pHluorin2-PTS1, yapıyı yüksek kopyalı bir klonlama vektöründe sağlayan Twist Bioscience tarafından pLEW100v5'e klonlandı; pLEW100v5, Dr. George Cross'un hediyesiydi. T. brucei aldolase'ye karşı yetiştirilen antiserum, talep üzerine Clemson Üniversitesi'nden Dr. Meredith T. Morris'ten temin edilebilir. JCM ve KAC laboratuvarlarından yapılan çalışmalar, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden (R01AI156382) bir ödülle kısmen desteklenmiştir. SSP, NIH 3R01AI156382 tarafından desteklenmiştir.

Trypanosoma brucei'de Glikozomal pH için pHluorin2 Tabanlı Sensörün Geliştirilmesi

<ol>
	<li>Coley, A. F., Dodson, H. C., Morris, M. T., Morris, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycolysis+in+the+African+trypanosome:+Targeting+enzymes+and+their+subcellular+compartments+for+therapeutic+development.">Glycolysis in the African trypanosome: Targeting enzymes and their subcellular compartments for therapeutic development.</a> Molecular Biology International. 2011, 123702 (2011).</li><li>Mcconville, M. J., Saunders, E. C., Kloehn, J., Dagley, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leishmania+carbon+metabolism+in+the+macrophage+phagolysosome-+feast+or+famine.">Leishmania carbon metabolism in the macrophage phagolysosome- feast or famine.</a> F1000Res. 4, 938 (2015).</li><li>Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosomes:+Parasites+and+the+divergence+of+peroxisomal+purpose.">Glycosomes: Parasites and the divergence of peroxisomal purpose.</a> Molecular Microbiology. 53 (3), 717-724 (2004).</li><li>Parsons, M., Furuya, T., Pal, S., Kessler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+function+of+peroxisomes+and+glycosomes.">Biogenesis and function of peroxisomes and glycosomes.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 115 (1), 19-28 (2001).</li><li>Haanstra, J. R., Gonzalez-Marcano, E. B., Gualdron-Lopez, M., Michels, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis,+maintenance+and+dynamics+of+glycosomes+in+trypanosomatid+parasites.">Biogenesis, maintenance and dynamics of glycosomes in trypanosomatid parasites.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1863 (5), 1038-1048 (2016).</li><li>Allmann, S., Bringaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosomes:+A+comprehensive+view+of+their+metabolic+roles+in+t.+Brucei.">Glycosomes: A comprehensive view of their metabolic roles in t. Brucei.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 85, 85-90 (2017).</li><li>Dodson, H. C., Morris, M. T., Morris, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycerol+3-phosphate+alters+Trypanosoma+brucei+hexokinase+activity+in+response+to+environmental+change.">Glycerol 3-phosphate alters Trypanosoma brucei hexokinase activity in response to environmental change.</a> The Journal of Biological Chemistry. 286 (38), 33150-33157 (2011).</li><li>Lin, S., Morris, M. T., Ackroyd, P. C., Morris, J. C., Christensen, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+targeted+delivery+of+pH+sensor+for+quantitative+measurements+of+intraglycosomal+pH+in+live+Trypanosoma+brucei.">Peptide targeted delivery of pH sensor for quantitative measurements of intraglycosomal pH in live Trypanosoma brucei.</a> Biochemistry. 52 (21), 3629-3637 (2013).</li><li>Mahon, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phluorin2:+An+enhanced,+ratiometric,+pH-sensitive+green+florescent+protein.">Phluorin2: An enhanced, ratiometric, pH-sensitive green florescent protein.</a> Advances in Bioscience and Biotechnology. 2 (3), 132-137 (2011).</li><li>Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tightly+regulated+inducible+expression+system+for+conditional+gene+knock-outs+and+dominant-negative+genetics+in+Trypanosoma+brucei.">A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 99 (1), 89-101 (1999).</li><li>. Restriction digest v.2 Available from: <a target="_blank" href="https://www.protocols.io/view/restriction-digest-nkqdg33pg25z/v2">https://www.protocols.io/view/restriction-digest-nkqdg33pg25z/v2</a> (2018)</li><li>. Ligation protocol with t4 DNA ligaase (m0202) v.3 Available from: <a target="_blank" href="https://www.protocols.io/view/ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202-95qpvorzv4o1/v3">https://www.protocols.io/view/ligation-protocol-with-t4-dna-ligase-m0202-95qpvorzv4o1/v3</a> (2021)</li><li>Burkard, G., Fragoso, C. M., Roditi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+stable+transformation+of+bloodstream+forms+of+Trypanosoma+brucei.">Highly efficient stable transformation of bloodstream forms of Trypanosoma brucei.