Чтобы изолировать нейростволовые клетки или НСК из рассеченных нейронных субвентрикулярных зон или СВЗ, разрежьте каждую СВЗ на четыре-пять небольших частей, чтобы облегчить дезагрегацию ткани. С помощью стерильной пластиковой пастеровской пипетки переложите измельченные СВЗ в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров, следя за тем, чтобы в тарелке не осталось осколков. Дайте тканевым отложениям оседать на дне трубки перед удалением остатков DPBS.
Добавьте 500 микролитров фильтрованной ферментативной смеси для двух СВЗ на мозг и инкубируйте пробирку на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. После инкубации добавьте в каждый образец пять миллилитров контрольной среды, предварительно предупрежденной при 37 градусах Цельсия. Центрифугируйте образец при 300 G в течение пяти минут.
Осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью микропипетки или вакуумного насоса. С помощью отполированной огнем пастбищной стеклянной пипетки добавьте в гранулу один миллилитр контрольной среды. Тщательно механически дезагрегируйте гранулу пипетированием вверх и вниз от 10 до 20 раз до получения однородной клеточной суспензии.
Затем добавьте четыре миллилитра контрольной среды, и перемешайте методом инверсии, чтобы промыть клетки. После центрифугирования при 300 G в течение пяти минут равномерно повторно суспендируйте полученную гранулу в одном миллилитре готовой среды путем пипетирования вверх и вниз 10 раз. Разбавив одну часть аликвоты клеточной суспензии одной частью трипанового синего, подсчитайте клетки с помощью нейбауэровой камеры под микроскопом.
Обеспечьте клеточную дезагрегацию на уровне отдельных клеток перед равномерным затравливанием клеток в восьми лунках 48-луночного планшета в конечном объеме 500 микролитров полной среды. Инкубируйте клетки в течение пяти-семи дней, чтобы дать сформироваться первичным нейросферам.