Подготовка сосудистых клеток к анализу in vivo Matrix Gel Plug

Начните с приготовления полной среды для эндотелиальных культур с использованием 460 миллилитров среды эндотелиальных клеток и добавления в нее 50 миллилитров FBS, пяти миллилитров пенициллина стрептомицина и пяти миллилитров добавки для роста эндотелиальных клеток. Подготовленные среды можно хранить при температуре четыре градуса Цельсия в течение месяца. Затем в 100-миллиметровой чашке для культивирования тканей, содержащей 0,1 миллиона сосудистых клеток в восьми миллилитрах приготовленной полной среды для культивирования эндотелия, и культивируют клетки при 37 градусах Цельсия и 5% углекислом газе до достижения 70% котекучесть.

Затем удалите питательную среду из чашки и дважды промойте клетки PBS, чтобы удалить неприкрепленные клетки и мусор. После удаления PBS добавьте в клетки три миллилитра 0,25% трипсина, содержащего 2,21 миллимоляра ЭДТА, и инкубируйте чашку при температуре 37 градусов Цельсия в течение одной минуты. Проверьте отслойку клеток под световым микроскопом при 40-кратном увеличении.

Нейтрализуйте трипсин семью миллилитрами полной эндотелиальной питательной среды и аккуратно смойте клетки с чашкой для культивирования. После сбора клеточной суспензии центрифугируйте в 15-миллилитровую пробирку при температуре 400G в течение 10 минут. После удаления надосадочной жидкости повторно суспендировать клетки в пяти миллилитрах полной среды для эндотелиальной культуры, затем подсчитать клетки с помощью гемоцитометра и перенести рассчитанный объем суспензии, содержащей 2 миллиона клеток, в стерильную пробирку объемом 1,5 миллилитров.

Гранулируйте клетки, центрифугируя суспензию при 400G в течение пяти минут, прежде чем удалить надосадочную жидкость. Теперь сосудистые клетки готовы к смешиванию с матричным гелем для анализа матричной гелевой пробки.