fiji/downloads), פתח אותו וייבא את הנתונים כקבצי מחסנית TIFF. הערה: פתח כל קובץ ביציות בנפרד.</li>
	<li>לחץ על תמונה | צבע | פצל ערוצים כדי לפצל את כל הערוצים.</li>
	<li>לחץ על LUT (חפש טבלה) ובחר את הצבעים המועדפים עבור כל ערוץ.</li>
	<li>לחץ על תמונה | צבע | מזג ערוצים כדי למזג את הערוצים עבור γΗ2ΑΧ ו- DNA. השאר את ערוץ brightfield לא ממוזג.</li>
	<li>בביציות NSN וביציות SN עם רמות נמוכות של נזק לדנ"א, γΗ2ΑΧ מזוהה כמוקדים באזור הדנ"א. במקרה זה, לחץ על הפקודה " Multi-point" או point , ובחר כל מוקד γΗ2ΑΧ שעולה בקנה אחד עם ה- DNA. חזור על שלב זה עבור כל הערימות.</li>
	<li>בביציות SN עם רמות גבוהות של נזק לדנ"א, אות γΗ2ΑΧ מופץ בכל אזור הדנ"א. במקרה זה, לחץ על תמונה | ערימות | פרויקט Z, ובעזרת הפקודה Freehand selections , בחר את כל אזור ה- DNA.</li>
	<li>כדי למדוד את הפלואורסצנטיות γΗ2ΑΧ, לחץ על נתח | מדדו והעתיקו את המדידות לקובץ .xlsx. לאחר מכן, חשב את הפלואורסצנטיות הממוצעת, נרמל את הערכים וספור את מספר המוקדים לפני יצירת גרפים כלשהם.</li>
	<li>לחץ על נתח | הגדר קנה מידה כדי להגדיר את קנה המידה ולאחר מכן על נתח | כלים | סרגל קנה מידה כדי להוסיף סרגל קנה מידה לערוצים.</li>
</ol>

