Поместите контрольные и обработанные этопозидом зародышевые везикулы, или GV, ооциты в различные чашки для культивирования тканей с буфером PFA-Tx 100 на 40 минут при комнатной температуре. Промойте ооциты в трех различных 50-микролитровых промывочных буферах при комнатной температуре и поместите их в 25 микролитров блокирующего буфера на горячий блок на один час. Далее готовят первичное антитело, распознающее гамма-H2AX.
Разбавьте первичное антитело блокирующим буфером в соотношении один к 200 и погрузите ооциты в капли объемом 15 микролитров при температуре четыре градуса Цельсия на ночь. Промойте ооциты в трех разных 50-микролитровых буферах для промывки. Приготовьте конъюгированное антитело против роста Alexa Fluor 488 против кроличьего вторичного антитела.
Разбавив его блокирующим буфером, погрузите ооциты в капли антитела объемом 15 микролитров на один час в защищенный от света горячий блок при температуре 37 градусов Цельсия. Возьмите дальний красный флуоресцентный краситель ДНК DRAQ7 и перенесите в него ооциты на 10 минут при комнатной температуре в темноте, прежде чем промыть их тремя различными промывочными буферами. Добавьте небольшие капли промывочного буфера к ооцитам в 35-миллиметровой чашке Петри со стеклянным дном для конфокальной микроскопии.
Включите лазерный контроллер и лазеры в конфокальной системе. Включив контроллер микроскопа и лампы, откройте конфокальную программу и выберите масляную линзу 40X. Поместите чашку с ооцитами в держатель для образцов и попытайтесь сфокусироваться на ооцитах, перемещая предметную область по осям X, Y и Z с помощью джойстика.
Устанавливайте мощность лазера, коэффициент усиления и размер точечного отверстия независимо для каждого эксперимента, чтобы свести к минимуму насыщение. Для каждого ооцита установите область интереса конкретно в ядре в области ДНК. Определите границы области ДНК и отрегулируйте размер Z-шага до трех микрометров.
Затем начните сканирование. Сохраните изображения для каждой ячейки в выбранной папке. Откройте программное обеспечение ImageJ и нажмите на изображение, затем на цвет, и разделите каналы.
Чтобы разделить все каналы. Нажмите на таблицу поиска и выберите предпочтительные цвета для каждого канала Нажмите на изображение, цвет и объедините каналы, чтобы объединить каналы для гаммы H2AX и ДНК. В окруженных ядрышковых ооцитах с высоким уровнем повреждения ДНК нажмите на изображение, стопки, Z-проект и с помощью команды выбора от руки выберите всю область ДНК.
Нажмите «Анализировать», затем измерьте флуоресценцию гамма-H2AX и скопируйте результаты измерений в файл Excel. Флуоресценция гамма-H2AX в ооцитах стадии Nucleolus GV через ноль часов после лечения этопозидом показана на рисунке. Гамма H2AX увеличивается сразу после воздействия при всех концентрациях этопозида, причем это увеличение зависит от концентрации.
Здесь показана флуоресценция гамма-H2AX в ооцитах стадии ГВ в окруженном ядрышке GV через 20 часов после лечения этопозидом. Гамма H2AX снижается через 20 часов после экспозиции при всех концентрациях этопозида. После длительной профазной остановки ооциты стадии GV показали способность снижать количество и интенсивность гамма-очагов H2AX, что свидетельствует о наличии активных процессов репарации в остановленных ооцитах стадии GV.