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 153 (2), 220-223 (2007).</li><li>Crowe, L. P., Wilkinson, C. L., Nicholson, K. R., Morris, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypanosoma+brucei+pex13.2+is+an+accessory+peroxin+that+functions+in+the+import+of+peroxisome+targeting+sequence+type+2+proteins+and+localizes+to+subdomains+of+the+glycosome.">Trypanosoma brucei pex13.2 is an accessory peroxin that functions in the import of peroxisome targeting sequence type 2 proteins and localizes to subdomains of the glycosome.</a> mSphere. 5 (1), e00744 (2020).</li><li>Kucejova, B., Kucej, M., Petrezselyova, S., Abelovska, L., Tomaska, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+screen+for+nigericin-resistant+yeast+mutants+revealed+genes+controlling+mitochondrial+volume+and+mitochondrial+cation+homeostasis.">A screen for nigericin-resistant yeast mutants revealed genes controlling mitochondrial volume and mitochondrial cation homeostasis.</a> Genetics. 171 (2), 517-526 (2005).</li><li>Huynh, M. H., Carruthers, V. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxoplasma+gondii+excretion+of+glycolytic+products+is+associated+with+acidification+of+the+parasitophorous+vacuole+during+parasite+egress.">Toxoplasma gondii excretion of glycolytic products is associated with acidification of the parasitophorous vacuole during parasite egress.</a> PLoS Pathogens. 18 (5), e1010139 (2022).</li><li>Lehoux, S., Abe, J., Florian, J. A., Berk, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=14-3-3+binding+to+Na+/H++exchanger+isoform-1+is+associated+with+serum-dependent+activation+of+Na+/H++exchange.">14-3-3 binding to Na+/H+ exchanger isoform-1 is associated with serum-dependent activation of Na+/H+ exchange.</a> TheJournal of Biological Chemistry. 276 (19), 15794-15800 (2001).</li><li>Jankowski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+measurements+of+the+ph+of+mammalian+peroxisomes+using+the+fluorescent+protein+phluorin.">In situ measurements of the ph of mammalian peroxisomes using the fluorescent protein phluorin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (52), 48748-48753 (2001).</li><li>Jankowski, A., Grinstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+noninvasive+fluorimetric+procedure+for+measurement+of+membrane+potential.+Quantification+of+the+NADPH+oxidase-induced+depolarization+in+activated+neutrophils.">A noninvasive fluorimetric procedure for measurement of membrane potential. Quantification of the NADPH oxidase-induced depolarization in activated neutrophils.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (37), 26098-26104 (1999).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+statistical+parameter+for+use+in+evaluation+and+validation+of+high+throughput+screening+assays.">A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays.</a> Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li><li>Lin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ph+regulation+in+glycosomes+of+procyclic+form+Trypanosoma+brucei.">Ph regulation in glycosomes of procyclic form Trypanosoma brucei.</a> The Journal of Biological Chemistry. 292 (19), 7795-7805 (2017).</li><li>Ha, D. S., Schwarz, J. K., Turco, S. J., Beverley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+green+fluorescent+protein+as+a+marker+in+transfected+Leishmania.">Use of the green fluorescent protein as a marker in transfected Leishmania.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 77 (1), 57-64 (1996).</li><li>Kelly, J. M., Ward, H. M., Miles, M. A., Kendall, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+shuttle+vector+which+facilitates+the+expression+of+transfected+genes+in+Trypanosoma+cruzi+and+Leishmania.">A shuttle vector which facilitates the expression of transfected genes in Trypanosoma cruzi and Leishmania.</a> Nucleic Acids Research. 20 (15), 3963-3969 (1992).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.