זיהוי נזק לדנ"א בביציות של עכברים שנעצרו בשלב

<ol>
	<li>Wang, X., Pepling, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+meiotic+prophase+one+in+mammalian+oocytes.">Regulation of meiotic prophase one in mammalian oocytes.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 667306 (2021).</li><li>Filatov, M., Khramova, Y., Semenova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+prophase+I+meiotic+arrest+maintenance+and+meiotic+resumption+in+mammalian+oocytes.">Molecular mechanisms of prophase I meiotic arrest maintenance and meiotic resumption in mammalian oocytes.</a> Reproductive Sciences. 26 (11), 1519-1537 (2019).</li><li>Adhikari, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+phosphorylation+of+Cdk1+mediates+prolonged+prophase+I+arrest+in+female+germ+cells+and+is+essential+for+female+reproductive+lifespan.">Inhibitory phosphorylation of Cdk1 mediates prolonged prophase I arrest in female germ cells and is essential for female reproductive lifespan.</a> Cell Research. 26 (11), 1212-1225 (2016).</li><li>Sun, S. C., Kim, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+asymmetric+division+in+oocytes.">Molecular mechanisms of asymmetric division in oocytes.</a> Microscopy and Microanalysis. 19 (4), 883-897 (2013).</li><li>Jones, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+egg+activation:+From+Ca2++spiking+to+cell+cycle+progression.">Mammalian egg activation: From Ca2+ spiking to cell cycle progression.</a> Reproduction. 130 (6), 813-823 (2005).</li><li>Solc, P., Schultz, R. M., Motlik, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prophase+I+arrest+and+progression+to+metaphase+I+in+mouse+oocytes:+comparison+of+resumption+of+meiosis+and+recovery+from+G2-arrest+in+somatic+cells.">Prophase I arrest and progression to metaphase I in mouse oocytes: comparison of resumption of meiosis and recovery from G2-arrest in somatic cells.</a> Molecular Human Reproduction. 16 (9), 654-664 (2010).</li><li>Parfenov, V., Potchukalina, G., Dudina, L., Kostyuchek, D., Gruzova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+antral+follicles:+oocyte+nucleus+and+the+karyosphere+formation+(electron+microscopic+and+autoradiographic+data).">Human antral follicles: oocyte nucleus and the karyosphere formation (electron microscopic and autoradiographic data).</a> Gamete Research. 22 (2), 219-231 (1989).</li><li>Zuccotti, M., Piccinelli, A., Giorgi Rossi, P., Garagna, S., Redi, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+organization+during+mouse+oocyte+growth.">Chromatin organization during mouse oocyte growth.</a> Molecular Reproduction and Development. 41 (4), 479-485 (1995).</li><li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+analysis+of+nonsurrounded+nucleolus+and+surrounded+nucleolus+oocytes+on+chromatin+accessibility+using+ATAC-seq.">Comprehensive analysis of nonsurrounded nucleolus and surrounded nucleolus oocytes on chromatin accessibility using ATAC-seq.</a> Molecular Reproduction and Development. 90 (2), 87-97 (2023).</li><li>Zuccotti, M., Bellone, M., Longo, F., Redi, C. A., Garagna, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully-mature+antral+mouse+oocytes+are+transcriptionally+silent+but+their+heterochromatin+maintains+a+transcriptional+permissive+histone+acetylation+profile.">Fully-mature antral mouse oocytes are transcriptionally silent but their heterochromatin maintains a transcriptional permissive histone acetylation profile.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 28 (12), 1193-1196 (2011).</li><li>Winship, A. L., Stringer, J. M., Liew, S. H., Hutt, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+DNA+repair+for+maintaining+oocyte+quality+in+response+to+anti-cancer+treatments,+environmental+toxins+and+maternal+ageing.">The importance of DNA repair for maintaining oocyte quality in response to anti-cancer treatments, environmental toxins and maternal ageing.</a> Human Reproduction Update. 24 (2), 119-134 (2018).</li><li>Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+human+nonhomologous+DNA+end+joining.">The mechanism of human nonhomologous DNA end joining.</a> The Journal of Biological Chemistry. 283 (1), 1-5 (2008).</li><li>Chiruvella, K. K., Liang, Z., Wilson, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+double-strand+breaks+by+end+joining.">Repair of double-strand breaks by end joining.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 5 (5), 012757 (2013).</li><li>Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-homologous+DNA+end+joining+and+alternative+pathways+to+double-strand+break+repair.">Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).</li><li>Shibata, A., Jeggo, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+for+the+DNA-PK+complex+and+53BP1+in+protecting+ends+from+resection+during+DNA+double-strand+break+repair.">Roles for the DNA-PK complex and 53BP1 in protecting ends from resection during DNA double-strand break repair.</a> Journal of Radiation Research. 61 (5), 718-726 (2020).</li><li>Mohiuddin, I. S., Kang, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-PK+as+an+emerging+therapeutic+target+in+cancer.">DNA-PK as an emerging therapeutic target in cancer.</a> Frontiers in Oncology. 9, 635 (2019).</li><li>Marangos, P., Carroll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oocytes+progress+beyond+prophase+in+the+presence+of+DNA+damage.">Oocytes progress beyond prophase in the presence of DNA damage.</a> Current Biology. 22 (11), 989-994 (2012).</li><li>Paull, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+role+for+histone+H2AX+in+recruitment+of+repair+factors+to+nuclear+foci+after+DNA+damage.">A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage.</a> Current Biology. 10 (15), 886-895 (2000).</li><li>Bakkenist, C. J., Kastan, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+activates+ATM+through+intermolecular+autophosphorylation+and+dimer+dissociation.">DNA damage activates ATM through intermolecular autophosphorylation and dimer dissociation.</a> Nature. 421 (6922), 499-506 (2003).</li><li>Marangos, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage-induced+metaphase+I+arrest+is+mediated+by+the+spindle+assembly+checkpoint+and+maternal+age.">DNA damage-induced metaphase I arrest is mediated by the spindle assembly checkpoint and maternal age.</a> Nature Communications. 6, 8706 (2015).</li><li>Lavrentyeva, E. A., Shishova, K. V., Zatsepina, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+in+nuclear+dynamics+in+mouse+GV+oocytes+with+a+diverse+chromatin+configuration.">Differences in nuclear dynamics in mouse GV oocytes with a diverse chromatin configuration.</a> Biology Bulletin Russian Academy of Sciences. 46, 332-341 (2019).</li><li>Montecucco, A., Zanetta, F., Biamonti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+etoposide.">Molecular mechanisms of etoposide.</a> EXCLI Journal. 14, 95-108 (1998).</li><li>Mayer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+response+during+mouse+oocyte+maturation.">DNA damage response during mouse oocyte maturation.</a> Cell Cycle. 15 (4), 546-558 (2016).</li><li>Olive, P., Ban&#225;th, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay:+A+method+to+measure+DNA+damage+in+individual+cells.">The comet assay: A method to measure DNA damage in individual cells.</a> Nature Protocols. 1, 23-29 (2006).</li><li>Wu, D., Dean, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EXOSC10+sculpts+the+transcriptome+during+the+growth-to-maturation+transition+in+mouse+oocytes.">EXOSC10 sculpts the transcriptome during the growth-to-maturation transition in mouse oocytes.</a> Nucleic Acids Research. 48 (10), 5349-5365 (2020).</li><li>Simon, L., Emery, B., Carrell, D., Agarwal, A., Henkel, R., Majzoub, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage:+COMET+assay.">DNA damage: COMET assay.</a> Manual of Sperm Function Testing in Human Assisted Reproduction. , 202-212 (2021).</li></ol>

למחברים אין ניגודי עניינים.

