Выделение и посев нейральных стволовых клеток (НСК), полученных из субвентрикулярной зоны мышей, для формирования нейросферы

Чтобы изолировать нейростволовые клетки или НСК из рассеченных нейронных субвентрикулярных зон или СВЗ, разрежьте каждую СВЗ на четыре-пять небольших частей, чтобы облегчить дезагрегацию ткани. С помощью стерильной пластиковой пастеровской пипетки переложите измельченные СВЗ в центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров, следя за тем, чтобы в тарелке не осталось осколков. Дайте тканевым отложениям оседать на дне трубки перед удалением остатков DPBS.

Добавьте 500 микролитров фильтрованной ферментативной смеси для двух СВЗ на мозг и инкубируйте пробирку на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. После инкубации добавьте в каждый образец пять миллилитров контрольной среды, предварительно предупрежденной при 37 градусах Цельсия. Центрифугируйте образец при 300 G в течение пяти минут.

Осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью микропипетки или вакуумного насоса. С помощью отполированной огнем пастбищной стеклянной пипетки добавьте в гранулу один миллилитр контрольной среды. Тщательно механически дезагрегируйте гранулу пипетированием вверх и вниз от 10 до 20 раз до получения однородной клеточной суспензии.

Затем добавьте четыре миллилитра контрольной среды, и перемешайте методом инверсии, чтобы промыть клетки. После центрифугирования при 300 G в течение пяти минут равномерно повторно суспендируйте полученную гранулу в одном миллилитре готовой среды путем пипетирования вверх и вниз 10 раз. Разбавив одну часть аликвоты клеточной суспензии одной частью трипанового синего, подсчитайте клетки с помощью нейбауэровой камеры под микроскопом.

Обеспечьте клеточную дезагрегацию на уровне отдельных клеток перед равномерным затравливанием клеток в восьми лунках 48-луночного планшета в конечном объеме 500 микролитров полной среды. Инкубируйте клетки в течение пяти-семи дней, чтобы дать сформироваться первичным нейросферам.