Afrika tripanozomundaki çevresel algı ve tepki mekanizmaları tam olarak anlaşılamamıştır. Besin mevcudiyetindeki değişikliklerin, glikozomların asitlenmesi de dahil olmak üzere parazitte çeşitli tepkileri tetiklediği bilinmektedir. Burada, kalıtsal bir protein sensörü, pHluorin2 ve akış sitometrisi kullanarak canlı hücrelerdeki çevresel bozulmalara glikozomal pH tepkisini incelemek için bir yöntem tanımladık.
Sensörün kullanımında birkaç kritik adım vardır. İ...

Parazitik kinetoplastidler, çoğu canlı organizma gibi, merkezi karbon metabolizmasının temel bir bileşeni olarak glikoza güvenir. Bu grup, Afrika tripanozomu, Trypanosoma brucei gibi tıbbi açıdan önemli organizmaları içerir;Amerikan tripanozomu, T. cruzi; ve Leishmania cinsinin parazitleri. Glikoz metabolizması, patojenik yaşam döngüsü aşamalarında parazit büyümesi için kritik öneme sahiptir. Örneğin, glikozdan yoksun bırakıldığında, Afrika tripanozomunun kan dolaşımı formu (BSF) hızla ölür. Özellikle, glikoliz, enfeksiyonun bu aşamasında ATP'nin tek kaynağı olarak hizmet eder1. Leishmania parazitleri de aynı şekilde insan konakçıdaki glikoza bağımlıdır, konakçı makrofajlarda bulunan amastigot yaşam döngüsü aşaması büyüme için bu karbon kaynağına bağımlıdır2.
Bu parazitler, farklı böcek vektörlerini içeren farklı yaşam tarzlarına sahip olsalar da, glikoza nasıl tepki verdikleri ve tükettikleri konusunda birçok ortak noktayı paylaşırlar. Örneğin, bu parazitler çoğu glikolitik enzimi glikozom adı verilen modifiye peroksizomlara lokalize eder. Bu kinetoplastide spesifik organel, korunmuş biyosentetik mekanizmalara vemorfolojiye dayalı memeli peroksizomları ile ilişkilidir 3,4,5,6.
Glikolitik yol enzimlerinin çoğunun glikozoma bölümlendirilmesi, yolun düzenlenmesi için parazite özgü araçlar sunar. Kimyasal bir pH probu kullanarak, besin yoksunluğunun, anahtar glikolitik enzim hekzokinaz 7,8 üzerindeki bir allosterik düzenleyici bağlanma bölgesine maruz kalma yoluyla glikolitik enzim aktivitesinin değişmesine neden olan prosiklik form (PF) parazit glikozomlarının hızlı bir asitlenmesini tetiklediğini belirledik. Önceki çalışmamızda, kimyasal probun kullanım için sürekli teslimat gerektirmesi ve diğer uygulamalardaki faydasını sınırlaması gerekiyordu. Ek olarak, BSF'deki glikozomdaki prob dağılımını sürdürme zorlukları, bu yaşam evresinde glikozomal pH'ı araştırma yaklaşımının faydasını sınırladı.
Bu çalışmada, glikoz açlığı9 dahil olmak üzere çevresel ipuçlarına yanıt olarak BSF T. brucei'deki glikozomal pH değişimini izlemek için floresan protein biyosensörü pHluorin2'yi kullandık (Şekil 1). Bu çalışmadan elde edilen sonuçlar, BSF T. brucei'nin, PF parazitlerinde gözlemlediğimiz tepkilere benzer şekilde, açlığa yanıt olarak glikozomları geri dönüşümlü bir şekilde hızla asitleştirdiğini göstermektedir. Bu biyosensörün T. brucei ve ilgili parazitlerdeki glikolitik regülasyon anlayışımızı geliştireceğini umuyoruz.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>50 mL Tissue Culture Flasks (Non-treated, sterile)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10861-572</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>75 cm2 Tissue Culture Flask (Non-Treated, sterile)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431464U</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 &#181;L flat-bottom 384-well plate</td>
			<td>BrandTech&#160;</td>
			<td>781620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa Human T Cell Nucleofector&#160; Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>VPA-1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attune NxT Flow Cytometer</td>
			<td>invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A24858</td>
			<td>FlowJo software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BRANDplates 96-Well, flat bottom plate</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>BR781662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coloc 2 plugin of ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>https://imagej.net/plugins/coloc-2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytKick Max Auto Sampler</td>
			<td>invitrogen by Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A42973</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CytoFLEX Flow Cytometer</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electron Microscopy Sciences 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade, 10 mL Ampoule</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-980-487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>statistical software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nigericin (sodium salt)</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>11437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleofector 2b</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>Discontinued Product</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OP2 Liquid Handler</td>
			<td>opentrons</td>
			<td>OP2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>poly-L-lysine, 0.1% (w/v) in H2O</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>CAS:25988-63-0</td>
			<td>Pipetting robot for HTS assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiazole Red (TO-PRO-3)</td>
			<td>biotium</td>
			<td>#40087</td>
			<td>We machined a custom acrylic plate stand so this brand of plate could be detected and used on our CytKick Max Auto Sampler</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>valinomycin</td>
			<td>Cayman Chemical</td>
			<td>10009152</td>
			<td>Pipetting robot for HTS assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>For pH calibration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>&#160;&#160;</td>
			<td>For pH calibration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring dynamic glycosomal ph changes in living trypanosoma brucei