באמצעות השיטה המתוארת כאן, זיהינו DSB בביציות יונקים. שיטה זו מאפשרת איתור ולימוד של תהליך תיקון הדנ"א בביציות. אותו פרוטוקול יכול לשמש גם לניתוח חלבונים אחרים המשתתפים בתהליכים פיזיולוגיים בביציות יונקים. חשוב לחקור כיצד הביציות מגיבות לנזק פוטנציאלי לדנ"א על מנת להבין טוב יותר את הגורם לתת-פוריות נשית בבני אדם.
חקר תגובת הנזק לדנ"א בביציות יונקים יכול להיות מאתגר בגלל הרגישות של הביציות. טיפול בביציות דורש טמפרטורות ספציפיות וריכוזי CO 2ו-O 2. יחד עם זאת, הביציות חייבות להיות מוגנות מפני אור. הטיפול צריך להיעשות על ידי שימוש בפיפטות זכוכית שאינן צרות, שכן הדבר עלול להזיק לביציות, אך גם לא לרוחב, שכן הדבר עלול לגרום לדילול המדיום ובכך להשפיע לרעה על הליך הקיבוע. בכל שלב של קיבוע, כמה טיפות של חוצצים משמשים כדי למזער את אפקט דילול. דרך חלופית לתצפית ב-DSB היא בדיקת השביט24. למרות שטכניקה זו רגישה יותר, היא מורכבת יותר. יחד עם זאת, באמצעות שימוש בניסוי השביט לא ניתן לזהות את אזור הדנ"א המדויק שבו מתרחש הנזק, ובתאים עם מולקולות רנ"א בשפע, כמו ביציות בשלב GV 25, הרקע יכול להיות מוגבר, מה שיוביל לאות נזק כוזבלדנ"א26.
על ידי שימוש בפרוטוקול immunofluorescence המתואר כאן, אנו יכולים לזהות DSB בדיוק ולהעריך את התקדמות התיקון בביציות בשלב GV, כפי שמצוין על ידי הפחתת פלואורסצנטיות γH2AX לאורך זמן. עם זאת, מגבלה אחת של שיטה זו היא כי נוגדנים מסוימים עשויים להציג פיזור לא ספציפי ברחבי ooplasm, ובכך להוביל תמונות עם פלואורסצנטיות רקע גבוהה. מאגר PFA-Tx-100 משמש במקום PFA רציף ו- Tx-100, כפי שראינו כי הוא משפר את תהליך הקיבוע בכך שהוא מאפשר זיהוי של פחות רקע ופלואורסצנטיות לא ספציפית. מגבלה שנייה של שימוש ב- γH2AX לזיהוי DSB היא שלא ניתן להעריך נזק לאחר GVBD בגלל הזרחן הספונטני של γH2AX במיוזה23.
בפרוטוקול אימונופלואורסנציה זה, הביציות נשארות במאגר נוזלי ולא ניתן לאחסן אותן בתוך שקופיות. עובדה זו מקשה על שימור התאים הקבועים במשך ימים לאחר הוספת הנוגדן המשני. על מנת להשיג תמונות באיכות טובה ולא לאבד אות, עדיף לבצע את ההדמיה תוך מספר שעות לאחר הוספת הנוגדן המשני. כמו כן יש לציין כי סריקת הגרעינים דרך ציר Z עלולה לגרום לאות להיחלש עקב חשיפת יתר. מסיבה זו, עדיף להוריד את עוצמת הלייזר ולהגביר את מהירות הסריקה.
לבסוף, מגבלה נוספת של פרוטוקול האימונופלואורסנציה היא שניתן להשתמש בו רק עבור תאים קבועים / לא חיים. לכן, אנו יכולים להעריך רק את נוכחותם והיעדרם של גורמים בנקודות זמן ספציפיות מבלי לדעת אם יש תנודות בריכוזם או שינויים בהתנהגותם לאורך זמן. ניתן להתגבר על בעיה זו באמצעות דימות תאים חיים וסמנים מתויגים פלואורסצנטית.

