Для начала возьмите стеклянную посуду с плотно прилегающей крышкой. Положите в посуду ватный тампон. Под вытяжной шкаф добавьте в ватный тампон от трех до пяти миллилитров этилового эфира.
Сразу же накройте блюдо крышкой. С помощью кисти подцепите личинок третьего возраста дрозофилы из флаконов с мухами. Пересадите одну личинку в небольшую открытую емкость.
Поместите емкость в стеклянную посуду с этиловым эфиром, и сразу же плотно закройте посуду. Используйте диссекционный микроскоп, чтобы проверять личинку на подвижность каждые 30 секунд. Перенесите личинку под наркозом на предметное стекло микроскопа.
Погрузите личинки в каплю солевого раствора насекомых. Под микроскопом вскрытия. Удалите большую часть физиологического раствора бумажной салфеткой.
Расположите личинку дорсальной стороной вверх для абляции гигантскими волокнами или вентральной стороной вверх для абляции TTMn. Затем медленно опустите стеклянную крышку на личинку. Добавьте солевой раствор на боковую сторону крышки.
Заполнить пространство между предметным стеклом и защитным стеклоподъемником. Для абляции гигантских волокон проверьте положение мозга под большим увеличением на диссекционном микроскопе. Убедитесь, что мозг лежит ровно и виден через кутикулу.
Чтобы сместить жировую ткань, покрывающую мозг, с помощью щипцов слегка надавите на покровную резинку и перемещайте ее из стороны в сторону. Поместите образец на столик для многофотонного микроскопа. Используйте фильтр GFP, чтобы найти образец в эпифлуоресцентном режиме.
Для абляции гигантским волокном сосредоточьтесь на интересующих клетках, затем переключитесь в двухфотонный режим. Установите лазер на 870 нанометров и отрегулируйте усиление детектора для просмотра экспрессирующих GFP клеток с помощью сканера Galvano, определите область для абляции с помощью круговой области интереса. Далее приступаем к настройке протокола абляции в программном обеспечении, для этого последовательно устанавливаем один кадр захвата, стимуляции, за которым следует еще один кадр захвата.
Запустите мощность лазера стимуляции с более низкого значения и запустите протокол стимуляции. Если абляция не увенчалась успехом и только элемент отбеливается, увеличьте мощность лазера с шагом 5% или количество петель по одной, и запустите протокол снова. Делайте это до тех пор, пока не будет замечена успешная клеточная абляция.
После успешной абляции ячейки снимите крышку. С помощью кисти аккуратно поднимите личинок с предметного стекла, затем переложите личинок в пищевой флакон. В образцах абляции гигантских волокон.
Абляция была подтверждена по отсутствию помеченной GFP сомы на абляционной стороне мозга. Для ТТМн абляются личинки. Отсутствие ТТМн с одной стороны было легко распознано из-за отсутствующих сомы и дендритов.