Glikoz metabolizması, Afrika tripanozomu, Trypanosoma brucei, temel bir metabolik süreç ve parazit gelişiminin düzenleyicisi olarak kritik öneme sahiptir. Çevresel glikoz seviyeleri değiştiğinde oluşan hücresel tepkiler hakkında çok az şey bilinmektedir. Hem kan dolaşımında hem de prosiklik formda (böcek evresi) parazitlerde, glikozomlar glikolizin çoğunu barındırır. Bu organeller, glikoz yoksunluğuna yanıt olarak hızla asitleştirilir, bu da muhtemelen hekzokinaz gibi glikolitik enzimlerin allosterik regülasyonuna neden olur. Önceki çalışmalarda, pH ölçümleri yapmak için kullanılan kimyasal probun lokalizasyonu zordu ve diğer uygulamalardaki kullanımını sınırlıyordu.
Bu makale, kalıtsal bir protein pH biyosensörü olan glikozomal olarak lokalize pHluorin2'yi eksprese eden parazitlerin gelişimini ve kullanımını açıklamaktadır. pHluorin2, 395 nm'de uyarmada pH'a (asit) bağlı bir azalma gösteren ve aynı anda 475 nm'de uyarmada bir artış sağlayan bir oransal pHluorin varyantıdır. Transgenik parazitler, pHluorin2 açık okuma çerçevesinin tripanozom ekspresyon vektörü pLEW100v5'e klonlanmasıyla üretildi ve her iki yaşam döngüsü aşamasında da indüklenebilir protein ekspresyonu sağlandı. pHluorin2 biyosensörünün glikozomal lokalizasyonunu doğrulamak için immünofloresan kullanıldı ve biyosensörün lokalizasyonunu glikozomal yerleşik protein aldolaz ile karşılaştırdı. Sensörün yanıt verme hızı, daha önce floresein bazlı bir pH sensörünü kalibre etmek için kullandığımız bir yaklaşım olan pH değeri 4 ile 8 arasında değişen bir dizi tamponda hücrelerin inkübe edilmesiyle farklı pH seviyelerinde kalibre edildi. Daha sonra glikozomal pH'ı belirlemek için akış sitometrisi kullanarak 405 nm ve 488 nm'de pHluorin2 floresansını ölçtük. PF parazitlerinde bilinen bir glikozomal asitleşme tetikleyicisi olan glikoz yoksunluğuna yanıt olarak zaman içinde pH'ı izleyerek canlı transgenik pHluorin2 eksprese eden parazitlerin performansını doğruladık. Bu araç, potansiyel olarak yüksek verimli ilaç taramasında kullanılmak da dahil olmak üzere bir dizi potansiyel uygulamaya sahiptir. Sensör, glikozomal pH'ın ötesinde, canlı hücre ortamındaki pH dinamiklerini anlamak için diğer organellere uyarlanabilir veya diğer tripanosomatidlerde kullanılabilir.