תהליך המיוזה בתאי נבט נקביים של יונקים מתחיל בשחלות לפני הלידה. המספר הכולל של הביציות נקבע בשחלות בעיקר במהלך embryogenesis. הביציות נכנסות למיוזה ונשארות עצורות בשלב I1. לאחר תחילת ההתבגרות המינית והייצור והפעולה האנדוקרינית של הורמון מגרה זקיק (FSH) והורמון luteinizing (LH), הביציות עשויות ליזום מחדש ולהשלים מיוזה2. אצל בני אדם, מעצר שלב יכול להימשך עד 50 שנה3. חלוקות התאים לאחר הכניסה למיוזה I אינן סימטריות, וכתוצאה מכך נוצר גוף קוטבי קטן וביצית השומרת על גודלה. לכן, רוב המרכיבים cytoplasmic מאוחסנים ooplasm במהלך embryogenesis מוקדם4. לאחר מכן, הביציות נכנסות למיוזה II, מבלי לשנות מחדש את הגרעין שלהן או לפרק את הכרומוזומים שלהן, ונשארות כלואות במטא-פאזה II עד להפריה5.
מאפיין ייחודי המבדיל בין ביציות לתאים סומטיים הוא מצב המעצר בשלב I, כאשר לביצית יש גרעין שלם (מעצר שלפוחית נבט [GV]), המכונה שלבGV 6. בהתבסס על ארגון הכרומטין, הביציות בשלב GV מסווגות לשתי קטגוריות: גרעין לא מוקף (NSN) וגרעין מוקף (SN)7,8. בביציות בשלב ה-GV של NSN, הכרומטין מתפשט בכל האזור הגרעיני, והשעתוק פעיל, ואילו בביציות SN, הכרומטין יוצר טבעת קומפקטית המקיפה את הגרעין, והשעתוק שקט9. שני סוגי הביציות בשלב GV מראים יכולת מיוטית; הן נכנסות למיוזה באותו קצב, אך הביציות של NSN מציגות יכולת התפתחותית נמוכה ואינן יכולות להתפתח מעבר לעובר בן שני התאים10.
המצב הממושך של מעצר שלב I מעלה את שכיחות הצטברות הנזק לדנ"א11. לכן, מנגנוני התגובה לנזק לדנ"א בביציות חיוניים כדי לאפשר ייצור של גמטות בעלות שלמות גנטית ולהבטיח שלעובר שנוצר יש תוכן כרומוזומלי פיזיולוגי.
היבט מרכזי של תגובת הנזק לדנ"א הוא תיקון דנ"א. המסלולים העיקריים לתיקון DSB בתאים אאוקריוטים כוללים הצטרפות קצה לא הומולוגית (NHEJ), רקומבינציה הומולוגית (HR) וחלופה NHEJ 12,13,14,15. NHEJ הוא מנגנון מהיר יותר אך נוטה יותר לשגיאות, בעוד HR דורש יותר זמן כדי להשלים אבל יש נאמנות גבוהה16.
אין מספיק ידע על המנגנונים שבהם הביציות משתמשות לתיקון נזקי דנ"א. מחקרים הראו כי נזק לדנ"א הנגרם בביציות יונקים בוגרות לחלוטין על ידי שימוש בחומרים גנוטוקסיים, כגון אטופוסיד, דוקסורוביצין או UVB או קרינה מייננת, אינו משפיע על העיתוי וקצב היציאה משלב I מעצר17. ביציות יכולות לעבור פירוק GV (GVBD) גם בנוכחות רמות גבוהות של נזק. נזק זה יכול להיקבע על ידי תצפית של γH2AX. צורה זרחנית זו של H2AX (γΗ2ΑΧ) היא סמן DSB, הממוקם באתר של שברים ומתפקד כפיגום כדי לסייע בתיקון גורמים וחלבונים להצטבר בקצוות שבורים18.
היעדר מעצר מחזור התא בעקבות נזק לדנ"א נובע ממחסום נזק DNA לא מספיק המאפשר לביציות עם DNA לא מתוקן להיכנס מחדש למיוזה. בעקבות רמות גבוהות של נזק לדנ"א, מחסום יכול לשמור על מעצר שלב באמצעות הפעלת מסלול תלוי ATM/Chk1. תגובת הבידוק המוגבלת ל-DSB נובעת מההפעלה המוגבלת של כספומט17,19. בשלב M של מיוזה I, מחקרים הראו כי נזק לדנ"א עשוי להפעיל מחסום מיוזה I המושרה על ידי ציר (SAC), אשר מונע את ההפעלה של E3 ubiquitin ligase anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) ולכן, יציאה משלב M. יתר על כן, אבלציה של חלבוני SAC מתגברת על מצב של מעצר שלב M, ובכך מדגישה את חשיבותו של SAC בביסוס המיוזה I chekpoint20.
כפי שמחקרים קודמים מראים בבירור, DSBs אינם יכולים לגרום למחסום פאזה חזק בביציות עכבר. אם נזק כזה לא יתוקן, הוא עלול להוביל לעוברים הנושאים הפרעות כרומוזומליות. לכן, חשוב לחקור את תגובת הנזק לדנ"א בשלבים שונים של הגמטוגנזה הנשית כדי להבין טוב יותר את המסלולים הייחודיים שבהם הביציות משתמשות כדי להתמודד עם עלבונות גנטיים פוטנציאליים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3 mL Pasteur pipettes in LDPE, graduated</td>
			<td>APTACA</td>
			<td>1502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cc syringes</td>
			<td>SoftCare</td>
			<td>114.104.21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488-conjugated goat anti-rabbit Secondary Ab</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>20012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-phospho-H2A.X (Ser139)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>07-164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARE Heating Magnetic Stirrer</td>
			<td>VELP Scientifica</td>
			<td>F20500162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FALCON 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tubes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Microlance 3 Needles 27 G - 0.40 x 13 mm</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>300635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10735078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO Anhydrous</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>90082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DRAQ7 DNA dye</td>
			<td>BioStatus</td>
			<td>DR71000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMSURE MgCl2. 6H2O</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1058330250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etoposide</td>
			<td>CHEMIPHARM</td>
			<td>L01CB01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FALCON 14 mL Polystyrene Round-Bottom Tubes</td>
			<td>Corning Science</td>
			<td>532057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FALCON Tissue Culture Dishes, Easy-Grip, 35 x 10 mm Style</td>
			<td>Corning Science</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Culture Dishes (35 mm Petri dish/ 14 mm Microwell, No. 0 coverglass)</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-0-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H6147-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACELL 150i CO2 Incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>50116048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBMX powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5879-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica M125 Stereo Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M16 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M2 Medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M5310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>13412H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1064981000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon AX ECLIPSE Ti2 Confocal Microscope</td>
			<td>Nikon Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon SMZ800N Stereo Microscope</td>
			<td>Nikon Corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pippettes, glass, long form 230 mm</td>
			<td>DURAN WHEATON KIMBLE</td>
			<td>357335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH/ORP meter&#160;</td>
			<td>Hanna Instruments Ltd</td>
			<td>HI2211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline tablets</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSG Protein Lyophilised</td>
			<td>Genway Biotech (now AVIVA Systems Biology)</td>
			<td>GWB-2AE30A (now OPPA01037)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QBD4 Dry block heater</td>
			<td>Grant Instruments (Cambridge) Ltd</td>
			<td>A25218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Puradisc 25 mm 0.2 &#956;m filters</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>6780-2502</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of dna double-stranded breaks in mouse oocytes

הביציות הן בין התאים הגדולים ומאריכי החיים ביותר בגוף הנשי. הם נוצרים בשחלות במהלך ההתפתחות העוברית ונשארים נעצרים בשלב של מיוזה I. המצב השקט עשוי להימשך שנים עד שהביציות מקבלות גירוי לגדול ולקבל את היכולת לחדש את המיוזה. מצב מעצר ממושך זה הופך אותם לרגישים ביותר לצבירת עלבונות מזיקים לדנ"א, המשפיעים על השלמות הגנטית של הגמטות הנקביות, ולכן, על שלמותו הגנטית של העובר העתידי. 
לפיכך, יש חשיבות מכרעת לפיתוח שיטה מדויקת לאיתור נזק לדנ"א, שהיא הצעד הראשון להקמת מנגנוני תגובה לנזקי דנ"א. מאמר זה מתאר פרוטוקול נפוץ לבדיקת נוכחות והתקדמות של נזק לדנ"א בביציות שנעצרו בשלב במהלך תקופה של 20 שעות. באופן ספציפי, אנו מנתחים שחלות עכברים, שולפים את קומפלקסי קומולוס-ביציות (COC), מסירים את תאי הקומולוס מה-COC, ומתרבתים את הביציות בתווך Μ2 המכיל 3-איזובוטיל-1-מתיל-קסנטין כדי לשמור על מצב המעצר. לאחר מכן, הביציות מטופלות בתרופה ציטוטוקסית, אנטי-ניאופלזמה, אטופוסיד, כדי לגרום לשברים דו-גדיליים (DSB). 
על ידי שימוש באימונופלואורסנציה ובמיקרוסקופ קונפוקלי, אנו מזהים ומכמתים את רמות חלבון הליבה γH2AX, שהוא הצורה הזרחנית של ההיסטון H2AX. H2AX הופך לפוספורילציה באתרים של DSB לאחר נזק לדנ"א. חוסר היכולת לשחזר את שלמות הדנ"א בעקבות נזק לדנ"א בביציות עלול להוביל לאי פוריות, למומים מולדים ולשיעורים מוגברים של הפלות ספונטניות. לכן, הבנת מנגנוני התגובה לנזק לדנ"א, ובה בעת ביסוס שיטה שלמה לחקר מנגנונים אלה, חיוניים לחקר הביולוגיה של הרבייה.

The process of meiosis in mammalian female germ cells is initiated in the ovaries before birth. The total number of oocytes is established in the ovaries primarily during embryogenesis. Oocytes enter meiosis and remain arrested at prophase I1. After the onset of puberty and the production and endocrine action of follicle-stimulating hormone (FSH) and luteinizing hormone (LH), oocytes may reinitiate and complete meiosis2. In humans, prophase arrest can last for up to 50 years3. The cell divisions following the entry into meiosis I are asymmetric, resulting in the production of a small polar body and an oocyte that retains its size. Thus, most cytoplasmic components are stored in the ooplasm during early embryogenesis4. Then, the oocytes enter meiosis II, without reforming their nucleus or decondensing their chromosomes, and remain arrested at metaphase II until fertilisation5.
A unique characteristic that distinguishes oocytes from somatic cells is the state of arrest in prophase I, when the oocyte possesses an intact nucleus (germinal vesicle [GV] arrest), referred to as the GV stage6. Based on the chromatin organization, GV-stage oocytes are classified into two categories: non-surrounded nucleolus (NSN) and surrounded nucleolus (SN)7,8. In NSN GV-stage oocytes, the chromatin spreads throughout the whole nuclear region, and transcription is active, while in SN oocytes, the chromatin forms a compact ring that surrounds the nucleolus, and transcription is silent9. Both types of GV-stage oocytes show meiotic competence; they enter meiosis at the same rate, but the NSN oocytes present low developmental capacity and cannot develop beyond the two-cell stage embryo10.
The protracted state of prophase I arrest increases the incidence of DNA damage accumulation11. Therefore, DNA damage response mechanisms in oocytes are essential for allowing the production of gametes with genetic integrity and for ensuring that the resulting embryo has a physiological chromosomal content.
A central aspect of the DNA damage response is DNA repair. The main pathways for DSB repair in eukaryotic cells include non-homologous end joining (NHEJ), homologous recombination (HR), and alternative NHEJ12,13,14,15. NHEJ is a faster but more error-prone mechanism, while HR requires more time to be completed but has high fidelity16.
There is not enough knowledge about the mechanisms that oocytes use for DNA damage repair. Studies have shown that DNA damage induced in fully grown mammalian oocytes by the use of genotoxic agents, such as etoposide, doxorubicin, or UVB or ionizing radiation, does not affect the timing and rates of exit from prophase I arrest17. Oocytes can undergo GV breakdown (GVBD) even in the presence of elevated levels of damage. This damage can be determined by the observation of &#947;H2AX. This phosphorylated form of H2AX (&#947;&#919;2&#913;&#935;) is a DSB marker, which is located at the site of breaks and functions as a scaffold to help repair factors and proteins to accumulate at broken ends18.
The absence of cell cycle arrest following DNA damage is due to an insufficient DNA damage checkpoint that allows oocytes with unrepaired DNA to re-enter meiosis. Following high levels of DNA damage, a checkpoint can maintain prophase arrest through the activation of an ATM/ Chk1-dependent pathway. The limited checkpoint response to DSBs is due to the limited activation of ATM17,19. In the M-phase of meiosis I, research has shown that DNA damage may activate a spindle assembly checkpoint (SAC)-induced meiosis I checkpoint, which prevents the activation of the E3 ubiquitin ligase anaphase-promoting complex/cyclosome (APC/C) and, therefore, M-phase exit. Moreover, the ablation of SAC proteins overcomes the state of M-phase arrest, thus underlining the importance of the SAC in the establishment of the meiosis I chekpoint20.
As previous research clearly shows, DSBs cannot induce a robust prophase checkpoint in mouse oocytes. If such damage is left unrepaired, it could lead to embryos carrying chromosomal abnormalities. Therefore, it is important to study the DNA damage response at different stages of female gametogenesis to better understand the unique pathways that oocytes use to cope with potential genetic insults.