Parasitic kinetoplastids, like most living organisms, rely on glucose as a fundamental component of central carbon metabolism. This group includes medically important organisms, such as the African trypanosome, Trypanosoma brucei; the American trypanosome, T. cruzi; and parasites of the genus Leishmania. Glucose metabolism is critical to parasite growth in the pathogenic lifecycle stages. For example, when deprived of glucose, the bloodstream form (BSF) of the African trypanosome dies rapidly. Notably, glycolysis serves as the sole source of ATP during this stage of infection1. Leishmania&#160;parasites are likewise dependent on glucose in the human host, with the amastigote lifecycle stage that resides in host macrophages reliant on this carbon source for growth2.
While these parasites have distinct lifestyles involving different insect vectors, they share many commonalities in how they respond to and consume glucose. For example, these parasites localize most glycolytic enzymes into modified peroxisomes called glycosomes. This kinetoplastid-specific organelle is related to mammalian peroxisomes based on conserved biosynthetic mechanisms and morphology3,4,5,6.
The compartmentalization of most of the glycolytic pathway enzymes into the glycosome offers parasite-specific means of regulation of the pathway. Using a chemical pH probe, we established that nutrient deprivation triggers a rapid acidification of procyclic form (PF) parasite glycosomes that results in altered glycolytic enzyme activity through exposure of an allosteric regulator binding site on the key glycolytic enzyme hexokinase7,8. In our previous work, the chemical probe required constant delivery for use, limiting its utility in other applications. Additionally, challenges maintaining the probe distribution in the glycosome in the BSF limited the utility of the approach for investigating glycosomal pH in that life stage.
In this study, we have used the fluorescent protein biosensor pHluorin2 to monitor glycosomal pH change in BSF T. brucei in response to environmental cues including glucose starvation9 (Figure 1). Results from this work suggest that BSF T. brucei acidifies glycosomes rapidly in response to starvation in a reversible fashion, similar to responses we have observed in PF parasites. We expect this biosensor will improve our understanding of glycolytic regulation in T. brucei and related parasites.

Yazar Spotlight: pHluorin2 Biyosensörü Kullanılarak Trypanosoma brucei'de Glikozomal pH İzlemedeki Gelişmeler

Canlı Trypanosoma brucei'de Dinamik Glikozomal pH Değişikliklerinin Ölçülmesi

Glucose metabolism is critical for Trypanosoma brucei, yet little is known about how the cells sense and respond to changing glucose levels in the environment. We have developed parasites expressing a pH biosensor that allows us to monitor glycosomal pH in live parasites, which will aid in the understanding of parasites'dynamic responses to nutrient fluctuation. A challenge for this experiment would be the availability of a flow cytometer equipped with a microtiter plate reader, as well as the appropriate filter sets to measure biosensor fluorescence.Additionally, T.brucei is a risk group two organism, so the cytometer must be housed within a biosafety level two facility. It has been discovered that the pH level of glycosomes can affect glycolysis as hexokinase and phosphofructokinase are pH sensitive. However, the pH probes that were previously used did not accurately target to the glycosome in the bloodstream form.A better tool was needed to study the relationship between glycosomal pH and glycolysis in this parasite life stage. The pHluorin2-PTS1 sensor is a tool that is better at localizing to the glycosome than chemical pH probes in this life stage. It's user friendly, as you only need to induce expression of the pH sensor overnight, and the cells will make and localize pHluorin2 to the glycosome.Using flow cytometry to measure pHluorin2 increases throughput and improves statistical measurements compared to microscopy.