מחבר זרקור: הבנת תגובת נזק לדנ"א בביציות יונקים ובעוברים טרום השרשה 

איתור שברים דו-גדיליים בדנ"א בביציות עכבר

Our research aims to understand how the cell cycle is regulated in mammalian oocytes and in preimplantation embryos. A key aspect of our research involves examination of repair capacity and DNA damage response in different maturation states is in oocytes and also in preimplantation embryos. We are particularly interested in understanding how the checkpoints respond and which repair mechanisms establish after potential DNA damage.Our lab was the first to mechanistically examine the DNA damage response in mammalian oocytes. We have shown the absence of the G2 prophase DNA damage checkpoint in mammalian oocytes. And we observed the importance of the spindle assembly checkpoint in establishing metaphase arrest after damage.By using this protocol, it is possible to detect DNA double strand breaks with accuracy and to determine whether oocytes have DNA damage and whether DNA damage is being repaired. This protocol involves the use of immunofluorescence which allows us to identify the exact sites of damage to DNA.

באמצעות ההליך שהודגם כאן, נותחו שחלות עכברים, הוסר השומן ונאספו ביציות מלאות בשלב GV. לאחר מכן, תאי הקומולוס הוסרו על-ידי פיפטינג חוזר ונשנה באמצעות פיפטה צרה, והונחו בטיפות טריות של מדיום M2-IBMX וכוסו בשמן מינרלי על בלוק חם (37°C) (איור 1A-F). הוכנו שלושה ריכוזי אטופוסיד שונים (5 מק"ג/מ"ל, 20 מק"ג/מ"ל ו-50 מק"ג/מ"ל) באמצעות ריכוז אטופוסיד מלאי של 20 מ"ג/מ"ל. הביציות בשלב GV הוכנסו לשלושה ריכוזים אטופוזידים נפרדים למשך שעה אחת בטיפות המכוסות בשמן מינרלי ומוגנות מפני אור בטמפרטורה של 37°C. לאחר מכן בוצע פרוטוקול האימונופלואורסנציה, כפי שמתואר בסעיף הפרוטוקול בפירוט, והביציות הונחו בצלחות עם תחתית זכוכית ונצפו במיקרוסקופ קונפוקלי (איור 2).
בביציות בשלב SN GV, מיד לאחר נזק לדנ"א, נוכחות γH2AX עלתה בכל ריכוזי האטופוזידים (5 מיקרוגרם/מ"ל, 20 מק"ג/מ"ל ו-50 מק"ג/מ"ל), וה-γH2AX פוזר בכל אזור הדנ"א (איור 3). כימות ואומדן DSB בוצעו על ידי צפייה בעוצמת הפלואורסצנטיות γH2AX באתרי DNA. הפלואורסצנטיות γH2AX התעצמה באופן יחסי עם עליית ריכוזי האטופוסידים. יתר על כן, לאחר מעצר שלב ממושך (20 שעות לאחר טיפול אטופוסידי), הביציות בשלב GV הראו את היכולת להפחית את מספר מוקדי γH2AX ואת עוצמתם, מה שמרמז על נוכחות של תהליכי תיקון פעילים בביציות שנעצרו בשלב GV (איור 3E).
בניגוד לביציות SN, שבהן הפלואורסצנטיות γH2AX הופצה דרך הדנ"א, בביציות NSN, γH2AX הוצג במוקדים מיד לאחר הטיפול באטופוסיד ב 20 מיקרוגרם / מ"ל. הערכנו את מספר המוקדים שחפפו לאזור הדנ"א, חישבנו את הפלואורסצנטיות של כל מוקד, והצגנו את הפלואורסצנטיות הממוצעת של כל הביציות. גם הפלואורסצנטיות וגם מספר המוקדים הראו הבדלים מובהקים סטטיסטית בין שתי קטגוריות הביציות (איור 4).
מיקרוסקופ קונפוקלי מספק מידע על מספר ועוצמת המוקדים בערימות Z שונות, ובכך מסייע לזהות את נוכחות הנזק לדנ"א ואת דינמיקת התיקון בנקודות זמן שונות. סריקת Galvano מספקת סריקה מדויקת עם רקע נמוך וניתוח טוב יותר של תמונות הסריקה.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65494/65494fig03.jpg"> איור 3: הפחתה של γH2AX בביציות בשלב SN GV שטופלו בשלושה ריכוזי אטופוסיד שונים לאחר מעצר GV ממושך. (A) פלואורסצנטיות γH2AX בביציות SN GV שלב 0 שעות לאחר טיפול אטופוסידי. γH2AX עולה מיד לאחר החשיפה בכל ריכוזי האטופוסידים, והעלייה תלויה בריכוז (ירוק: γΗ2ΑΧ, מגנטה: DNA). התמונות הן הקרנות Z-stack, והבהירות/ניגודיות הותאמו לכל ערוץ באמצעות Fiji / ImageJ. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (B) גרף של פלואורסצנטיות γH2AX בביציות SN GV שלב 0 שעות לאחר הטיפול עם ריכוזי אטופוסיד מובהקים. הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM. כל נקודה מייצגת ביצית אחת (מספר הביציות מוצג בגרף), (ns = לא מובהק, ** p < 0.005, **** p < 0.0001, ANOVA חד כיווני עם מבחן השוואות מרובות של Tukey). (C) γH2AX פלואורסצנטיות בביציות בשלב SN GV 20 שעות לאחר טיפול אטופוסידי. γH2AX מפחית 20 שעות לאחר החשיפה בכל ריכוזי האטופוסיד (ירוק: γΗ2ΑΧ, מגנטה: DNA). התמונות הן הקרנות מסוג Z-stack, והבהירות/ניגודיות הותאמו לכל ערוץ באמצעות Fiji/ImageJ. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (D) גרף של פלואורסצנטיות γH2AX בביציות SN GV שלב 20 שעות לאחר הטיפול עם ריכוזי אטופוסיד מובהקים. הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM. כל נקודה מייצגת ביצית אחת (מספר הביציות מוצג בגרף), (ns = לא מובהק, * p < 0.05, * * p < 0.005, *** p < 0.0005, **** p < 0.0001, ANOVA חד כיווני עם מבחן השוואות מרובות של Tukey). (E) גרף עמודות של הפחתת פלואורסצנטיות γH2AX בביציות בשלב SN GV לאחר מעצר שלב בביציות שטופלו באטופוזיד. המספר מעל כל עמודה מציין את אחוז הירידה בפלואורסצנטיות γH2AX. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65494/65494fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65494/65494fig04.jpg"> איור 4: זרחן של Η2ΑΧ בביציות בשלב GV של NSN לאחר טיפול באטופוסיד ב-20 מיקרוגרם/מ"ל. (A) תמונות קונפוקליות מייצגות של ביצית NSN GV אחת (ירוק: γΗ2ΑΧ, מגנטה: DNA). התמונות הן הקרנות מסוג Z-stack, והבהירות/ניגודיות הותאמו לכל ערוץ באמצעות Fiji/ImageJ. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (B) תמונות קונפוקליות מייצגות של ביצית NSN GV אחת שטופלה באטופוסיד (ירוק: γΗ2ΑΧ, מגנטה: DNA). הביציות תוקנו 0 שעות לאחר טיפול אטופוסידי. התמונות הן הקרנות מסוג Z-stack, והבהירות/ניגודיות הותאמו לכל ערוץ באמצעות Fiji/ImageJ. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (C) הפלואורסצנטיות γΗ2ΑΧ המנורמלת בביציות בשלב GV של NSN לאחר טיפול אטופוסיד של 20 מיקרוגרם/מ"ל. הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM. כל נקודה מייצגת ביצית אחת (מספר הביציות מוצג בגרף), שנלקחה משני ניסויים עצמאיים (**** p < 0.0001, מבחן t לא פרמטרי לא מזווג, מבחן U-Mann-Whitney). (D) מספר מוקדי γΗ2ΑΧ בביציות בשלב NSN GV לאחר טיפול אטופוסיד של 20 מיקרוגרם/מ"ל. הנתונים מייצגים ממוצע ± SEM. כל נקודה מייצגת ביצית אחת (מספר הביציות מוצג בגרף), שנלקחה משני ניסויים עצמאיים (**** p < 0.0001, מבחן t לא פרמטרי לא מזווג, מבחן U-Mann-Whitney). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65494/65494fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Understanding DNA Damage Response in Mammalian Oocytes and Preimplantation Embryos at JoVE.com

שמירה על שלמות גנום הביצית נחוצה כדי להבטיח את הנאמנות הגנטית בעובר המתקבל. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מדויק לאיתור שברים דו-גדיליים בדנ"א בתאי נבט נקביים של יונקים.

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain ...

מטרת המחקר שלנו היא להבין כיצד מחזור התא מווסת בביציות יונקים ובעוברים טרום השרשה. היבט מרכזי של המחקר שלנו כולל בחינה של יכולת תיקון ותגובת נזק לדנ"א במצבי הבשלה שונים בביציות וגם בעוברים טרום השרשה. אנו מתעניינים במיוחד בהבנת האופן שבו נקודות הביקורת מגיבות ואילו מנגנוני תיקון נקבעים לאחר נזק פוטנציאלי לדנ"א.המעבדה שלנו הייתה הראשונה שבחנה באופן מכניסטי את תגובת הנזק לדנ"א בביציות יונקים. הראינו היעדר מחסום נזק לדנ"א שלב G2 בביציות יונקים. וראינו את חשיבותו של מחסום הרכבת הצירים ביצירת מעצר מטא-פאזי לאחר נזק.באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לזהות בדיוק רב שברים בגדיל הכפול של הדנ"א ולקבוע האם לביציות יש נזק לדנ"א ואם נזק לדנ"א מתוקן. פרוטוקול זה כולל שימוש באימונופלואורסנציה המאפשרת לנו לזהות את האתרים המדויקים של נזק לדנ"א.

detection-of-dna-double-stranded-breaks-in-mouse-oocytes

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Detection of DNA Double-Stranded Breaks in Mouse Oocytes

1.3K Views.  University of Ioannina. מטרת המחקר שלנו היא להבין כיצד מחזור התא מווסת בביציות יונקים ובעוברים טרום השרשה. היבט מרכזי של המחקר שלנו כולל בחינה של יכולת תיקון ותגובת נזק לדנ"א במצבי הבשלה שונים בביציות וגם בעוברים טרום השרשה. אנו מתעניינים במיוחד בהבנת האופן שבו נקודות הביקורת מגיבות ואילו מנגנונ?...