BSF T. brucei'de glikozomlara pHLuorin2-PTS1 lokalizasyonu pHluorin2-PTS1'in hücre altı lokalizasyonunu değerlendirmek için parazitler immünofloresan testlerine tabi tutuldu. Glikozomda yerleşik bir protein olan aldolaza (TbAldolaz) karşı yükselen anti-serumlarla birlikte lokalize olan transgenden gelen sinyal (Şekil 2A). Anti-TbAldolaz ve pHluorin2-PTS1 arasındaki ortalama Pearson korelasyon katsayısı 0.895 idi, bu da pHluorin2-PTS1'in öncelikle gl...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Advancements in Glycosomal pH Monitoring in Trypanosoma brucei Using pHluorin2 Biosensor at JoVE.com

PH'ın, Afrika tripanozomlarının kan dolaşımı formunun glikozomlarındaki çevresel ipuçlarına nasıl tepki verdiğini incelemek için bir yöntem açıklıyoruz. Bu yaklaşım, pH dinamiklerini ölçmek için akış sitometrisi ile birlikte pH'a duyarlı kalıtsal bir protein sensörünü hem zaman seyri tahlili olarak hem de yüksek verimli bir ekran formatında içerir.

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. ...

Glikoz metabolizması Trypanosoma brucei için kritik öneme sahiptir, ancak hücrelerin ortamdaki değişen glikoz seviyelerini nasıl algıladığı ve bunlara nasıl tepki verdiği hakkında çok az şey bilinmektedir. Canlı parazitlerde glikozomal pH'ı izlememize izin veren ve parazitlerin besin dalgalanmalarına dinamik tepkilerinin anlaşılmasına yardımcı olacak bir pH biyosensörünü ifade eden parazitler geliştirdik. Bu deney için bir zorluk, bir mikrotitre plaka okuyucu ile donatılmış bir akış sitometresinin yanı sıra biyosensör floresansını ölçmek için uygun filtre setlerinin mevcudiyeti olacaktır.Ek olarak, T.brucei bir risk grubu iki organizmadır, bu nedenle sitometre bir biyogüvenlik seviyesi iki tesisi içinde barındırılmalıdır. Hekzokinaz ve fosfofruktokinaz pH'a duyarlı olduğu için glikozomların pH seviyesinin glikolizi etkileyebileceği keşfedilmiştir. Bununla birlikte, daha önce kullanılan pH probları, kan dolaşımı formundaki glikozomu doğru bir şekilde hedeflemedi.Bu parazit yaşam evresinde glikozomal pH ve glikoliz arasındaki ilişkiyi incelemek için daha iyi bir araca ihtiyaç vardı. pHluorin2-PTS1 sensörü, bu yaşam evresinde kimyasal pH problarından ziyade glikozomun yerini belirlemede daha iyi olan bir araçtır. Kullanıcı dostudur, çünkü pH sensörünün ekspresyonunu yalnızca bir gecede indüklemeniz gerekir ve hücreler pHluorin2'yi glikozoma dönüştürür ve lokalize eder.pHluorin2'yi ölçmek için akış sitometrisinin kullanılması, mikroskoba kıyasla verimi artırır ve istatistiksel ölçümleri iyileştirir.

measuring-dynamic-glycosomal-ph-changes-in-living-trypanosoma-brucei

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Measuring Dynamic Glycosomal pH Changes in Living Trypanosoma brucei

335 Görüntüleme.  Brigham Young University. Glikoz metabolizması Trypanosoma brucei için kritik öneme sahiptir, ancak hücrelerin ortamdaki değişen glikoz seviyelerini nasıl algıladığı ve bunlara nasıl tepki verdiği hakkında çok az şey bilinmektedir. Canlı parazitlerde glikozomal pH'ı izlememize izin veren ve parazitlerin besin dalgalanmalarına dinamik tepkilerinin anlaşılmasına yardımcı olacak bir pH biyosensörünü ifade eden parazitler geliştirdik. Bu deney için bir zorluk, bir mikrotitre plaka okuyucu ile ...