Video: מחבר זרקור: הבנת תגובת נזק לדנ"א בביציות יונקים ובעוברים טרום השרשה 

Oocytes are amongst the biggest and most long-lived cells in the female body. They are formed in the ovaries during embryonic development and remain arrested at the prophase of meiosis I. The quiescent state may last for years until the oocytes receive a stimulus to grow and obtain the competency to resume meiosis. This protracted state of arrest makes them extremely susceptible to accumulating DNA-damaging insults, which affect the genetic integrity of the female gametes and, therefore, the genetic integrity of the future embryo. 
Consequently, the development of an accurate method to detect DNA damage, which is the first step for the establishment of DNA damage response mechanisms, is of vital importance. This paper describes a common protocol to test the presence and progress of DNA damage in prophase-arrested oocytes during a period of 20 h. Specifically, we dissect mouse ovaries, retrieve the cumulus-oocyte complexes (COCs), remove the cumulus cells from the COCs, and culture the oocytes in &#924;2 medium containing 3-isobutyl-1-methylxanthine to maintain the state of arrest. Thereafter, the oocytes are treated with the cytotoxic, antineoplasmic drug, etoposide, to engender double-strand breaks (DSBs). 
By using immunofluorescence and confocal microscopy, we detect and quantify the levels of the core protein &#947;H2AX, which is the phosphorylated form of the histone H2AX. H2AX becomes phosphorylated at the sites of DSBs after DNA damage. The inability to restore DNA integrity following DNA damage in oocytes can lead to infertility, birth defects, and increased rates of spontaneous abortions. Therefore, the understanding of DNA damage response mechanisms and, at the same time, the establishment of an intact method for studying these mechanisms are essential for reproductive biology research.

Maintaining oocyte genome integrity is necessary to ensure the genetic fidelity in the resulting embryo. Here, we present an accurate protocol for detecting DNA double-strand breaks in mammalian female germ cells.

Collection of Germinal Vesicle Oocytes from the Ovaries of CD-1 Mice and Induction of DNA Double-Strand Breaks

To begin, prepare drops of M2 IBMX Medium in a plastic tissue culture dish, and place the dish on a hot block at 37 degrees Celsius for at least 30 minutes before oocyte isolation. Dissect the ovaries of the euthanized mice and place them in a five milliliter round bottom tube with M2 IBMX. Transfer the ovaries to a plastic lid containing 1.5 milliliters of M2 IBMX.Remove any peri-ovarian adipose tissue, or fallopian tube segments, and release the cumulus oocyte complexes by mechanical perforation of the ovaries with a 27-gauge needle. Transfer the cumulus oocyte complexes to a culture dish with drops of M2 IBMX. And remove the cumulus cells by repeated pipetting using a narrow bore glass pasture pipette.Select the surrounded nucleus germinal vesicle or GV stage oocytes, and transfer them in a drop of M2 IBMX medium on hot block at 37 degrees Celsius protected from light. After inducing double strand breaks using etoposide, place the GV stage oocytes in drops of the genotoxic agent for one hour on the hot block in the dark. Add drops of M16 culture medium supplemented with 400 micromolar IBMX to the oocytes to keep them arrested for a prolonged period.Place the oocytes in an incubator at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide.

איסוף ביציות שלפוחית נבט מהשחלות של עכברי CD-1 והשראת שברי גדיל כפול DNA

Fixation and Confocal Imaging of Germinal Vesicle-Oocyte Collected from CD-1 Mice

Place the control and etoposide-treated germinal vesicle, or GV, oocytes in different plastic tissue culture dishes with PFA-Tx 100 buffer for 40 minutes at room temperature. Rinse the oocytes in three distinct 50-microliter washing buffers at room temperature and place them in 25 microliters of blocking buffer on a hot block for one hour. Next, prepare the primary antibody that recognizes gamma H2AX.Dilute the primary antibody with the blocking buffer at a one to 200 ratio and immerse the oocytes in 15-microliter drops at four degrees Celsius overnight. Wash the oocytes in three different 50-microliter washing buffers. Prepare the Alexa Fluor 488 conjugated growth anti-rabbit secondary antibody.After diluting it with the blocking buffer, immerse the oocytes in 15-microliter drops of the antibody for one hour on a 37 degrees Celsius hot block protected from light. Take a far-red fluorescent DNA dye DRAQ7 and transfer the oocytes to it for 10 minutes at room temperature in the dark before washing them with three different washing buffers. Add small drops of washing buffer to the oocytes in a 35-millimeter glass-bottom Petri dish for confocal microscopy.Switch on the laser controller and the lasers in the confocal system. After turning on the microscope controller and the lamps, open the confocal software and choose the 40X oil lens. Place the dish with the oocytes into the specimen holder and try to focus on the oocytes by moving the stage on X, Y, and Z axes using the joystick.Set the laser power, the gain, and the pinhole size independently for each experiment to minimize any saturation. For each oocyte, set the area of interest specifically in the nucleus at the DNA area. Define the borders of the DNA area and adjust the Z-step size to three micrometers.Then start the scanning. Save the images for each cell in the selected folder. Open the ImageJ software and click on image, followed by color, and split channels.To split all the channels. Click on lookup table and choose the preferred colors for each channel Click on image, color, and merge channels to merge the channels for gamma H2AX and DNA. In the surrounded nucleolus oocytes with high levels of DNA damage, click on image, stacks, Z-project, and with the freehand selections command, select the entire DNA area.Click on analyze, followed by measure to measure the gamma H2AX fluorescence and copy the measurements into an Excel file. The gamma H2AX fluorescence in the surrounded nucleolus GV stage oocytes zero hours after the etoposide treatment is shown in this figure. The gamma H2AX increases immediately after the exposure at all the etoposide concentrations, and the increase is concentration-dependent.The gamma H2AX fluorescence in the surrounded nucleolus GV stage oocytes 20 hours after the etoposide treatment is shown here. Gamma H2AX reduces 20 hours after the exposure at all the etoposide concentrations. After protracted prophase arrest, the GV stage oocytes showed the capacity to reduce the gamma H2AX foci number and intensity, implying the presence of active repair processes in the GV stage arrested oocytes.